开发一种多微生物菌落生物膜模型以测试囊性纤维化中的抗菌药物

我们的研究重点是利用复杂的多微生物模型，来理解囊性纤维化环境中微生物之间的复杂相互作用，以及这些相互作用如何导致微生物对抗菌药物耐受性的增加。我们希望利用这些知识开发新型的治疗干预手段。生物膜领域的进展正由可视化技术、定量方法以及生物物理手段的结合所推动。

这包括诸如3D OrbiSIMS等技术，可实现微米至纳米级的空间分辨率。本研究旨在构建一种多微生物模型，以维持一定程度的复杂性，真实反映囊性纤维化（CF）患者抗生素治疗中所观察到的情况。该模型还将提高实验通量，获得更具生物学意义的结果，并可适应其他菌株和不同实验条件。

该方案为囊性纤维化病原体提供了相关的测试环境。该方法具有较强的稳健性，通量相对较高，且适用于多种终点检测，可支持开展更复杂的实验研究。

本研究显示，与囊性纤维化相关的环境会改变微生物的易感性。此外，存在的真菌类型也可能改变铜绿假单胞菌的易感性，这可能具有重要的临床意义。首先，取处于对数生长期的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的培养物。

使用微量移液器，将每种液体培养物各1毫升转移至单独的无菌1.5毫升离心管中。在8,000 × g条件下离心2分钟，使细菌或真菌形成沉淀。随后，用移液器吸除每管中的上清液，并将沉淀物重悬于1毫升PBS中。

将重悬的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）细胞在PBS中按1:10稀释。然后使用分光光度计，在600纳米波长下测定光密度。将冲洗后的白色念珠菌（Candida albicans）样品在PBS中按1:100稀释后，用移液器将每种样品各10微升加入血细胞计数板的两个独立计数室中。

然后用 PBS 将白色念珠菌样品调整至每毫升 1 × 10⁸ CFU。为制备用于接种生物膜的菌液，使用 PBS 调整铜绿假单胞菌、白色念珠菌和金黄色葡萄球菌的接种物浓度。对于单一种类生物膜，将 10 微升稀释后的微生物菌液移取至置于 6 孔板中 SCFM2 1.5% 技术琼脂上的聚碳酸酯圆片中心。

在处理或破坏之前，将培养板在37摄氏度下静置培养24小时。对于多微生物生物膜，将10微升的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和10微升的白色念珠菌（Candida albicans）依次叠加在同一张聚碳酸酯膜上。将接种后的膜在37摄氏度下静置培养24小时。

孵育后，使用无菌镊子将聚碳酸酯圆片转移至新鲜的SCFM2 1.5%技术琼脂平板上。在已形成的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和白色念珠菌（Candida albicans）生物膜上方，加入10微升浓度为1×10⁴ CFU/毫升的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）稀释液。于37°C继续孵育24小时。

首先，取铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的固态空气界面菌落生物膜。向培养皿中加入直径为 2.8 毫米的陶瓷珠，并对培养皿进行紫外交联。使用经火焰灭菌的镊子，将五颗陶瓷珠转移至一支无菌的 2 毫升匀浆管中。

用移液器将1毫升PBS加入2毫升的匀浆管中。涡旋振荡管子至少10秒，或直至通过肉眼观察确认生物膜已从聚碳酸酯圆片上完全去除。生物膜去除后，取出聚碳酸酯圆片，然后将含有珠子的管子放入匀浆器中，在每秒6米的速度下进行两次、每次10秒的拍击处理，两次之间间隔10秒。

现在将匀浆管中分散的生物膜倒入含有 4 毫升 PBS 的 7 毫升比约管中，最终体积为 5 毫升。在 8,000 × g 离心 2 分钟。然后将剩余液体转移至 7 毫升比约管中，以确保所有液体均被转移。

将200微升破坏后的生物膜加入到透明底黑色96孔板中，然后每孔加入10微升0.02%刃天青溶液。将经刃天青处理的生物膜置于酶标仪中，在37°C下孵育。每次进行荧光检测前，以200 RPM转速振荡30分钟，每次振荡10秒。

使用540纳米的激发波长和590纳米的发射波长测定荧光。与多菌种生物膜相比，单菌种生物膜实现50%杀灭所需的美罗培南和妥布霉素浓度显著更低，后者需要抗生素浓度增加两个数量级。在含64微克/毫升妥布霉素的多菌种生物膜中，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的存活率升高，而在相同条件下，美罗培南则导致其存活率下降。

在单一种类生物膜中，当铜绿假单胞菌经美罗培南和妥布霉素处理时，其存活率与其代谢活性之间表现出显著相关性。