Name: 开发多微生物菌落生物膜模型以测试囊性纤维化中的抗菌剂 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: 了解多微生物菌落生物膜模型的建立方法，用于囊性纤维化中的抗菌剂敏感性测试。该模型利用Pseudomonas aeruginosa、Staphylococcus aureus和Candida albicans，通过荧光测量评估代谢活性，为临床相关的高通量筛选提供可靠平台。

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本工作由国家生物膜创新中心（NBIC）资助，NBIC 是由生物技术和生物科学研究理事会、英国创新署和哈特里中心资助的创新与知识中心［资助编号 BB/R012415/1 和 BB/X002950/1］，以及由英国囊性纤维化基金会和美国囊性纤维化基金会战略研究中心“囊性纤维化抗微生物治疗药物开发的循证临床前框架”（PIPE-CF）［资助编号 SRC022］资助。

1. 合成囊性纤维化培养基-2（SCFM2）及平板的制备
<ol>
	<li>根据 Palmer 等人16 描述的配方，在500 mL硼硅酸盐玻璃瓶中以2倍浓度制备SCFM2，但需进行几项修改。
	<ol>
		<li>按 表1 所示称量并配制储备液。根据 表2 配制氨基酸储备液。</li>
		<li>在200 mL硼硅酸盐玻璃瓶中，将5 g黏蛋白（来自猪胃，II型）和600 mg胞外DNA（来自鲑鱼精子）溶于100 mL dH2O中。在高压灭菌前于4 °C下搅拌过夜。</li>
		<li>向一个500 mL的灭菌瓶中加入0.54 g葡萄糖、6.06 g NaCl和2.228 g KCl。加入10 mL步骤1.1.1中配制的各储备液。用1 M NaOH或HCl调节pH至6.9。</li>
		<li>加入10 mL dH2O，随后加入10 mL 0.175 M CaCl2和10 mL 0.0606 M MgCl2。配制并加入10 mL 0.93 M L-乳酸。使用前立即加入10 mL 0.36 mM Fe(III)SO47H2O。</li>
		<li>使用滤器装置和真空泵对SCFM2进行过滤灭菌，然后加入已高压灭菌的黏蛋白和胞外DNA。 
		注意：配制好的SCFM2可在4 °C下保存最多1个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按以下方法制备SCFM2琼脂平板。
	<ol>
		<li>将25 mL 2倍浓度SCFM2置于50 mL离心管中，在55 °C水浴中预热，然后与25 mL预先熔化的3%（w/v）技术级琼脂混合，得到含1倍浓度SCFM2和1.5%（w/v）技术级琼脂的混合物。</li>
		<li>使用移液管将5 mL该混合物转移至6孔板的每个孔中。</li>
		<li>将相同数量的直径13 mm、孔径0.2 µm的聚碳酸酯膜圆片置于培养皿底部，用波长254 nm、频率60 Hz的紫外光（UV-C）照射600秒进行灭菌；翻转圆片后重复UV-C处理。</li>
		<li>待1倍浓度SCFM2-1.5%（w/v）技术级琼脂凝固后，用无菌镊子将单个聚碳酸酯膜圆片放置于6孔板各孔表面。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 感染用细菌的制备
<ol>
	<li>在建立模型之前，为所需的细菌和真菌准备好琼脂平板&#160;根据实验室所用的标准琼脂对菌株进行分类 P. aeruginosa PAO1，金黄色葡萄球菌 SH1000 和 白色念珠菌 SC5314（例如，用于细菌的含1.2%（w/v）琼脂的胰蛋白胨酵母提取物培养基，以及用于真菌的沙保葡萄糖琼脂） C. albicans). 
	注意：为建立该模型，已使用特定的实验室参考菌株。然而，该模型也可用于其他菌株，包括临床分离株，但需进行一些修改，例如对生长较慢的菌株，在处理前延长生物膜形成时间。</li>
	<li>使用1 µL接种环挑取每种微生物的单个菌落，接种于5 mL标准实验室液体培养基中（例如，用于大肠杆菌的LB培养基） 铜绿假单胞菌，金黄色葡萄球菌 和酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基用于 C. albicans）。将这些培养物在37 °C、200 rpm条件下培养至对数生长期（适用于细菌），或在30 °C、200 rpm条件下培养至对数生长期（适用于 C. albicans. 
	注意：通气量会因摇床培养箱的类型和旋转半径不同而有所差异</li>
</ol>
3. 建立固相-气相界面模型
注意：该模型的整体示意图参见补充图1。
<ol>
	<li>将每种液体培养物各1 mL转移至单独的无菌1.5 mL离心管中，在8,000 × g条件下离心2分钟，使细菌/真菌沉淀。所有离心步骤均在室温下进行。</li>
	<li>用移液器吸除上清液，将沉淀重悬于1 mL PBS中，再次在8,000 × g条件下离心2分钟。</li>
	<li>同上一步骤去除上清液，将沉淀重悬于1 mL PBS中。将重悬的P. aeruginosa和S. aureus细胞用PBS按1:10稀释，并在600 nm波长下使用分光光度计测定光密度。</li>
	<li>根据先前的验证结果调整洗涤后的样品至1 × 108 菌落形成单位&#160;(CFU)/mL：当P. aeruginosa的OD600为0.05、S. aureus为0.1时，相当于1 × 108 CFU/mL。</li>
	<li>对于C. albicans，将洗涤后的样品用PBS按1:100稀释，取10 µL分别加入血细胞计数板的两个独立计数室中，利用计数室的固定尺寸和所用稀释倍数计算CFU/mL。使用改进型Neubauer血细胞计数板时，计算公式如下： 
	细胞数 = 平均细胞计数 × 10,000 /（稀释倍数）</li>
	<li>计算所得的CFU值代表稀释前样品中C. albicans的CFU/mL。将C. albicans样品用PBS调整至1 × 108 CFU/mL，方法与细菌培养物相同。</li>
	<li>为制备用于生物膜接种的菌液，使用PBS将P. aeruginosa接种液稀释至1 × 104 CFU/mL（连续两次100倍稀释），C. albicans稀释至1 × 105 CFU/mL（先100倍稀释再10倍稀释），最后将S. aureus稀释至1 × 106 CFU/mL（100倍稀释）。</li>
	<li>对于单一种类生物膜，将10 µL稀释后的目标微生物加至先前放置于1× SCFM2-1.5%技术琼脂六孔板上的聚碳酸酯膜中心，于37 °C静置培养24小时，之后进行处理或破坏。</li>
	<li>对于多微生物生物膜，将10 µL S. aureus和10 µL C. albicans依次叠加加至同一张膜上。将接种后的膜于37 °C静置培养24小时。 
	注：S. aureus和C. albicans接种顺序不影响模型的建立，结果一致。</li>
	<li>随后，用无菌镊子将聚碳酸酯膜转移至新鲜的1× SCFM2-1.5%技术琼脂平板中，并在已形成的S. aureus - C. albicans生物膜上方加入10 µL浓度为1 × 104 CFU/mL的P. aeruginosa稀释液。继续在37 °C培养24小时。 
	注：P. aeruginosa在S. aureus和C. albicans接种24小时后加入，以模拟这些微生物在囊性纤维化患者肺部常见的定植顺序。此顺序也可防止P. aeruginosa过度生长而抑制其他两种微生物。一旦加入P. aeruginosa，生物膜可继续培养超过24小时，但需每24小时将带有生物膜的聚碳酸酯膜转移至新鲜培养基中。在破坏前，可利用表达荧光蛋白的菌株、荧光染料或菌株/微生物特异性抗体对生物膜进行显微观察。但需注意，某些染料会非特异性地染色聚碳酸酯膜。</li>
</ol>
4. 生物膜破坏
<ol>
	<li>使用经火焰灭菌的镊子，将直径为 2.8 mm 的陶瓷珠加入到平板中，并按照步骤 1.3 所述对平板进行紫外交联。再用火焰灭菌的镊子向无菌的 2 mL 匀浆管中加入 5 颗陶瓷珠。然后，用移液器将 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）加入该 2 mL 匀浆管中。</li>
	<li>涡旋振荡管子至少 10 秒，或直至通过肉眼观察确认生物膜已从聚碳酸酯圆片上完全脱离，此时取出聚碳酸酯圆片。</li>
	<li>将含有珠子的管子放入匀浆器中，以 6 m/s 的速度进行两次、每次 10 秒的拍击，两次之间间隔 10 秒。 
	注意：根据显微镜观察和菌落形成单位测定，该组合的珠子、拍击时间及匀浆器使用方式可在最小细胞裂解的前提下充分破坏生物膜。具体参数可能因所用不同型号的珠磨机而有所差异。</li>
	<li>将匀浆管中破碎后的生物膜转移至含有 4 mL PBS 的 7 mL 小离心管（bijou）中，最终体积为 5 mL。</li>
	<li>将匀浆管在 8,000 × g 离心 2 分钟，并将残留液体转移至 7 mL 小离心管中，以确保匀浆管中的所有液体均已转移。 
	注意：由此获得的 5 mL 破碎生物膜可用于多种检测分析，但在进行任何计算时，必须牢记生物膜已从最初的 1 mL PBS 稀释至最终 5 mL 体积中。</li>
</ol>
5. 代谢活性检测
<ol>
	<li>将上述第4步中获得的200 µL破碎生物膜加入至透明底黑色96孔板中，然后加入10 µL 0.02% (w/v) 的刃天青溶液。</li>
	<li>将添加刃天青的生物膜置于酶标仪中孵育并检测其代谢活性。在37 °C条件下孵育，每次检测荧光前，以200 rpm转速振荡30秒，每30分钟振荡一次。</li>
	<li>使用540 nm激发波长和590 nm发射波长测定荧光强度，并使用酶标仪每30分钟重复一次，持续4小时。 
	注意：选择4小时时间点是因为该时间可更明显地区分处理组与未处理组样本，以及不同抗生素浓度样本之间的差异。</li>
</ol>
6. 抗微生物敏感性测试
<ol>
	<li>为了检测标准抗生素的抗菌耐受性，将所选抗生素溶解于相应的溶剂中，并在1x SCFM2-1.5%（w/v）技术琼脂培养基仍处于液态时加入其中，随后将5 mL培养基转移至六孔板的每个孔中。待凝固后，使用无菌镊子将生长在聚碳酸酯膜上的生物膜转移至含抗生素培养基表面，并在生物膜顶部添加10 µL相应浓度的抗生素溶液。 
	注意：本研究中，美罗培南和妥布霉素采用从64 µg/mL到0.125 µg/mL的2倍梯度稀释，以反映临床相关浓度。仅将抗生素或其他抗菌/抗毒力处理剂施加于生物膜表面即可，因为将其同时添加至培养基和生物膜表面时观察到的反应相似。</li>
	<li>在37 °C条件下孵育24小时后，对生物膜进行成像，并按照步骤4所述进行破坏处理。</li>
	<li>从5 mL破坏后的培养物中取一份等分试样，使用PBS进行10倍系列稀释。将10 µL稀释液以三重复形式点种于琼脂平板上，采用Miles和Misra方法测定菌落形成单位（CFU）30。 
	注意：加样至琼脂平板的体积会影响检测下限，较大体积可降低检测下限，但需要更多的样品和琼脂平板。</li>
	<li>对于单一种类生物膜，将P. aeruginosa和S. aureus划线接种于LB琼脂平板，将C. albicans接种于SDA琼脂平板。</li>
	<li>对于多物种生物膜，将等分试样接种于三种不同的含抗生素选择性培养基上，以分离三种不同物种并测定各自的CFU。包括Pseudomonas分离琼脂和含10 µg/mL制霉菌素的甘露醇盐琼脂，分别用于分离P. aeruginosa和S. aureus；以及含125 µg/mL四环素的沙保葡萄糖琼脂，用于分离C. albicans。将S. aureus平板在37 °C过夜孵育，将P. aeruginosa和C. albicans平板在30 °C孵育。 
	注意：将P. aeruginosa平板在30 °C孵育可最大限度减少菌落过度生长并抑制游走现象。</li>
</ol>

Adaptable CF Model for Antimicrobial Testing and Microbial Dynamics Analysis

<ol><li>2021 Cf foundation patient registry highlights report. , Available from: 
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<li>Worlitzsch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+reduced+mucus+oxygen+concentration+in+airway+pseudomonas+infections+of+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway pseudomonas infections of cystic fibrosis patients.</a> J Clin Invest. 109 (3), 317-325 (2002).</li>
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本研究未声明任何利益冲突或竞争性财务利益。

此处描述的生物膜模型通过以比现有方法更便捷的方式整合多种常见的多微生物相互作用，使我们能够模拟囊性纤维化肺部感染环境的某些方面 体外 抗菌测试方法，如疾控中心反应器和拉伯克生物膜模型31这一点至关重要，因为包括生物膜的物理特性、营养物质的可利用性以及生物膜内物种间的分子相互作用在内的多种因素，均可能影响抗菌剂的活性以及微生物对抗菌剂的反应。21通过整合这些因素，我们已开发出一种高度通用的模型，与当前未考虑上述因素的模型相比，该模型可能更准确地预测抗菌治疗结果。
P. aeruginosa、S. aureus 和 C. albicans 被选为囊性纤维化（CF）中常见分离的革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌的代表性微生物32。然而，我们还已证明，该模型可用于多种其他与CF相关的微生物，包括 Burkholderia cenocepacia、Burkholderia multivorans、Aspergillus fumigatus，目前正被改进以适用于如 Prevotella melaninogenica 等厌氧菌。这表明该模型具有高度的灵活性，可整合多种微生物，凸显其在针对广泛微生物病原体进行抗菌药物测试方面的适应能力。此外，该模型还可轻松调整以适应多种环境条件，实现更个性化的抗菌敏感性测试，例如用患者痰液替代 SCFM2 培养基。
在新型抗菌药物进入动物或人体研究之前，采用多微生物生物膜模型来测试抗菌药物也至关重要，因为此类模型能够填补抗菌药物研发流程中的现有空白33,34。此外，该模型具有相对较高的通量，且可提供一系列与工业界和科研均相关的检测结果。
尽管本文方法部分仅以菌落形成单位（CFU）和代谢活性为例进行说明，我们还展示了该模型在利用液体萃取表面分析质谱法（LESA）分析生物膜胞外代谢组方面的应用价值，从而可探究支撑抗菌耐受性的一些分子机制35。除上述应用外，我们还验证了该模型在测试新型抗菌剂递送系统中的用途，例如聚合物-环丙沙星偶联物，其可增强该抗生素在生物膜内的渗透能力，同时提高其活性并减少耐药性的产生36。
关键步骤与注意事项 
保持无菌操作至关重要，尤其是在制备 SCFM2 及培养基时，因为污染可能引入非天然存在的物种，从而干扰实验结果。同一种微生物的不同菌株或不同微生物可能需要不同的生长环境条件，或表现出不同的生长特性。因此，在进行任何抗生素敏感性测试之前，必须对模型进行优化。我们建议针对单一种类和多微生物生物膜开展为期 24 小时和 48 小时的小规模预实验，以评估在标准模型条件下的生长情况。我们发现，不同 P. aeruginosa 菌株以及某些抗生素浓度可能会诱导细菌从聚碳酸酯圆片上发生群集运动。这一问题可通过使用市面上可购得的更大尺寸的圆片轻松解决。根据所使用的珠磨机和微生物种类，生物膜的破碎步骤也可能需要优化。我们通过测定已知样品在珠磨处理前后每毫升的菌落形成单位（CFU/mL）来优化破碎方法。此外，还使用显微镜观察珠磨后的样品，以评估生物膜破碎的程度。
这种模拟囊性纤维化（CF）的生物膜模型的一个局限性在于，其附着于含有聚碳酸酯的固体表面，而囊性纤维化患者的肺部并不存在此类表面，实际情况下生物膜更倾向于在囊性纤维化痰液中形成自由漂浮的聚集体37。然而，本文所介绍的固体琼脂模型避免了为去除浮游微生物而清洗生物膜的步骤，确保检测结果仅反映来源于生物膜的微生物，而非浮游与生物膜混合培养物。我们还发现，某些抗生素在此生物膜模型深层区域的渗透能力可能降低，可能需要使用脱氧核糖核酸酶（DNase）来改变胞外基质的流变学特性，并减少其与胞外DNA（eDNA）之间的静电相互作用。
我们认为，该模型由于具有多功能性、可适应性，并且纳入了现有许多模型未能考虑的环境因素，因此非常适合用于抗菌测试。该模型在基础研究和临床前抗菌敏感性测试中的应用，可为临床样本的抗菌药敏试验（AST）以及新型治疗药物的开发提供更具临床相关性的方法。

囊性纤维化（CF）是一种遗传性疾病，在英国影响超过11,000人，全球影响162,000人1,2。尽管囊性纤维化是一种多器官疾病，但囊性纤维化患者（pwCF）的主要症状之一是在其呼吸道内形成异常黏稠且脱水的黏液3。这种情况，加上纤毛摆动能力下降，会促进多种细菌、真菌、病毒和古菌在肺部定植4,5。尽管囊性纤维化患者的肺部环境存在限制微生物生长与存活的条件和选择性压力，但如Pseudomonas aeruginosa等细菌已高度适应这些严苛环境6。这使得细菌能够定植并长期存活，从而导致持续性慢性感染的形成7。
导致这些慢性感染的许多微生物通过从最初的浮游状态转变为生物膜生长模式来实现感染，这种模式可以是附着在表面或形成聚集体7。这些生物膜的特征是由胞外多糖（EPS）基质包裹的紧密排列的细菌群落，该基质包含多种组分，如多糖、蛋白质、脂类以及环境DNA（eDNA）8。这种基质在不同微生物之间是一种常见结构，但其组成可能有所不同。例如，细菌P. aeruginosa基质中的主要多糖成分为Psl、Pel和藻酸盐，而真菌Candida albicans的主要多糖基质成分则是甘露聚糖和葡聚糖9。在单一种类生物膜中，与浮游状态相比，该基质可通过限制抗生素向生物膜内部渗透而显著影响抗生素耐受性，从而降低抗生素的有效性10。生物膜生长模式还会诱导形成持留细胞，这些细胞的代谢活性较其浮游对应细胞显著降低，因而对抗生素的敏感性进一步下降11。这种生长模式还伴随着某些抗生素耐药机制的上调，例如外排泵以及介导水平基因转移的相关机制，从而促进耐药基因的交换11,12,13。除此之外，宿主的疾病相关环境也极大影响微生物的生理状态及其对抗生素的反应方式。这包括厚黏液中增强的微需氧环境，以及非标准碳源（如氨基酸和eDNA）的可利用性，这些碳源可能来源于宿主或由微生物降解肺部分泌物产生14,15,16。
这些特定的相互作用因生物膜的多微生物特性而变得更加复杂，这引入了额外的复杂性，不仅存在于细菌之间，也存在于细菌与真菌之间。与细菌生物膜相比，尽管已从超过75%的囊性纤维化（CF）患者中分离出C. albicans，但关于细菌与真菌生物膜之间某些相互作用的研究仍较为有限15。通常情况下，C. albicans与P. aeruginosa等细菌之间的相互作用具有拮抗性，但也可能导致更慢性且更严重的感染18。微生物间的相互作用（包括致病性和共生性）以及一系列与囊性纤维化相关的环境因素共同作用，最终可能导致抗生素耐受性增强19,20。然而，在临床前抗生素测试中，许多这些因素往往未被充分考虑，尽管现有模型已将其归因为抗生素耐受性增加的原因21。
这些条件也难以重现 体外 因此，许多模型缺乏囊性纤维化患者体液（pwCF）中存在的特定耐受诱导因子，例如那些可增加β-内酰胺酶产生的因子 P. aeruginosa22，小菌落变体的诱导在 金黄色葡萄球菌 以及抑制连字符的使用 C. albicans；所有这些均已在囊性纤维化痰液中被证实存在23,24.
因此，目前的抗生素敏感性检测方法所采用的条件与宿主环境中的实际情况存在巨大差异。这些方法通常基于浮游培养或在标准化培养基（如 Mueller-Hinton 培养基）上的琼脂平板培养，结合纸片扩散法、Etest 法以及 CLSI 肉汤微量稀释法进行检测25。这种差异常常导致无法准确测定抗生素敏感性26。此外，由于抗菌生物膜检测缺乏标准化，使得实验室中获得的抗菌效果难以准确转化为临床应用27,28。
我们建立的多微生物模型表明，Pseudomonas aeruginosa 对多种抗菌药物（包括美罗培南和妥布霉素）的耐受性增强。这说明了当前使用单一种类生物膜进行抗菌药物敏感性测试，与本研究中建立的用于测定最低抑菌浓度的多微生物生物膜模型之间存在显著差异。该模型还具备较高的通量和较低的成本，符合抗菌药物测试的实际需求。该模型还可用于研究抗菌治疗对多微生物群落动态的影响，判断特定治疗方案是否可能导致某一病原体占据主导地位，从而预测后续可能出现的并发症。尽管该模型能够形成复杂的生物膜结构，但其构建过程无需复杂的实验设备，为多种临床和科研应用提供了可行平台。

<table><tbody><tr><td>1 &amp;micro;L 接种环&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>13 mm 孔径 0.2 &amp;micro;m 的聚碳酸酯滤膜圆片&amp;nbsp;</td><td>Isopore&amp;nbsp;</td><td>GTTP01300</td><td>也可提供更大尺寸的滤膜圆片&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>2 mL 加强型离心管&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher&amp;nbsp;</td><td>15545809</td><td></td></tr><tr><td>2.5 mL 陶瓷珠&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>13114-325</td><td></td></tr><tr><td>500 mL 硼硅酸盐玻璃 Duran 瓶</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>Z305197</td><td>如需更大体积，可提供更大容量的瓶子</td></tr><tr><td>6 孔培养板</td><td>Greiner</td><td>657165</td><td></td></tr><tr><td>7 mL Bijou 管</td><td>Thermofisher&amp;nbsp;</td><td>129B</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Thermofisher&amp;nbsp;</td><td>167008</td><td>用于 CFU 测定中的系列稀释</td></tr><tr><td>用于制备 &lt;em&gt;P. aeruginosa、S. aureus&lt;/em&gt; 和 &lt;em&gt;C. albicans&lt;/em&gt; 平板的琼脂平板</td><td></td><td></td><td>&amp;nbsp;&lt;em&gt;P. aeruginosa&lt;/em&gt; 和 &lt;em&gt;S. aureus&lt;/em&gt; 使用 LB Miller 培养基，&amp;nbsp;&lt;em&gt;C. albicans&amp;nbsp;&lt;/em&gt; 使用沙氏葡萄糖琼脂</td></tr><tr><td>适用于 2 mL 管的珠磨仪</td><td>Fisherbrand&amp;nbsp;</td><td>15515799</td><td>Thermofisher bead mill 24</td></tr><tr><td>台式离心机&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>必须能够达到至少 8000 × g</td></tr><tr><td>黑色底透 96 孔板</td><td>Costar&amp;nbsp;</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>本生灯&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>根据机构健康与安全规定，用于处置受污染设备和材料的容器&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>去离子水&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>eDNA&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>31149</td><td></td></tr><tr><td>滤器装置&amp;nbsp;</td><td>Fisherbrand&amp;nbsp;</td><td>FB12566504</td><td>可根据所用真空泵更换，但孔径必须为 0.2 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>血细胞计数板及盖玻片</td><td>Hawksley&amp;nbsp;</td><td>HC001</td><td>不同型号的血细胞计数板在尺寸和体积上可能不同，请仔细核对并相应调整 CFU 计算&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LB 肉汤&amp;nbsp;</td><td>oxoid&amp;nbsp;</td><td>1.46813</td><td></td></tr><tr><td>甘露醇盐琼脂&amp;nbsp;</td><td>Oxoid&amp;nbsp;</td><td>CM0085B</td><td></td></tr><tr><td>美罗培南</td><td>abcr</td><td>Ab243429</td><td></td></tr><tr><td>猪胃黏蛋白 II 型</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>M2378</td><td></td></tr><tr><td>制霉菌素</td><td>Millipore&amp;nbsp;</td><td>1003352658</td><td></td></tr><tr><td>培养皿&amp;nbsp;</td><td>SLS</td><td>SLS2000</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>假单胞菌分离琼脂</td><td>Millipore&amp;nbsp;</td><td>17208</td><td></td></tr><tr><td>刃天青钠盐&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>199303</td><td></td></tr><tr><td>沙氏葡萄糖琼脂&amp;nbsp;</td><td>Oxoid&amp;nbsp;</td><td>CM0041</td><td></td></tr><tr><td>镊子套装&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>细尖镊子及带齿组织镊，用于转移陶瓷珠</td></tr><tr><td>移液管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>振荡和静置培养箱&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>必须具备温度控制功能</td></tr><tr><td>Sparks 微孔板读数仪</td><td>Tecan&amp;nbsp;</td><td></td><td>用于刃天青检测的微孔板读数仪必须配备合适的荧光滤光片或单色器以检测荧光&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>分光光度计</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>技术琼脂（技术琼脂 No.2）</td><td>Oxoid&amp;nbsp;</td><td>LP0012B&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>四环素</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>T7660</td><td></td></tr><tr><td>紫外交联仪&amp;nbsp;</td><td>Spectroline&amp;nbsp;</td><td>11-992-89</td><td></td></tr><tr><td>真空泵/抽滤瓶</td><td>Fisherbrand&amp;nbsp;</td><td>FB12566504</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>必须能够维持 55 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>YPD 肉汤&amp;nbsp;</td><td>Millipore&amp;nbsp;</td><td>Y1375&amp;nbsp;</td><td>可购买预混成品，也可使用基础原料自行配制</td></tr></tbody></table>

开发一种多微生物菌落生物膜模型以测试囊性纤维化中的抗菌药物

Development of a Polymicrobial Colony Biofilm Model to Test Antimicrobials in Cystic Fibrosis

存在多种用于抗生素测试的细菌生物膜模型。然而，其中许多模型仅限于单一的实验输出结果，例如菌落形成单位或代谢活性。此外，许多生物膜模型未能反映人体宿主环境的生物学和理化特性。这一问题在多种疾病中均较为突出，尤其在囊性纤维化（CF）中最为显著。大量囊性纤维化患者同时遭受慢性和间歇性感染的困扰， 体外抗生素敏感性试验与患者治疗效果的相关性较差。一些生物膜模型采用了与囊性纤维化（CF）肺部相关的培养基，包括合成痰液模拟物，但未考虑该环境中的多微生物特性，而多微生物共存会改变生物膜的结构、生理状态以及微生物对治疗的反应方式。本文所述的气-固界面菌落生物膜模型具有高度可调性，能够同时整合与CF相关的培养基和多微生物环境。该模型还可用于抗菌剂的中通量筛选，并研究其对多微生物动态的影响。模型的检测指标可包括菌落形成单位、代谢活性以及共聚焦显微镜分析。该模型可轻松适配于不同微生物、培养基、温度和可变氧条件，并可用于测试多种化学、生物和物理治疗方法。

固体-空气界面生物膜模型的简便性使得能够同时在多种具有临床相关性的条件下，对大量抗菌剂进行筛选。该模型可在一周内通过菌落形成单位（CFU）计数和代谢活性检测，评估抗生素在单菌种和多菌种生物膜中的有效性。由于该模型的特性，还可方便地调控环境条件，例如改变培养基成分，或将生物膜置于低氧或厌氧环境中。利用该模型，我们已观察到铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）在单一种属与多菌种生物膜中生长时，对囊性纤维化患者常用两种抗生素的耐受性发生变化（图1）。同时，我们还能够确定抗菌治疗如何影响多菌种生物膜内的种群动态（图2）。
为开展这些实验，按照上述方案制备初始接种物，从而形成稳定的单一种类和多微生物生物膜，其CFU/mL具有良好的可重复性及较小的标准差，经单因素或双因素方差分析（one or two-way ANOVA）确认。该模型还表现出一致的生长特性和CFU回收率，并且允许将这些经典微生物学技术与本研究中未实施的其他技术相结合，而无需复杂的处理步骤。这些技术包括活/死染色成像、基质可视化以及分子分析，而其他三维模型难以以如此便捷的方式提供这些功能（图1）31。需要注意的是，当数据以相对于CFU/mL的存活百分比形式展示时，CFU/mL的预期标准差会增大（图1）。在比较抗生素对单一种类与多微生物生物膜的杀灭效果时，所有实现50%杀灭率所需的抗生素浓度均显著升高。对于美罗培南和妥布霉素，需提高2个数量级的抗生素浓度才能达到该杀灭水平（图1）。当使用64 µg/mL妥布霉素处理时，在多微生物生物膜中，P. aeruginosa在S. aureus和C. albicans共存条件下的存活率总体上升；而美罗培南的作用则相反。
用于测定代谢活性的方法可测量整个多菌种生物膜的整体活性，但无法区分每种物种的个体贡献。因此，仅展示单菌种的代谢变化，以演示该模型中代谢活性检测的应用。对于单菌种生物膜，P. aeruginosa 的存活率与代谢活性之间在美罗培南和妥布霉素处理下均表现出显著相关性（图2）。对同一样本同时检测代谢活性和菌落形成单位（CFU）计数，可简便地区分抑菌效应与杀菌效应。对于多菌种生物膜，代谢活性的测定可能提示：针对某一菌种的作用可能会引发生物膜整体代谢活性的升高，从而可能促进其他菌种的微生物生长。
尽管菌落形成单位（CFU）是抗菌敏感性试验的金标准，但在多微生物生物膜中，它们还可用于评估生物膜内的物种组成。通过处理多微生物生物膜中的P. aeruginosa，我们不仅能够显示该生物体的最低生物膜清除浓度50（MBEC50）升高，还能确定这种处理对其他共分离物种的影响（图3）。例如，在使用美罗培南（抗假单胞菌药物）时可观察到这一现象，P. aeruginosa数量减少的同时，S. aureus和C. albicans的CFU增加，导致在某些抗生素浓度暴露下，S. aureus成为占主导地位的生物体（图3A）。这凸显了在治疗特定病原体时，必须考虑生物膜的多微生物特性，因为其他致病物种的种群数量可能因此增加。
<img alt="抗生素存活分析图；美罗培南和妥布霉素浓度对细菌的影响。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67213/67213fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：在固-气界面模型中培养的单菌与多菌生物膜中，P. aeruginosa 对美罗培南和妥布霉素的抗菌耐受性差异。 使用固-气界面模型在SCFM2培养基上培养24小时，建立单菌或与S. aureus及C. albicans共培养的P. aeruginosa PAO1生物膜。生物膜分别暴露于浓度范围为0.125 µg/mL至64 µg/mL的（A）美罗培南或（B）妥布霉素中，并设置无抗生素对照组。测定各生物膜的CFU/mL值。在PIA中测定P. aeruginosa的菌落形成单位（CFU），并以阴性对照组为100%存活率，换算为相对存活百分比。误差线表示标准偏差，每个数据点来自3次生物学重复实验，每次生物学重复包含3次技术重复。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67213/67213fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="代谢活性与抗生素浓度关系图；美罗培南，妥布霉素；剂量-反应分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67213/67213fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：代谢活性的变化 P. aeruginosa 在固体-空气界面模型中，存在美罗培南或妥布霉素时形成的生物膜。 P. aeruginosa PAO1 生物膜在固-气界面模型中的 SCFM2 培养基上培养，涵盖了多种（A）美罗培南或（B) 妥布霉素浓度从 0.125 µg/mL 至 64 µg/mL 同时设置无抗生素对照组。每30分钟使用激发波长540 nm、发射波长590 nm的条件对培养板进行荧光检测。通过计算各抗生素处理样本相对于无抗生素对照组的活性百分比，确定代谢活性百分比。误差线表示标准差，每个数据点来自3次生物学重复，每次生物学重复包含3次技术重复。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67213/67213fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细菌生长抑制柱状图；美罗培南、妥布霉素对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌的影响。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67213/67213fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：抗菌治疗后从多微生物固-气界面模型中回收的铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）、金黄色葡萄球菌（S. aureus）和白色念珠菌（C. albicans）总菌落形成单位（CFU）数量的影响。S. aureus 和 C. albicans 在SCFM2培养基的固-气界面模型上培养。P. aeruginosa 被加入后，向生物膜中添加浓度范围为0.125 µg/mL至64 µg/mL的（A）美罗培南或（B）妥布霉素，并设置无抗生素对照组。测定各生物膜的CFU/mL值。误差线表示标准偏差，每个数据点来自3次生物学重复，每次生物学重复包含3次技术重复。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67213/67213fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充图1：固-气界面模型的建立与实验流程。 固-气界面模型的建立、生物膜破坏及输出结果的图示。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67213/Supplementary%20figure%201.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

该方法可用于建立囊性纤维化中的多微生物生物膜模型，以供科研和临床实验室进行抗菌敏感性测试。该模型在多种检测指标下均能提供准确且可靠的结果。

存在多种用于抗生素测试的细菌生物膜模型。然而，这些模型中的许多仅限于单一的实验输出，例如……

我们的研究重点是利用复杂的多微生物模型，来理解囊性纤维化环境中微生物之间的复杂相互作用，以及这些相互作用如何导致微生物对抗菌药物耐受性的增加。我们希望利用这些知识开发新型的治疗干预手段。生物膜领域的进展正由可视化技术、定量方法以及生物物理手段的结合所推动。这包括诸如3D OrbiSIMS等技术，可实现微米至纳米级的空间分辨率。本研究旨在构建一种多微生物模型，以维持一定程度的复杂性，真实反映囊性纤维化（CF）患者抗生素治疗中所观察到的情况。该模型还将提高实验通量，获得更具生物学意义的结果，并可适应其他菌株和不同实验条件。该方案为囊性纤维化病原体提供了相关的测试环境。该方法具有较强的稳健性，通量相对较高，且适用于多种终点检测，可支持开展更复杂的实验研究。本研究显示，与囊性纤维化相关的环境会改变微生物的易感性。此外，存在的真菌类型也可能改变铜绿假单胞菌的易感性，这可能具有重要的临床意义。首先，取处于对数生长期的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的培养物。使用微量移液器，将每种液体培养物各1毫升转移至单独的无菌1.5毫升离心管中。在8,000 × g条件下离心2分钟，使细菌或真菌形成沉淀。随后，用移液器吸除每管中的上清液，并将沉淀物重悬于1毫升PBS中。将重悬的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）细胞在PBS中按1:10稀释。然后使用分光光度计，在600纳米波长下测定光密度。将冲洗后的白色念珠菌（Candida albicans）样品在PBS中按1:100稀释后，用移液器将每种样品各10微升加入血细胞计数板的两个独立计数室中。然后用 PBS 将白色念珠菌样品调整至每毫升 1 × 10⁸ CFU。为制备用于接种生物膜的菌液，使用 PBS 调整铜绿假单胞菌、白色念珠菌和金黄色葡萄球菌的接种物浓度。对于单一种类生物膜，将 10 微升稀释后的微生物菌液移取至置于 6 孔板中 SCFM2 1.5% 技术琼脂上的聚碳酸酯圆片中心。在处理或破坏之前，将培养板在37摄氏度下静置培养24小时。对于多微生物生物膜，将10微升的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和10微升的白色念珠菌（Candida albicans）依次叠加在同一张聚碳酸酯膜上。将接种后的膜在37摄氏度下静置培养24小时。孵育后，使用无菌镊子将聚碳酸酯圆片转移至新鲜的SCFM2 1.5%技术琼脂平板上。在已形成的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和白色念珠菌（Candida albicans）生物膜上方，加入10微升浓度为1×10⁴ CFU/毫升的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）稀释液。于37°C继续孵育24小时。首先，取铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的固态空气界面菌落生物膜。向培养皿中加入直径为 2.8 毫米的陶瓷珠，并对培养皿进行紫外交联。使用经火焰灭菌的镊子，将五颗陶瓷珠转移至一支无菌的 2 毫升匀浆管中。用移液器将1毫升PBS加入2毫升的匀浆管中。涡旋振荡管子至少10秒，或直至通过肉眼观察确认生物膜已从聚碳酸酯圆片上完全去除。生物膜去除后，取出聚碳酸酯圆片，然后将含有珠子的管子放入匀浆器中，在每秒6米的速度下进行两次、每次10秒的拍击处理，两次之间间隔10秒。现在将匀浆管中分散的生物膜倒入含有 4 毫升 PBS 的 7 毫升比约管中，最终体积为 5 毫升。在 8,000 × g 离心 2 分钟。然后将剩余液体转移至 7 毫升比约管中，以确保所有液体均被转移。将200微升破坏后的生物膜加入到透明底黑色96孔板中，然后每孔加入10微升0.02%刃天青溶液。将经刃天青处理的生物膜置于酶标仪中，在37°C下孵育。每次进行荧光检测前，以200 RPM转速振荡30分钟，每次振荡10秒。使用540纳米的激发波长和590纳米的发射波长测定荧光。与多菌种生物膜相比，单菌种生物膜实现50%杀灭所需的美罗培南和妥布霉素浓度显著更低，后者需要抗生素浓度增加两个数量级。在含64微克/毫升妥布霉素的多菌种生物膜中，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的存活率升高，而在相同条件下，美罗培南则导致其存活率下降。在单一种类生物膜中，当铜绿假单胞菌经美罗培南和妥布霉素处理时，其存活率与其代谢活性之间表现出显著相关性。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

开发多微生物菌落生物膜模型以测试囊性纤维化中的抗菌剂

该实验流程可用于对囊性纤维化患者肺部细菌生物膜的既定 体外模型进行抗生素敏感性检测。使用该模型可提高MBEC（最小生物膜清除浓度）检测的临床有效性。...

囊性纤维化肺部中Pseudomonas aeruginosa和Staphylococcus aureus生物膜的离体模型抗生素疗效检测

本方案描述了一种与囊性纤维化（CF）肺部相关的四物种多微生物生物膜模型，可用于探究细菌种间相互作用的影响。...

培养与囊性纤维化相关的多微生物生物膜以研究群落表型

本研究概述了一种构建多微生物聚集性生物膜模型的框架，并优化了RNA提取方案，以评估反映囊性纤维化肺部环境的铜绿假单胞菌（Pseudomonas...

用于研究感染相关基因表达的囊性纤维化聚集生物膜模型

升结肠支架腹膜炎（CASP）是一种高度标准化的啮齿类动物多微生物性腹腔脓毒症模型。本文描述了CASP的手术操作过程。CASP模型及其变体可用于系统性地研究与脓毒症相关的各种问题。...

升结肠支架腹膜炎（CASP）——一种用于多微生物性腹腔脓毒症的标准化模型

目前的临床诊断中，抗菌药物敏感性检测依赖于病原菌在营养丰富且富氧条件下的浮游生长。本研究采用一种替代性的人工痰液培养基，以模拟囊性纤维化患者肺部更具代表性的富氧及微需氧环境，从而研究铜绿假单胞菌（Pseudomonas...

使用人工痰液培养基在更贴近囊性纤维化肺部环境的条件下测试抗生素对Pseudomonas aeruginosa的疗效

我们描述了利用琼脂珠方法在小鼠模型中建立持续性长期慢性Pseudomonas...

长期慢性 铜绿假单胞菌 小鼠呼吸道感染

本文介绍了快速筛选和表征具有抗菌活性酶的实验方案。微载玻片扩散法和染料释放法利用目标细菌作为底物，分别对酶活性进行定性和定量评估。...

定性与定量检测及表征蛋白质类抗菌物质的实验方法

本方案描述了利用载玻片培养室模型，在暴露于宿主因子后对生物膜形成过程进行可视化观察的方法。该模型可实现对生物膜发育过程的直接观察，并可利用计算机软件对生物膜参数进行分析。...

利用腔室盖玻片模型可视化痰液对生物膜形成的影响

本文所述方法可通过非侵入性生物发光成像（BLI）技术，对小鼠肺部由IL-8启动子依赖性炎症激活进行可视化观察。在递送荧光素酶报告载体后，同一动物可在长达两个月的时间内多次接受BLI检测。...

一种白细胞介素-8瞬时转基因小鼠模型用于 体内 长期监测炎症反应

本文介绍了一种利用无毛小鼠建立的新型糖尿病小鼠模型，可用于对发光假单胞菌（Pseudomonas...

来到光的一侧：体内监测糖尿病无毛小鼠模型慢性伤口中铜绿假单胞菌的生物膜感染

了解多微生物菌落生物膜模型的建立方法，用于囊性纤维化中的抗菌剂敏感性测试。该模型利用Pseudomonas aeruginosa、Staphylococcus aureus和Candida albicans，通过荧光测量评估代谢活性，为临床相关的高通量筛选提供可靠平台。

开发一种多微生物菌落生物膜模型以测试囊性纤维化中的抗菌药物

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