Name: 通过 CMG 解旋酶对 DNA 解旋进行单分子实时可视化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: 学习使用单分子TIRF显微镜技术实时可视化CMG解旋酶对DNA的解旋过程。该方法利用荧光标记和微流控芯片研究真核生物DNA复制的分子机制，为理解基因组复制动态提供重要平台。

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感谢Gheorghe Chistol提供pGC261质粒，以及弗朗西斯·克里克研究所化学生物学平台提供的多肽合成与标记服务。本工作由弗朗西斯·克里克研究所资助，该研究所的核心资金来自英国癌症研究中心、英国医学研究理事会和惠康基金会（CC2133）。

CMG-Mediated DNA Unwinding Observed by ssDNA-RPA Tract Growth

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<li>Costa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+for+MCM2-7+helicase+activation+by+GINS+and+Cdc45%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The structural basis for MCM2-7 helicase activation by GINS and Cdc45.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (4), 471-477 (2011).</li>
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<li>Moyer, S. E., Lewis, P. W., Botchan, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+the+Cdc45%2FMcm2-7%2FGINS+%28CMG%29+complex%2C+a+candidate+for+the+eukaryotic+DNA+replication+fork+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation of the Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) complex, a candidate for the eukaryotic DNA replication fork helicase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (27), 10236-10241 (2006).</li>
<li>Douglas, M. E., Ali, F. A., Costa, A., Diffley, J. F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+eukaryotic+CMG+helicase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mechanism of eukaryotic CMG helicase activation.</a> Nature. 555 (7695), 265-268 (2018).</li>
<li>Ilves, I., Petojevic, T., Pesavento, J. J., Botchan, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+MCM2-7+helicase+by+association+with+Cdc45+and+GINS+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of the MCM2-7 helicase by association with Cdc45 and GINS proteins.</a> Mol Cell. 37 (2), 247-258 (2010).</li>
<li>Dewar, J. M., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+DNA+replication+termination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of DNA replication termination.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (8), 507-516 (2017).</li>
<li>Burnham, D. R., Kose, H. B., Hoyle, R. B., Yardimci, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+DNA+unwinding+by+the+eukaryotic+replicative+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The mechanism of DNA unwinding by the eukaryotic replicative helicase.</a> Nat Commun. 10 (1), 2159(2019).</li>
<li>Kose, H. B., Larsen, N. B., Duxin, J. P., Yardimci, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+eukaryotic+replicative+helicase+at+lagging-strand+protein+barriers+support+the+steric+exclusion+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the eukaryotic replicative helicase at lagging-strand protein barriers support the steric exclusion model.</a> Cell Rep. 26 (8), 2113-2125.e6 (2019).</li>
<li>Kose, H. B., Xie, S., Cameron, G., Strycharska, M. S., Yardimci, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplex+DNA+engagement+and+RPA+oppositely+regulate+the+DNA-unwinding+rate+of+CMG+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Duplex DNA engagement and RPA oppositely regulate the DNA-unwinding rate of CMG helicase.</a> Nat Commun. 11 (1), 3713(2020).</li>
<li>Tanner, N. A., Van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+DNA+replication+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Visualizing DNA replication at the single-molecule level.</a> Methods Enzymol. 475, 259-278 (2010).</li>
<li>Swoboda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+oxygen+scavenging+for+photostability+without+ph+drop+in+single-molecule+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments.</a> ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).</li>
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<li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunability+of+DNA+polymerase+stability+during+eukaryotic+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Tunability of DNA polymerase stability during eukaryotic DNA replication.</a> Mol Cell. 77 (1), 17-25.e5 (2020).</li>
<li>Li, Z., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+of+the+mini-chromosome+maintenance+proteins+in+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications of the mini-chromosome maintenance proteins in DNA replication.</a> Genes. 10 (5), 331(2019).</li>
<li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+replication+origin+melting+nucleated+by+CMG+helicase+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of replication origin melting nucleated by CMG helicase assembly.</a> Nature. 606 (7916), 1007-1014 (2022).</li>
<li>Zeman, M. K., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+replication+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of replication stress.</a> Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).</li>
<li>Sparks, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CMG+helicase+bypasses+DNA-protein+cross-links+to+facilitate+their+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The CMG helicase bypasses DNA-protein cross-links to facilitate their repair.</a> Cell. 176 (1-2), 167-181.e21 (2019).</li>
<li>Taylor, M. R. G., Yeeles, J. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+initial+response+of+a+eukaryotic+replisome+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The initial response of a eukaryotic replisome to DNA damage.</a> Mol Cell. 70 (6), 1067-1080.e12 (2018).</li>
<li>Amunugama, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+reversal+during+DNA+interstrand+crosslink+repair+requires+CMG+unloading%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Replication fork reversal during DNA interstrand crosslink repair requires CMG unloading.</a> Cell Rep. 23 (12), 3419-3428 (2018).</li>
<li>Wu, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRAIP+is+a+master+regulator+of+DNA+interstrand+crosslink+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRAIP is a master regulator of DNA interstrand crosslink repair.</a> Nature. 567 (7747), 267-272 (2019).</li>
<li>Vrtis, K. B., Dewar, J. M., Chistol, G., Wu, R. A., Graham, T. G. W., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-strand+DNA+breaks+cause+replisome+disassembly%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-strand DNA breaks cause replisome disassembly.</a> Mol Cell. 81 (6), 1309-1318.e6 (2021).</li>
</ol>

作者不存在竞争性财务利益或其他利益冲突。

该实验提供了一个平台，可用于观察和研究单个CMG复合物在孤立状态以及在特定附加因子存在条件下的实时动态。然而，与许多单分子荧光技术一样，该方法也存在一些常见挑战，通常需要通过优化来克服。这些问题通常涉及长时间成像过程中荧光染料的稳定性（光漂白、亮度）、DNA底物的制备（DNA损伤）、流动池表面的质量（背景噪声、非特异性相互作用），或纯化蛋白样品的质量（核酸酶污染、标记效率）。
每种荧光染料在光稳定性和亮度上各不相同，因此选择合适的分子至关重要。在对荧光标记的寡聚蛋白（如RPA）进行成像时，由于多个荧光染料在相近位置被激发，可产生可见信号，因此可使用较低的激光功率。而对于单个荧光染料的成像（例如，在单一亚基上标记的CMG），则需要较高的激光功率才能清晰观察到荧光信号。通过减少激光照射时间（例如降低图像采集频率）可延长荧光染料的寿命。此外，激发荧光染料会产生活性氧（ROS），从而导致光漂白。在成像缓冲液中加入除氧系统可通过清除ROS来延长荧光染料的寿命。然而，某些除氧系统可能会影响pH12。
关于DNA底物的制备，关键在于尽量减少DNA损伤，例如切口或单链缺口。过度的损伤会阻碍DNA的充分解链，从而限制可收集的数据量。损伤可能来源于机械剪切、过度加热、核酸酶污染，或成像过程中产生的活性氧（ROS）。为减少剪切，应小心操作DNA样品，使用宽口吸头进行移液、缓慢移液，并&#160;避免甩动样品。为减轻ROS的影响，可通过减少激光照射时间，或在成像缓冲液中添加除氧系统来实现。在DNA底物制备完成后，可在进行解链反应前使用商业化的DNA修复试剂盒对损伤进行修复。
DNA解旋的效率还取决于CMG的纯度和活性。建议在每一步纯化后通过SDS-PAGE电泳评估样品纯度，以确定需要优化的环节。如果在最后一步仍观察到过多杂质，可尝试调整CaptoHiRes Q (5/50)柱洗脱时所用的盐梯度体积。此外，必须彻底去除蛋白标记过程中过量的荧光肽，因其可能在盖玻片表面产生不良背景信号。避免核酸酶污染也至关重要，否则会导致DNA底物降解。实验结束后，可用SYTOX Orange对残留的DNA进行染色，以检测DNA是否发生显著降解。实验过程中一定程度的DNA损伤难以避免，但严重的损伤通常提示存在明显的核酸酶污染问题。
该检测方法本身受限于衍射极限光斑的分辨率，要求荧光蛋白之间相隔数百个碱基对（甚至更远），才能被区分为独立的信号点。这限制了对CMG进程及其相互作用细节的观察精度。
每次分析所观察到的解旋事件数量各不相同。对于一次成功的实验，我们期望在每个512×512像素的视野中（像素大小 = 154.6 nm）至少看到数条长度足够的RPA区段。同一次实验中可采集多个视野，以便在需要时获得更多数据。这些区段无需长度一致，也不必延伸至DNA末端才具有分析价值。例如，可通过在添加CMG之前测量SYTOX染色DNA的长度，来确定每次实验的平均拴系距离。只要解旋量足以使复制叉发生明显移动，即可利用该距离将“移动的微米数（µm traveled）”转换为“解旋的千碱基对数（kb unwound）”，从而估算任意RPA区段所对应的DNA解旋量。
CMG 在多种 DNA 底物上均表现出解旋活性，但必须在至少 30 个核苷酸长度的 polyT 突出端上提供一个游离的 3' DNA 末端，以容纳 CMG 的结合足迹10。在复制叉处引入多个生物素基团可确保牢固的表面锚定。其余的 DNA 底物可根据需要进行多种设计，例如包含不同的 DNA 序列、长度和化学修饰。通过使用不同浓度的乙酸镁可改变 DNA 的构象。在较高浓度（≥10 mM）乙酸镁条件下，RPA 包被的单链 DNA 纤维会发生压缩，导致在解旋过程中 RPA 的结合将 DNA 拉紧。这一特性具有实用价值，因为它可防止 DNA 过度移动，从而更准确地测量 CMG 的位置及解旋进程。而在较低浓度（约 3 mM）乙酸镁条件下，RPA-ssDNA 保持松弛状态。
所述的单分子检测方法提供了一个可扩展和改造的平台，用于进一步研究DNA复制的各个方面。在DNA复制过程中，CMG作为复制体及其组分组装的核心。因此，可以在该检测体系中加入其他纯化的蛋白质，包括TIMELESS、TIPIN和CLASPIN等辅助因子，以研究它们对CMG动态行为的影响。已有研究表明这些蛋白质会影响复制叉的移动速率13，但它们如何影响CMG解旋速率尚不清楚。因此，利用该检测方法研究不同复制体蛋白对CMG的影响将具有重要意义。如先前在酵母蛋白研究中所述14，加入DNA聚合酶可能有助于更深入地理解除DNA解旋之外的DNA复制过程。此外，纯化经过修饰的CMG有助于更好地理解特定突变或翻译后修饰如何影响解旋酶活性15,16。另外，设计不同的DNA底物可使CMG介导的DNA解旋在多种模拟复制应激的条件下进行研究17。这些修饰包括DNA障碍物9,18、链间交联19,20,21以及DNA链中的断裂或不连续结构22。

DNA复制受到严格调控，因为细胞必须准确复制其基因组，以防止发生突变、疾病或死亡。真核生物的DNA复制由复制体复合物（replisome complex）执行，该复合物解开亲本DNA，并以单链DNA（ssDNA）为模板合成新的DNA链。在G1期，MCM2-7的催化失活双六聚体被加载到复制起点的双链DNA（dsDNA）上1在S期，MCM2-7复合物通过与CDC45和GINS结合而被激活2 形成由11个亚基组成的CMG复合物（CDC45、MCM2-7、GINS）。每个CMG复合物向相反方向启动DNA解旋，构成复制体组装的核心单元3.
二十年前，CMG解旋酶首次被鉴定为一个由11个亚基组成的复合物，是DNA复制所必需的4。自那时以来，我们对CMG的理解已取得显著进展，涵盖了其加载与激活5,6，以及DNA解链和终止过程7。传统的生物化学和结构生物学技术在这些发现中起到了关键作用；然而，这些方法在研究CMG更动态的特性方面往往存在局限性。单分子技术通过物理操控单个生物大分子，逐个分子地测量或观察其活性，可用于揭示其他技术常常遗漏或无法检测到的蛋白质实时动态行为8,9。
本文介绍了一种全内反射荧光（TIRF）显微镜检测方法，用于实时观察CMG解旋酶对DNA的解链过程。将纯化的、荧光标记的CMG加载到含有预制DNA叉结构的长链DNA的游离3'末端。在微流控流动池中，通过依次将线性DNA的两端固定在生物素-PEG包被的盖玻片表面，使DNA被拉直。该方法可实现更均匀的DNA固定，显著减少了数据分析时需要考虑的变异因素。在ATP-γ-S存在下，CMG结合到DNA叉3'末端的单链DNA上。ATP-γ-S是一种水解缓慢的ATP类似物，可允许CMG结合DNA但不启动解链。随后加入ATP以及纯化的荧光标记RPA，可激活CMG并启动广泛的DNA解链。从视觉上可见，CMG沿DNA移动，其后留下不断延伸的RPA结合的单链DNA区域。未固定的DNA末端随CMG一起移动，由于RPA结合引起的压缩作用，形成一个&#34;紧密球状结构&#34;。流动池的设计允许在解链过程中的任意时刻更换缓冲液，从而在实验过程中实现高度的控制性。
本方案分为四个可独立进行的方法。第1节描述了用于单分子实验的20 kb线性分叉DNA底物的制备。第2节概述了黑腹果蝇CMG（Drosophila melanogaster CMG，DmCMG）的纯化及荧光标记，相关DmCMG表达的关键信息包含在注释部分。第3节介绍了可在全内反射荧光（TIRF）显微镜上使用的微流控流动池的制备。第4节描述了如何开展单分子DNA解旋实验。

<table><tbody><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148-25ML</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液 40%&amp;nbsp;</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>1610148</td><td></td></tr><tr><td>Agarose UltraPure&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td>用于配制 Tris 缓冲液（pH 8）</td></tr><tr><td>&amp;Auml;KTA Pure&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>-</td><td>与组分收集器 F9-C 一起使用；蛋白纯化系统</td></tr><tr><td>ANTI-FLAG M2 亲和凝胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>APS 10%&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678-25G</td><td></td></tr><tr><td>ATP（200 mM）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699-5G</td><td></td></tr><tr><td>ATP-g-s（100 mM）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11162306001</td><td></td></tr><tr><td>生物素-PEG 盖玻片</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>按如下方法制备：https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2012.03.033</td></tr><tr><td>生物素标记的抗地高辛抗体&amp;nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>蓝丁胶</td><td>Bostik</td><td>N/A</td><td>粘性橡皮泥</td></tr><tr><td>硼酸</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>B/3800/53</td><td></td></tr><tr><td>BSA；33 mg/mL</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A3858-10G</td><td>从原液稀释</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>CaptoHiRes Q (5/50)</td><td>Cytiva</td><td>29275878</td><td>连接至AKTA蛋白纯化系统；高分辨率离子交换色谱柱</td></tr><tr><td>酪蛋白（水溶液，5%，50 mg/mL）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4765-10ML</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc 系统</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>夹子</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>砧板</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>透析管（3.5 kDa）</td><td>Fisher Scientific</td><td>11425859</td><td></td></tr><tr><td>地高辛-11-dUTP</td><td>罗氏</td><td>11209256910</td><td></td></tr><tr><td>6× DNA上样缓冲液&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP 10 mM</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>双面胶带（0.14 mm 厚）</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fluorochem有限公司</td><td>M02712-10G</td><td></td></tr><tr><td>DYKDDDDK 肽&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>由弗朗西斯·克里克研究所化学生物学STP合成</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>D/0700/68</td><td></td></tr><tr><td>EGFP-RPA&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>纯化方法如所述 &amp;lsquo;单分子分析&amp;rsquo;《分子生物学方法系列》，第783卷（2011年），Peterman, E. J. G. 和 Wuite, G. J. L. 主编，Humana Press。蛋白质信息：2 mM，人源，于大肠杆菌中表达。</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03779-10G</td><td></td></tr><tr><td>环氧树脂 - 5分钟</td><td>Devcon</td><td>20845</td><td></td></tr><tr><td>富士胶片 FLA-5000&amp;nbsp;</td><td>富士胶片</td><td>&amp;nbsp;FLA-5000&amp;nbsp;</td><td>荧光图像分析仪</td></tr><tr><td>GelRed 核酸染料；10000 倍稀释液</td><td>剑桥生物科学</td><td>41003-BT</td><td>一种比溴化乙锭更安全的核酸染料示例。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>带管孔的玻璃或石英载片&amp;nbsp;</td><td>Dremel 型号 395</td><td></td><td>1 毫米厚的载玻片，裁剪为 2.4 厘米 × 1 厘米，钻两个相距 1.4 毫米的孔。两个孔应钻成不同大小，以适配两端不同的管路。</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher Scientific</td><td>G/0650/17</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸盐酸盐，pH 3.5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>哈密尔顿注射器，1000系列 GASTIGHT，PTFE鲁尔锁 1010TLL，带槽PTFE鲁尔锁，容积10 mL</td><td>默克</td><td>26211-U</td><td></td></tr><tr><td>HEPES pH 7.5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>I-CeuI</td><td>NEB</td><td>R0699L</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/4280/53</td><td></td></tr><tr><td>乙酸镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2545</td><td></td></tr><tr><td>Maxi GeBaFlex-tube 透析试剂盒；截留分子量 14 kDa&amp;nbsp;</td><td>Generon</td><td>D055</td><td></td></tr><tr><td>金属刮勺</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>金属镊子</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP（注射器滤器）0.22 &amp;micro;m&amp;nbsp;</td><td>默克</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>针</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NotI-HF</td><td>NEB</td><td>R3189L</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4%&amp;ndash;12% Bis-Tris 蛋白凝胶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10247002;</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS 电泳缓冲液&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>目标加热器</td><td>Okolab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PCR反应混合液 - 2倍浓度</td><td></td><td></td><td>由Phusion DNA聚合酶（20 &amp;micro;L），10 mM dNTPs（40 &amp;micro;L），5× Phusion HF 缓冲液（400 &amp;micro;升）和水（540 &amp;micro;L)</td></tr><tr><td>肽 NH2-CHHHHHHHHHHLPETGG-COOH，标记 LD655-MAL&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>由弗朗西斯·克里克研究所肽化学技术平台（STP）合成并纯化的肽段 NH2-CHHHHHHHHHHLPETGG-COOH，在半胱氨酸残基上标记了 LD655-MAL（Lumidyne Technologies）</td></tr><tr><td>pGC261 质粒</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.10.053</td></tr><tr><td>Phusion 高保真 DNA 聚合酶</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>塑料镊子</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯管 PE20（内径 0.015&amp;rdquo;，外径 0.043&amp;rdquo;)</td><td>Becton Dickinson</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯导管PE60（内径0.03&amp;rdquo;，外径 0.048&amp;rdquo;)</td><td>Becton Dickinson</td><td>427416</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Prep 层析柱；10 ml 和 20 ml&amp;nbsp;</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>7311550</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酸钾（L-谷氨酸钾盐一水合物）</td><td>Sigma</td><td>G1501-1KG</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物（cOmplete，无EDTA）</td><td>罗氏</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Pump 11 Elite 注射/抽吸可编程单通道注射泵</td><td>哈佛仪器</td><td>70-4504</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 纯化试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>剃刀刀片</td><td>VWR International Ltd</td><td>233-0156</td><td></td></tr><tr><td>rCutSmart缓冲液；10倍浓缩液</td><td>NEB</td><td>B6004S</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>S/2120/53</td><td></td></tr><tr><td>分选酶（五重突变体）</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>纯化方法基于：https://doi.org/10.1073/pnas.1101046108</td></tr><tr><td>Spin-X 离心管滤器；0.22 &amp;micro;m 醋酸纤维素&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>10310361</td><td></td></tr><tr><td>无菌手术刀</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Steritop 真空驱动一次性过滤系统；0.22 μm；PES&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>S2GPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素（1 mg/mL）溶于1× PBS缓冲液</td><td>Sigma</td><td>S4762-10MG</td><td>20 &amp;micro;L 等分试样</td></tr><tr><td>SYBR Gold</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>S11494</td><td>我们使用高灵敏度核酸染料来可视化DNA复制叉底物。</td></tr><tr><td>SYTOX Orange；5 &amp;micro;M 在 DMSO 中</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶</td><td>NEB</td><td>M0202M</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶反应缓冲液&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281-25ML&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TEV蛋白酶（1 mg/mL）；EZCut&amp;nbsp;</td><td>Biovision</td><td>7847-10000</td><td></td></tr><tr><td>Dounce型组织研磨器（40 mL，Wheaton）</td><td>DWK生命科学</td><td>432-1273</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>用于配制 Tris 缓冲液（pH 8）</td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>普洛麦格（英国）有限公司</td><td>H5152</td><td></td></tr></tbody></table>

cmg解旋酶解旋dna的单分子实时可视化观察

Single-Molecule Real-Time Visualization of DNA Unwinding by CMG Helicase

精确的基因组复制对于维持分裂细胞的遗传稳定性至关重要。DNA复制在S期由一个动态的蛋白质复合物——复制体来完成。复制体的核心是&#160;CDC45-MCM2-7-GINS（CMG）解旋酶，它负责解开DNA双螺旋的两条链，使DNA聚合酶能够分别复制每条链。在基因组复制过程中，复制体必须克服多种障碍和挑战。这些障碍中的任何一项都可能威胁基因组的稳定性，因为DNA复制不完全或不准确可能导致突变、疾病或细胞死亡。因此，深入了解CMG在正常复制以及复制应激过程中于复制体内的功能具有重要意义。本文描述了一种利用重组纯化蛋白的全内反射荧光（TIRF）显微镜检测方法，可实现对单个CMG复合物锚定并拉伸的DNA分子进行实时可视化观察。该检测方法为在单分子水平上研究CMG的行为提供了强有力的平台，使解旋酶的动力学行为能够在实时调控反应条件的情况下被直接观测。

当CMG解旋DNA时，会随时间逐渐形成一条特征性的RPA轨迹（图5）。解旋后的DNA的5'端被锚定在表面，因此表现为从锚定点到复制叉之间的一段线性RPA信号。而3'端未被锚定，因此随复制叉移动，表现为一个紧凑的EGFP-RPA信号。该紧凑的解旋后易位链的位置大致对应于复制叉的位置，后者与通过640 nm激光观察到的LD655-CMG共同移动。
尽量减少对DNA底物的损伤非常重要，因为单链DNA切口等损伤会减少可观察到的解旋事件数量，从而限制可收集的数据量（图6）。
<img alt="DNA解链实验，CMG解旋酶，RPA结合；示意图与荧光显微镜结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67212/67212fig05.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="Figure 5"> 
图5：单分子DNA解链实验。 DNA底物被固定在盖玻片表面。将用LD655标记的纯化CMG在ATP-γ-S条件下与DNA孵育15分钟。随后加入ATP和用EGFP标记的纯化RPA，启动CMG介导的广泛DNA解链。左侧为示意图，右侧为代表性数据的延时成像图（kymograph）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67212/67212fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="DNA复制示意图及显微镜图像，显示RPA结合及随时间推移的链断裂分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67212/67212fig06.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="Figure 6"> 
图6：DNA损伤降低检测通量。（A）CMG无法解开DNA骨架断裂（DNA切口）之后的DNA。前导链模板上的切口会导致CMG从DNA上滑脱，CMG和前导链模板均丢失。滞后链模板上的切口会导致滞后链模板与其余DNA分离，每段DNA片段回缩至各自的锚定位点。此过程由（i）卡通示意图和（ii）这些事件的延时图像轨迹图（kymographs）展示。（B）轻微损伤的DNA底物与（C）更严重损伤的DNA底物在单个视野中的代表性数据，分别在（i）5分钟、（ii）15分钟和（iii）60分钟时采集。更严重损伤的DNA底物无法产生长片段的解链，因为CMG更早遇到切口，尽管解链活性水平相似（5分钟时RPA斑点增长密度相似，表明CMG加载/解链效率相似）。视野为512 × 512像素（像素大小 = 154.6 nm）。使用1%激光功率（488 nm）成像EGFP-RPA。比例尺显示为10 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67212/67212fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案演示了通过单分子实验对CMG解旋酶解旋DNA的过程进行活体可视化观察。内容包括：（1）制备DNA底物，（2）纯化荧光标记的黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）CMG解旋酶，（3）为全内反射荧光（TIRF）显微镜准备微流控流动池，以及（4）单分子DNA解旋实验。

CMG解旋酶解旋DNA的单分子实时可视化观察

基因组的精确复制对于维持分裂细胞的遗传稳定性至关重要。DNA复制在S期由复制复合体完成……

在我们的实验室中，我们正在研究真核生物DNA复制的分子机制。我们希望在单分子水平上理解基因组复制的动力学过程。我们采用多种系统来观察DNA复制，包括纯化的蛋白质以及从非洲爪蟾卵中提取的提取物。我们对DNA复制的许多了解都来自于群体实验、细胞成像和结构生物学。这些方法非常强大，但通常在揭示单个蛋白质的动力学或瞬时行为方面存在局限性。这正是单分子技术特别适用于此类研究的原因，也是该技术在该领域应用日益广泛的原因。我们关于DNA解旋实时可视化的方法概述了一个可扩展和修改的平台，可用于研究DNA复制的不同方面。该方法有助于更好地理解在特定核糖体组分和复制应激存在条件下CMG活性的分子机制。为了阐明DNA复制过程中复杂的系统，我们分离关键蛋白质，并在体外观察其实时行为。我们获得的见解有助于更全面地了解DNA复制过程。准备流动池时，将生物素-PEG盖玻片切成两半。通过蚀刻并将载玻片折断，制备小块玻璃，大小约为2.4厘米 × 1厘米。使用直径为0.8毫米的金刚石镀层钻头，在玻璃片上钻两个相距1.4毫米的孔。通过插入进样或出样管路测试孔的通畅性。将双面胶带裁剪成与玻璃片相同的形状。将玻片在胶带上对齐，用针穿过每个孔以在胶带上标记其位置。使用剃刀刀片切割出一个包含两个孔的通道。用丙酮清洁玻璃片。用纸巾将玻璃片擦干，并将其放置在干净的表面上。然后揭下双面胶带的一侧，将其粘贴到玻璃片上，确保两个孔完全位于通道内。使用P1000移液器吸头，用力按压胶带，使胶带与玻璃片密封牢固。将胶带的第二层从两块玻璃上剥离。将载玻片放置在干净的表面上，使粘性面朝上。使用塑料镊子夹住半生物素化PEG盖玻片的边缘，将PEG功能化的一面轻轻放下，贴附到粘合剂上。用手指按压盖玻片以固定其位置。使用移液器吸头以适中压力擦拭盖玻片表面，去除气泡。然后将流动池翻转过来。对于每个流式池，剪取约10厘米的聚乙烯20和60管。将管子末端以小于45度的角度斜切，并将管子插入载玻片的孔中。如果孔径合适，管子可自行直立于孔内。充分混合环氧树脂组分。使用P200移液器吸头在每段玻璃管的管路周围点涂环氧树脂。让环氧树脂固化30至60分钟。首先，在工作平台上准备好新配制的经滤膜除菌的封闭缓冲液、10倍反应缓冲液一和缓冲液二。将装有2.5毫升封闭缓冲液和5毫升超纯水的敞口试管放入真空干燥器中，在真空条件下脱气。15分钟后，释放真空，取出试管。将制备好的生物素-PEG 流通池组件放置在显微镜载物台上，并用粘性橡皮泥在两端固定。通过针头将流通池出口管路连接至注射泵。开启物镜加热器，设置温度为 30 摄氏度。在靠近流路池的另一块黏性橡皮附近，用离心管盛装一到两毫升脱气水。将进样管插入管中直至底部，使水流通过通道。提高流速以去除进样管附近滞留的任何气泡。向20微升浓度为1毫克/毫升的链霉亲和素样品中加入100微升脱气封闭缓冲液。将开口管固定在黏性橡皮泥上。将进样管从水中转移至链霉亲和素溶液中，并以每分钟40微升的流速运行2分钟。五分钟后，用封闭缓冲液洗去多余的链霉亲和素。将溶于含有25纳摩尔SYTOX Orange的封闭缓冲液中的生物素化DNA流过表面。使用532纳米激光在实时成像模式下观察DNA与表面的连接过程。当表面达到所需的DNA密度后，流入含有25纳摩尔SYTOX的封闭缓冲液，以洗去游离的DNA。接着，流入用含有25纳摩尔SYTOX Orange的封闭缓冲液稀释的生物素化抗地高辛抗体。再用封闭缓冲液洗去生物素化抗地高辛抗体和SYTOX Orange。将50微升ATP-γ-S混合液注入流动池中。在30微升ATP-γ-S混合液中加入纯化的CMG解旋酶，使其终浓度约为100纳摩尔，以每分钟20微升的速度注入20微升。孵育15分钟。接下来，以每分钟40微升的流速注入ATP RPA混合液，总体积为80微升。使用50至100毫秒的曝光时间，通过488纳米激光观察并采集eGFP-RPA信号，然后使用640纳米激光采集CMG信号。最后，使用532纳米激光对SYTOX Orange染色的DNA进行成像和采集。通过随时间推移黄色RPA信号区域的线性增长，可观察到CMG解旋酶对DNA的解旋过程，该现象表明DNA双链已被解开。单链DNA损伤会减少成功解旋事件的数量，这体现在实验数据中完成的轨迹信号减少。

single-molecule-real-time-visualization-dna-unwinding-cmg

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

通过 CMG 解旋酶对 DNA 解旋进行单分子实时可视化

本方案展示了一种简单的单分子荧光显微镜技术，用于实时观察单个复制体进行的DNA复制过程。...

利用荧光显微镜观察单分子DNA复制

我们描述了一种通过噬菌体复制系统蛋白介导，对单个DNA分子进行实时复制观察的方法。...

利用单分子DNA拉伸实验直接观察酶复制DNA

我们报道了一种混合的群体与单分子检测方法，可直接成像并定量荧光标记的、完全重建的Cdc45/Mcm2-7/GINS（CMG）解旋酶在由光镊固定的线性DNA分子上的运动。...

杂合组装与单分子检测技术用于成像完全重建的CMG的运动

本方案介绍了一种基于荧光显微镜的单分子DNA复制检测方法，可实现实时观察DNA聚合酶与G-四链体结构等障碍物之间的相互作用。...

单分子荧光成像观察DNA聚合酶在G-四链体上的动态行为

本方案展示了一种简单、可靠且高通量的单分子流动拉伸实验方法，用于研究分子沿DNA的一维（1D）扩散。...

一种简单、稳健且高通量的单分子流动拉伸检测方法，用于研究分子沿DNA的运输

传统的凝胶电泳（SGE）实验需要复杂的设备且化学试剂消耗量大。本研究介绍了一种低成本、可在短时间内分离DNA片段的方法。...

利用智能手机实时追踪DNA片段分离

本文报道了一种用于操控G-四链体的单分子磁镊平台，该平台可用于研究G4的稳定性及其受多种蛋白质调控的机制。...

利用磁镊对G-四链体进行单分子操控

本方案描述了使用异双功能硅烷偶联剂将蛋白质共价固定在二氧化硅表面的方法，该表面专为基于原子力显微镜的单分子力谱技术而设计，并以肺炎链球菌（S.

用于单分子力谱的蛋白质共价固定

开发了基于荧光共振能量转移的DNA链交换反应实时观测系统，该反应由Rad51介导。利用本文所述的实验方案，我们能够检测反应中间产物的形成及其向终产物的转化过程，同时分析该反应的酶促动力学特征。...

实时观察 Rad51 介导的 DNA 链交换反应

本文介绍了一种在单分子水平上评估复杂蛋白质样品中每种蛋白质组分标记均一性的实验方案。...

单分子水平下蛋白质组范围内的标记均一性定量分析

学习使用单分子TIRF显微镜技术实时可视化CMG解旋酶对DNA的解旋过程。该方法利用荧光标记和微流控芯片研究真核生物DNA复制的分子机制，为理解基因组复制动态提供重要平台。

CMG解旋酶解旋DNA的单分子实时可视化观察

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