CMG解旋酶解旋DNA的单分子实时可视化观察

在我们的实验室中，我们正在研究真核生物DNA复制的分子机制。我们希望在单分子水平上理解基因组复制的动力学过程。我们采用多种系统来观察DNA复制，包括纯化的蛋白质以及从非洲爪蟾卵中提取的提取物。

我们对DNA复制的许多了解都来自于群体实验、细胞成像和结构生物学。这些方法非常强大，但通常在揭示单个蛋白质的动力学或瞬时行为方面存在局限性。这正是单分子技术特别适用于此类研究的原因，也是该技术在该领域应用日益广泛的原因。

我们关于DNA解旋实时可视化的方法概述了一个可扩展和修改的平台，可用于研究DNA复制的不同方面。该方法有助于更好地理解在特定核糖体组分和复制应激存在条件下CMG活性的分子机制。为了阐明DNA复制过程中复杂的系统，我们分离关键蛋白质，并在体外观察其实时行为。

我们获得的见解有助于更全面地了解DNA复制过程。准备流动池时，将生物素-PEG盖玻片切成两半。通过蚀刻并将载玻片折断，制备小块玻璃，大小约为2.4厘米 × 1厘米。

使用直径为0.8毫米的金刚石镀层钻头，在玻璃片上钻两个相距1.4毫米的孔。通过插入进样或出样管路测试孔的通畅性。将双面胶带裁剪成与玻璃片相同的形状。

将玻片在胶带上对齐，用针穿过每个孔以在胶带上标记其位置。使用剃刀刀片切割出一个包含两个孔的通道。用丙酮清洁玻璃片。

用纸巾将玻璃片擦干，并将其放置在干净的表面上。然后揭下双面胶带的一侧，将其粘贴到玻璃片上，确保两个孔完全位于通道内。使用P1000移液器吸头，用力按压胶带，使胶带与玻璃片密封牢固。

将胶带的第二层从两块玻璃上剥离。将载玻片放置在干净的表面上，使粘性面朝上。使用塑料镊子夹住半生物素化PEG盖玻片的边缘，将PEG功能化的一面轻轻放下，贴附到粘合剂上。

用手指按压盖玻片以固定其位置。使用移液器吸头以适中压力擦拭盖玻片表面，去除气泡。然后将流动池翻转过来。

对于每个流式池，剪取约10厘米的聚乙烯20和60管。将管子末端以小于45度的角度斜切，并将管子插入载玻片的孔中。如果孔径合适，管子可自行直立于孔内。

充分混合环氧树脂组分。使用P200移液器吸头在每段玻璃管的管路周围点涂环氧树脂。让环氧树脂固化30至60分钟。

首先，在工作平台上准备好新配制的经滤膜除菌的封闭缓冲液、10倍反应缓冲液一和缓冲液二。将装有2.5毫升封闭缓冲液和5毫升超纯水的敞口试管放入真空干燥器中，在真空条件下脱气。15分钟后，释放真空，取出试管。

将制备好的生物素-PEG 流通池组件放置在显微镜载物台上，并用粘性橡皮泥在两端固定。通过针头将流通池出口管路连接至注射泵。开启物镜加热器，设置温度为 30 摄氏度。

在靠近流路池的另一块黏性橡皮附近，用离心管盛装一到两毫升脱气水。将进样管插入管中直至底部，使水流通过通道。提高流速以去除进样管附近滞留的任何气泡。

向20微升浓度为1毫克/毫升的链霉亲和素样品中加入100微升脱气封闭缓冲液。将开口管固定在黏性橡皮泥上。将进样管从水中转移至链霉亲和素溶液中，并以每分钟40微升的流速运行2分钟。

五分钟后，用封闭缓冲液洗去多余的链霉亲和素。将溶于含有25纳摩尔SYTOX Orange的封闭缓冲液中的生物素化DNA流过表面。使用532纳米激光在实时成像模式下观察DNA与表面的连接过程。

当表面达到所需的DNA密度后，流入含有25纳摩尔SYTOX的封闭缓冲液，以洗去游离的DNA。接着，流入用含有25纳摩尔SYTOX Orange的封闭缓冲液稀释的生物素化抗地高辛抗体。再用封闭缓冲液洗去生物素化抗地高辛抗体和SYTOX Orange。

将50微升ATP-γ-S混合液注入流动池中。在30微升ATP-γ-S混合液中加入纯化的CMG解旋酶，使其终浓度约为100纳摩尔，以每分钟20微升的速度注入20微升。孵育15分钟。

接下来，以每分钟40微升的流速注入ATP RPA混合液，总体积为80微升。使用50至100毫秒的曝光时间，通过488纳米激光观察并采集eGFP-RPA信号，然后使用640纳米激光采集CMG信号。

最后，使用532纳米激光对SYTOX Orange染色的DNA进行成像和采集。通过随时间推移黄色RPA信号区域的线性增长，可观察到CMG解旋酶对DNA的解旋过程，该现象表明DNA双链已被解开。单链DNA损伤会减少成功解旋事件的数量，这体现在实验数据中完成的轨迹信号减少。