开发多微生物菌落生物膜模型以测试囊性纤维化中的抗菌剂
September 20th, 2024
该方法允许在囊性纤维化中建立多微生物生物膜模型，用于研究和临床实验室的抗菌药物敏感性测试。此模型可在一系列输出中提供准确可靠的结果。
我们的研究重点是使用复杂的多微生物模型来了解囊性纤维化环境中微生物之间的复杂相互作用，以及这如何导致抗菌素耐受性增加。我们希望利用这些知识来开发新的治疗干预措施。生物膜领域的进步是由可视化、量化方法和生物物理方法推动的。
这包括 3D OrbiSIMS 等技术，这些技术可提供低至微米和纳米尺度的空间分辨率。本研究旨在创建一个多微生物模型，该模型保持一定程度的复杂性，代表 CF 患者抗生素治疗中所见的情况。它还将提高通量、更相关的输出以及对其他菌株和条件的适应性。
该协议为 CF 病原体提供了相关的测试环境。它很健壮，并且具有相对较高的吞吐量。它也适用于多个终点，允许进行更复杂的研究。
这项研究表明，与 CF 相关的环境会改变和微生物易感性。此外，存在的真菌类型也可以改变铜绿假单胞菌的易感性，这可能具有重要的临床意义。首先，以生长到指数期的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的培养物为例。
使用微量移液器，将每种液体培养物的 1 毫升转移到单独的无菌 1.5 毫升试管中。将试管以 8， 000 x g 离心 2 分钟，以沉淀细菌或真菌。之后，使用移液器从每个试管中吸出上清液，并将沉淀重悬于一毫升 PBS 中。
在 PBS 中稀释重悬的铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌细胞 1 至 10。然后使用分光光度计测量 600 纳米波长的光密度。在 PBS 中稀释洗涤过的白色念珠菌样品 1 至 100 后，将每个样品的 10 微升移液到血细胞计数器的两个单独腔室中。
然后将白色念珠菌样品调整为 1 x 10 至 PBS 中每毫升 8 CFU 的幂。为了准备添加到生物膜中的接种物，使用 PBS 调整铜绿假单胞菌、白色念珠菌和金黄色葡萄球菌接种物。对于单一物种生物膜，将 10 微升稀释的微生物移液到放置在 6 孔板中 SCFM2 1.5% 工业琼脂上的聚碳酸酯圆盘的中心。
在处理或破碎之前，将板在 37 摄氏度下静态孵育 24 小时。对于多微生物生物膜，在同一聚碳酸酯圆盘上将金黄色葡萄球菌和白色念珠菌各 10 微升相互叠加。将接种的圆盘在 37 摄氏度下静态孵育 24 小时。
使用无菌镊子孵育后，将聚碳酸酯圆盘转移到新鲜的 SCFM2 1.5% 技术琼脂平板上。在预先建立的金黄色葡萄球菌、白色念珠菌生物膜上，以每毫升 4 CFU 的幂比例稀释铜绿假单胞菌加入 10 μL 的 1 x 10 的剂量。在 24 摄氏度下再孵育 37 小时。
首先，取铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的固体空气界面菌落生物膜。将直径为 2.8 毫米的陶瓷珠添加到板上，并在板上进行紫外线交联。使用火焰灭菌镊子，将五个陶瓷珠转移到无菌的 2 毫升均质管中。
将 1 毫升 PBS 移液到 2 毫升匀浆管中。涡旋试管至少 10 秒，或直到目视检查确定生物膜从聚碳酸酯盘上去除。取出后，取出聚碳酸酯圆盘，然后将带有珠子的试管放入均质器中，以每秒 6 米的速度敲打两次，持续 10 秒，每次拍打间隔 10 秒。
现在将均质管中被破坏的生物膜倒入含有 4 毫升 PBS 的 7 毫升 bijou 中，最终体积为 5 毫升。将均质管以 8， 000 x g 离心 2 分钟。然后将剩余的液体转移到 7 毫升的珠宝中，以确保所有液体都被转移。
将 200 微升被破坏的生物膜加入透明底部黑色 96 孔板中，然后将 10 微升 0.02% 刃天青溶液移液到每个孔中。在 37 摄氏度的读板器中孵育刃天青处理的生物膜。在读取任何荧光读数之前，每 30 分钟以 200 RPM 的速度进行一次轨道振荡，持续 10 秒。
使用 540 纳米的激发波长和 590 纳米的发射波长测量荧光。与多微生物生物膜相比，单一物种生物膜需要显着降低浓度的美罗培南和妥布霉素才能达到 50% 的杀伤效果，后者所需的抗生素浓度增加了两个对数。铜绿假单胞菌在每毫升妥布霉素 64 μg 的多微生物生物膜中的存活率增加，而美罗培南在类似条件下的存活率降低。
在单物种生物膜中，当用美罗培南和妥布霉素处理时，观察到铜绿假单胞菌的存活与其代谢活性之间存在很强的相关性。
概述
本研究提出了一种建立与囊性纤维化相关的多微生物生物膜模型的方法，旨在进行抗菌药物敏感性测试。该模型提高了通量和适应性，为研究和临床应用提供了可靠的结果。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 传染病
- 抗菌药物耐药性
背景
- 囊性纤维化的特征是复杂的微生物相互作用。
- 多微生物生物膜会导致抗菌药物耐受性增加。
- 理解这些相互作用对于开发有效的治疗方法至关重要。
- 当前的方法缺乏进行准确建模所需的复杂性。
研究目的
- 为囊性纤维化病原体创建一个稳健的多微生物生物膜模型。
- 调查微生物相互作用对抗生素敏感性的影响。
- 促进与临床环境相关的高通量测试。
使用的方法
- 假单胞菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的培养和制备。
- 使用聚碳酸酯圆片进行生物膜形成。
- 生物膜的孵育和破坏以进行分析。
- 荧光测量以评估代谢活性和抗生素敏感性。
主要结果
- 单种生物膜需要较低的抗生素浓度才能有效治疗。
- 多微生物生物膜在抗生素治疗下表现出假单胞菌的增加存活。
- 与真菌的相互作用改变了细菌的敏感性。
- 研究结果突显了生物膜复杂性在抗菌药物测试中的重要性。
结论
- 开发的模型为CF病原体提供了相关的测试环境。
- 理解微生物相互作用可以为治疗策略提供信息。
- 这种方法可能会导致囊性纤维化治疗的改善结果。
常见问题
Executive Industry Relevance
Polymicrobial biofilm models that reflect the cystic fibrosis (CF) lung environment address a critical gap in antimicrobial discovery by enabling more predictive assessment of compound efficacy. This model's adaptability and multiplexed outputs support higher predictive confidence at the target validation and screening inflection points. Its relevance to CF pathogen biology enhances translational continuity and risk-adjusted portfolio decisions for anti-infective R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a disease-relevant, polymicrobial context.
- Supports biological de-risking by modeling complex microbial interactions affecting drug response.
- Improves predictive confidence for target validation by incorporating physiologically relevant endpoints.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, CF-relevant biofilm systems for downstream antimicrobial screening workflows.
- Facilitates assay standardization and reproducibility with quantitative outputs such as CFU, metabolic activity, and confocal imaging.
- Enables mid-throughput screening and platform reuse across diverse microbial strains and conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro testing with disease-relevant biofilm architecture and microbial dynamics seen in CF patients.
- Supports continuity from early discovery through preclinical validation by modeling clinically relevant resistance mechanisms.
- Provides mechanistic de-risking for anti-infective candidates prior to in vivo studies.
Pipeline & Workflow Integration
This polymicrobial colony biofilm model bridges early discovery, screening, and translational research for anti-infective development in CF.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on microbial interactions and drug susceptibility in a CF-relevant environment.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for compound evaluation and ranking.
- Analytics: Provides multi-parametric outputs (CFU, metabolic activity, imaging) for robust statistical comparison.
- Translational Research: Models clinically relevant resistance and microbial dynamics for improved preclinical alignment.
- Enterprise Reuse: Adaptable to various pathogens, media, and conditions for broad anti-infective R&D utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in anti-infective discovery.
- Operational Value: Standardizes complex biofilm assays for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in the portfolio.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of anti-infective candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiology, biofilm biology, and quantitative assay development.
- Needs access to imaging, plate readers, and analytical infrastructure for multi-parametric outputs.
- Demands cross-team standardization for reproducibility across strains and conditions.
- Adaptable to different microorganisms, media, and oxygen levels for diverse R&D needs.
- Practical limitations include the complexity of modeling all clinical variables in vitro.
