Name: 测定人腺苷脱氨酶 1 酶的血清稳定性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:25:00.000+00:00
Duration: 4 min 17 s
Description: 学习评估人腺苷脱氨酶1血清稳定性的方法，用于预测其药代动力学特征和治疗应用潜力。本研究通过蛋白质工程技术优化酶稳定性，为癌症治疗中减少给药剂量和提高疗效提供实验依据。

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本工作由美国国立卫生研究院 [1DP2CA280622-01] 和 Biolocity 资助支持。我们感谢 Maria Jennings 博士和 Andrea Fox 提供 HsADA1 和 HsKYNase 表达载体。

1. 血清孵育
<ol>
	<li>在 1× PBS pH 7.4（1× PBS）中配制 HsADA1 的 10 倍储备液，终浓度为 10 µM。解冻 15 mL 混合人血清，并预热至 37 °C。同时将 50 mL 的 1× PBS 预热至 37 °C。</li>
	<li>在低吸附微量离心管中，将 100 µL 的 10× HsADA1 储备液加入 900 µL 混合人血清中，制备酶-血清孵育混合液，记为“酶 + 血清”混合液。另取一支低吸附微量离心管，将 100 µL 的 10× HsADA1 储备液加入 900 µL 的 1× PBS 中，作为无血清对照，记为“酶 + 1× PBS”混合液。每种混合液中 HsADA1 的终浓度为 1 µM。</li>
	<li>另设一个对照组：在低吸附微量离心管中，将 100 µL 的 1× PBS 与 900 µL 混合人血清混合，作为“酶 + 血清”混合液的无酶对照。此外，制备 1 mL 的 1× PBS 作为空白对照，作为“酶 + 1× PBS”混合液的无酶对照。</li>
	<li>从步骤 1.2 中每种混合液取 100 µL 分装至不同的低吸附管中，加入 100 µL 含 30%（v/v）甘油的 1× PBS 进行 1:1 稀释。用液氮速冻后于 -80 °C 保存。这些样品为第 0 天时间点，其中 HsADA1 浓度为 500 nM。对步骤 1.3 中的无酶对照混合液重复此操作。用透明封膜密封所有酶液及对照混合液，置于 37 °C 培养箱中孵育。</li>
	<li>孵育 24 小时后，取每种孵育样品 100 µL，加入 100 µL 含 30%（v/v）甘油的 1× PBS 进行 1:1 稀释。用液氮速冻后于 -80 °C 保存。这些样品为第 1 天时间点。将所有酶液及对照混合液重新放回 37 °C 培养箱继续孵育。分别在 72 小时和 120 小时重复此步骤。 
	注意：分装后的样品不一定需要速冻。用户也可在取样后立即进行基于微孔板的检测，但每次检测时均需重新配制新鲜的标准曲线和腺苷底物储备液。</li>
</ol>
2. 基于微孔板的检测方法
<ol>
	<li>通过设置动力学读数程序（图2）来准备酶标仪，以最短读数间隔在260 nm波长下连续测定吸光度30分钟，并将酶标仪预热至37 °C。</li>
	<li>将所有收集的样品在冰上解冻。使用预热至37 °C的1×PBS作为稀释液，在低吸附微量离心管中将每个解冻后的样品按1:10比例稀释。这些样品中的HsADA1终浓度为50 nM。</li>
	<li>同样将非酶血清对照样品用1×PBS进行10倍稀释。此外，通过将66.8 mg腺苷加入50 mL的1×PBS中配制5 mM腺苷储备液。取400 µL腺苷储备液加入7,600 µL的1×PBS中，配制成250 µM的腺苷稀释液，并在培养箱中预热至37 °C。</li>
	<li>向96孔紫外兼容微孔板中，每孔加入160 µL的250 µM腺苷稀释液和40 µL稀释后的蛋白样品，每个样本设三个复孔，总体积为200 µL。此步骤中腺苷的终浓度为200 µM，酶的终浓度为10 nM。</li>
	<li>对对照样品重复稀释操作：每孔加入40 µL稀释后的血清或1×PBS对照样品以及160 µL的250 µM腺苷稀释液，设三个复孔。此步骤中腺苷终浓度同样为200 µM，但不含酶。 
	注意：建议先将所有稀释后的酶样品和对照样品单独加入微孔板中，再使用12通道移液器加入腺苷底物，以缩短总加样时间。此外，本步骤必须使用紫外透光板，以避免微孔板本身干扰吸光度信号的测定。</li>
	<li>在37 °C条件下，连续30分钟测定各孔在260 nm处的吸光度。完成后，将数据导出至电子表格进行后续分析。</li>
</ol>
3. 微孔板读数仪数据的分析
<ol>
	<li>确定微孔板数据在最初几分钟内吸光度数据随时间变化的线性区域斜率。对于血清稀释的样品，对应前约 120 秒；对于 1x PBS 稀释的样品，对应前约 270 秒。该吸光度下降的斜率将为负值，单位为每秒吸光度单位的变化（ΔA260/s）。</li>
	<li>从酶 + 血清数据的斜率中减去由混合人血清组成的阴性对照的斜率。对酶 + 1x PBS 混合物进行相同操作，即减去 1x PBS 对照的斜率。</li>
	<li>将所有校正后的斜率归一化至 t=0 h 时的原始斜率，使用公式 1 计算剩余活性分数。 
	<img alt="活性分数公式；分光分析中吸光度变化的比值。" src="/files/ftp_upload/67216/67216eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1">    公式 1</li>
	<li>绘制剩余活性分数随时间变化的曲线。</li>
</ol>

Evaluating Serum Stability of HsADA1: A Microplate-Based Approach

<ol><li>Valero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+serum-stable+RNA+aptamer+specific+for+SARS-COV-2+neutralizes+viral+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A serum-stable RNA aptamer specific for SARS-COV-2 neutralizes viral entry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (50), e2112942118(2021).</li>
<li>Iannuzo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+identifies+synthetic+peptides+with+antibacterial+activity+against+mycobacterium+abscessus+and+serum+stability%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening identifies synthetic peptides with antibacterial activity against mycobacterium abscessus and serum stability.</a> ACS Omega. 7 (27), 23967-23977 (2022).</li>
<li>Ma, M. T., Jennings, M. R., Blazeck, J., Lieberman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytically+active+holo+homo+sapiens+adenosine+deaminase+i+adopts+a+closed+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallograph+Sect+D%22%5BJournal%5D)">Catalytically active holo homo sapiens adenosine deaminase i adopts a closed conformation.</a> Acta Crystallograph Sect D. 78 (1), 91-103 (2022).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+4+nucleosides+via+one+reference+compound+in+chinese+cordyceps+by+hplc-uv+at+equal+absorption+wavelength%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Prod+Comm%22%5BJournal%5D)">Determination of 4 nucleosides via one reference compound in chinese cordyceps by hplc-uv at equal absorption wavelength.</a> Natural Prod Comm. 18 (3), 1934578X231161410(2023).</li>
<li>Whitmore, K. V., Gaspar, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine+deaminase+deficiency+-+more+than+just+an+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adenosine deaminase deficiency - more than just an immunodeficiency.</a> Front Immunol. 7, 314(2016).</li>
<li>Jennings, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+expression+and+purification+of+a+human+adenosine+deaminase+in+E.+coli+and+characterization+of+its+asp8asn+variant%5BTitle%5D)+AND+%22Prot+Express+Purificat%22%5BJournal%5D)">Optimized expression and purification of a human adenosine deaminase in E. coli and characterization of its asp8asn variant.</a> Prot Express Purificat. 213, 106362(2024).</li>
<li>Blazeck, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bypassing+evolutionary+dead+ends+and+switching+the+rate-limiting+step+of+a+human+immunotherapeutic+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Catalysis%22%5BJournal%5D)">Bypassing evolutionary dead ends and switching the rate-limiting step of a human immunotherapeutic enzyme.</a> Nat Catalysis. 5 (10), 952-967 (2022).</li>
<li>Lu, J., Grenache, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+rapid%2C+microplate-based+kinetic+assay+for+measuring+adenosine+deaminase+activity+in+body+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Development of a rapid, microplate-based kinetic assay for measuring adenosine deaminase activity in body fluids.</a> Clinica Chimica Acta. 413 (19), 1637-1640 (2012).</li>
<li>Maciel, L. G., Dos Anjos, J. V., Soares, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+low-cost+evaluation+of+hydroxykynurenine+activity%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Fast and low-cost evaluation of hydroxykynurenine activity.</a> MethodsX. 7, 100982(2020).</li>
<li>Bokman, A. H., Schweigert, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-hydroxyanthranilic+acid+metabolism.+Iv.+Spectrophotometric+evidence+for+the+formation+of+an+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">3-hydroxyanthranilic acid metabolism. Iv. Spectrophotometric evidence for the formation of an intermediate.</a> Arch Biochem Biophys. 33 (2), 270-276 (1951).</li>
<li>Tanford, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTanford%2C+C+%22Advances+in+protein+chemistry%22">Advances in protein chemistry</a>. 23, Academic Press. 121-282 (1968).</li>
<li>Tritsch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validity+of+the+continuous+spectrophotometric+assay+of+kalckar+for+adenosine+deaminase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Validity of the continuous spectrophotometric assay of kalckar for adenosine deaminase activity.</a> Anal Biochem. 129 (1), 207-209 (1983).</li>
<li>Gracia, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+catalytic+site+structural+gate+of+adenosine+deaminase+allosterically+modulates+ligand+binding+to+adenosine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">The catalytic site structural gate of adenosine deaminase allosterically modulates ligand binding to adenosine receptors.</a> FASEB J. 27 (3), 1048-1061 (2013).</li>
<li>Kalckar, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+spectrophotometry+of+purine+compounds+by+means+of+specific+enzymes%3A+Iii.+Studies+of+the+enzymes+of+purine+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential spectrophotometry of purine compounds by means of specific enzymes: Iii. Studies of the enzymes of purine metabolism.</a> J Bio Chem. 167 (2), 461-475 (1947).</li>
<li>Hartwick, R., Jeffries, A., Krstulovic, A., Brown, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+assay+for+adenosine+deaminase+using+reverse+phase+high+pressure+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatographic+Sci%22%5BJournal%5D)">An optimized assay for adenosine deaminase using reverse phase high pressure liquid chromatography.</a> J Chromatographic Sci. 16 (9), 427-435 (1978).</li>
<li>Paul, M. K., Grover, V., Mukhopadhyay, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merits+of+hplc-based+method+over+spectrophotometric+method+for+assessing+the+kinetics+and+inhibition+of+mammalian+adenosine+deaminase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">Merits of hplc-based method over spectrophotometric method for assessing the kinetics and inhibition of mammalian adenosine deaminase.</a> J Chromatography B. 822 (1), 146-153 (2005).</li>
<li>Ubbink, J. B., Vermaak, W. J. H., Bissbort, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+liquid+chromatographic+assay+of+human+lymphocyte+kynureninase+activity+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatography+B%3A+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">High-performance liquid chromatographic assay of human lymphocyte kynureninase activity levels.</a> J Chromatography B: Biomed Sci Appl. 566 (2), 369-375 (1991).</li>
<li>Tsentalovich, Y. P., Snytnikova, O. A., Forbes, M. D. E., Chernyak, E. I., Morozov, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemical+and+thermal+reactivity+of+kynurenine%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Photochemical and thermal reactivity of kynurenine.</a> Exp Eye Res. 83 (6), 1439-1445 (2006).</li>
<li>Demain, A. L., Vaishnav, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+proteins+by+microbes+and+higher+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms.</a> Biotechnol Adv. 27 (3), 297-306 (2009).</li>
<li>Gräslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein production and purification.</a> Nat Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Faber, M. S., Whitehead, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data-driven+engineering+of+protein+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Data-driven engineering of protein therapeutics.</a> Curr Opin Biotechnol. 60, 104-110 (2019).</li>
<li>Das, S., Zhao, L., Elofson, K., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+stabilization+by+virus-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Enzyme stabilization by virus-like particles.</a> Biochemistry. 59 (31), 2870-2881 (2020).</li>
</ol>

JB 和 MRJ 是与腺苷脱氨酶和/或犬尿氨酸酶相关的专利或专利申请的发明人。其余所有作者均无利益冲突需要披露。

本实验方案通过检测底物转化为产物过程中吸光度的变化来评估酶的活性。因此，底物和产物必须具有不同的光谱特征。腺苷和肌苷在260–265 nm波长范围内的光谱特征和消光系数均明显不同，符合这一要求6,8,12,13。本检测方法受到多项前期研究的启发。例如，Kalackar 利用265 nm处吸光度的变化作为腺苷脱氨酶活性的直接指标14。Gracia 等人和 Lu 等人则采用基于比尔-朗伯定律的方法，将初始反应速率与腺苷和肌苷之间消光系数的差异相关联8,13。类似地，OH-Kyn 和 OH-AA 也具有不同的光谱特征：OH-Kyn 在379 nm处有强吸收，而 OH-AA 则无明显吸收9,10。代谢物的吸光度光谱可通过多种酶标仪的全波长扫描轻松检测，从而帮助使用者判断是否可以追踪酶促反应的进程。如前所述，Lu 等人曾分析过天然HsADA1在不同体液中的稳定性，Jennings 等人也采用非常相似的方法评估了重组HsADA1及突变酶在血清中的稳定性6,8。本方法与 Jennings 等人的方法类似，其独特之处在于可使用重组表达的酶，而非天然来源的酶。因此，该方法可推广应用于自然界中不存在的突变蛋白的研究。
对于无法使用基于微孔板的吸光度检测法测定的产物/底物组合，本方案可进行调整，采用其他多种替代性分析方法来追踪动力学检测中的底物降解或产物生成过程，例如高效液相色谱法（HPLC），该方法此前已被用于评估腺苷脱氨酶和犬尿氨酸酶的动力学特性15,16,17。唯一需要改变的是在特定时间后测定剩余底物或生成产物的方法（若非连续测定）。检测方法的选择自然取决于目标酶所催化的反应类型，而选择时还需重点考虑所选分析方法与稀释后人血清的兼容性。同样重要的是分析所有目标样品所需的总时间，而采用微孔板检测法的一个主要优势在于能够同时轻松分析多达96个样品的降解速率。
对于特定的目标酶，需要优化检测参数，例如微孔板中酶和底物的浓度。在本研究进行的所有检测中，所选用的底物浓度均比其 Km 值高一个数量级（1.15–1.26 个数量级）。野生型 HsADA1 对腺苷的 Km 值约为 14 µM，因此微孔板中最终使用的腺苷浓度为 200 µM3。类似地，所测试的工程化 HsKYNase 变体对 OH-Kyn 的 Km 值约为 22 µM，微孔板中最终使用的 OH-Kyn 浓度为 400 µM7。微孔板检测中底物浓度选择的一个重要要求是：在给定范围内，底物需符合比尔-朗伯定律，使得吸光度的降低能够与底物降解呈线性相关（补充图 1 和 补充图 2）。这种线性关系避免了将吸光度变化转换为底物浓度的必要性，因为该转换不会改变剩余活性分数。
关于酶浓度，主要考虑的标准是底物降解程度应显著高于背景信号。对于HsADA1和改造后的HsKYNase，我们均采用先前发表的文献数值以获得具有代表性的结果6,7。如本研究所示，使用较高酶浓度并缩短反应时间是可行的，同样，使用较低酶浓度并延长反应时间也可行。通常情况下，较长反应时间/较低酶浓度可能获得更可重复的结果，除非底物本身易于降解。在这方面，犬尿氨酸（kynurenine）及其衍生物（包括OH-Kyn）在室温下会相对较快地降解，导致底物混合物明显变黄18。对于其他酶，可通过简单的浓度梯度实验来确定具有最优反应曲线和最佳背景分离效果的酶浓度。对HsADA1进行该浓度梯度实验表明，在1–10 nM范围内可实现最大的背景分离效果（补充图3）。对改造后的HsKYNase进行相同的浓度梯度实验也显示出类似趋势，在2 µM时背景分离效果最佳（补充图4）。然而，两种检测方法（HsADA1与HsKYNase）的灵敏度并不相同。对于HsADA1而言，即使微孔板上的酶浓度仅为方案中所用浓度的十分之一，仍可在统计学显著水平上与背景信号区分开来（补充图3）。这一情况在HsKYNase中并不成立，这意味着当HsKYNase活性损失超过90%后，可能难以对其残余活性进行准确定量评估。这体现了微孔板读数法的一种潜在局限性。
此外，我们对 HsKYNase 的一个观察发现，在加入样品到酶标板后，酶 + 1x PBS 样品与 1x PBS 对照之间的吸光度读数立即出现差距（图 5B、D），该差距在所有时间点均存在。由于在测试经加热失活的酶（95 °C 加热 10 分钟）时也观察到了这一现象，因此我们推断该差距并非由酶介导的底物降解所致（补充图 5）。尽管我们在分析中仍使用了原始对照的吸光度值，但未来的研究可采用失活酶作为对照，以消除这一差异。然而，应考虑购买或制备目标酶所需的成本。对于 HsKYNase 和 HsADA1，测试样品的初始吸光度值均存在一定程度的变异，部分样品的起始吸光度低于相应的对照（图 3 和 图 5）。这可能部分归因于向所有蛋白样品中加入底物后存在操作延迟，随后才将样品加载至酶标仪。但由于所用底物浓度远高于所用酶的 Km 值，因此预计不会对观察到的斜率产生底物浓度依赖性的影响。
在方案与代表性结果部分，样品在指定时间点进行分装，取样时间根据酶的活性变化特征而定。该取样方案取决于目标酶在血清中的活性变化情况。若酶的活性迅速丧失，则需要采用较短的取样间隔，例如所测试的HsKYNase_66-W102H-T333N突变体即属此类情况；而对于血清稳定性较高的酶，则可采用较长的取样间隔。因此，针对一种新的目标酶，建议先开展预实验，分别在较短（如1 h、2 h等）和较长（如24 h、48 h等）的时间间隔取样，以全面评估其血清稳定性特征。当然，随着酶的稳定性增强，血清失活相对于肾清除或其他清除机制而言，其影响可能逐渐减弱 体内 蛋白质清除
由于犬尿氨酸酶（kynureninases）与人腺苷脱氨酶1（HsADA1）存在差异，我们对多个检测参数进行了调整，包括在血清或1×PBS中孵育时的酶浓度、取样间隔、微孔板检测中的酶浓度、微孔板检测中的底物浓度，以及底物本身。具体修改如下：酶的10×储备液浓度为100 µM，用血清或1×PBS稀释后，工作浓度为10 µM。血清孵育法中的取样间隔也进行了调整，因为HsKYNase在血清中的失活速度比HsADA1更快，因此该方法设置了0.5小时、3小时和24小时三个取样时间点。此外，HsKYNase样品未进行速冻处理，而是直接用于微孔板检测。酶标仪设置为在379 nm波长处读数，以监测酶促反应进程。在基于微孔板的检测中，研究HsKYNase酶的另一个重要差异在于底物的配制：通过将4.5 mg OH-Kyn溶解于10 mL 1×PBS中，配制2 mM的OH-Kyn储备液；同时，将6 mg磷酸吡哆醛（PLP，HsKYNase的辅因子）溶解于1 mL 1×PBS中，制成100×PLP储备液。通过将2.5 mL OH-Kyn储备液加入7.5 mL 1×PBS中，并加入100 µL 100×PLP储备液，配制得到500 µM的OH-Kyn工作液。进行微孔板检测时，将80 µL 500 µM OH-Kyn稀释液与20 µL分装的蛋白样品或阴性对照品，在96孔紫外兼容微孔板中每组设三个复孔。最终OH-Kyn浓度为400 µM，酶的终浓度为2 µM，随后在37 °C条件下连续测定30分钟内379 nm处的吸光度。与HsADA1不同的是，HsKYNase在上机检测前未进行稀释。
尽管本实验方案相对简便，但在制备原始酶储备液时可能存在一定挑战。代表性结果部分所用的所有酶均在大肠杆菌（E. coli）中表达，并通过镍基亲和层析结合尺寸排阻层析（SEC）进行纯化。已有多种文献详细描述了我们纯化方法的替代方案，涵盖不同的宿主生物及下游处理流程19,20。本检测的核心目的是评估酶在混合人血清中维持其活性的能力。本方法学中的一个假设是，酶活性的丧失是不可逆的，即从血清中移除失活的酶并不能恢复其活性。这一点至关重要，因为在本方案中，我们在快速冷冻前以及解冻后，会进一步用甘油和1×PBS稀释酶混合物。如果酶活性的丧失在去除血清后可逆，则这些额外的稀释步骤将导致本检测无法捕捉到该现象。若用户对此存在顾虑，可采取以下措施：1）在所有底物和待测样品溶液的配制过程中，使用混合人血清替代1×PBS作为稀释液；2）省略快速冷冻和添加甘油的步骤，直接对样品进行处理，以维持酶所处的原始环境。最后，尽管本检测可用于探究血清对酶活性的特异性影响，但无法得出关于此类影响具体机制的结论。酶活性的丧失究竟是由酶蛋白去折叠、聚集、辅因子丢失，还是血清蛋白酶切割所致，仍需进一步研究。同理，对于在1×PBS中孵育的酶，本检测亦无法提供任何机制性结论。
在开发蛋白质生物制剂作为治疗药物的过程中，保持其在血清中的活性是一项重要的评价指标21。若一种治疗用酶在体内迅速失活，则需反复给药才能获得临床疗效。本研究提供了一种体外（in vitro）检测方法，可用于对酶的血清稳定性进行定量筛选。若结合定向进化技术，可进一步筛选并选育出具有更优血清稳定性的酶，从而提高其临床转化潜力。此外，我们预计该方案也可适用于更复杂的体系，例如用于检测酶被包封状态下的血清稳定性。Das 等人曾将该检测方法应用于多种封装在病毒样颗粒中的不同酶，并在多种变性条件下（如有机溶剂环境）测试了其稳定性22。

以下方法可让用户定量评估酶在暴露于模拟静脉注射后所遇条件时，保持其活性的能力。体外方法模拟了此类体内环境，包括将酶在37 °C下与混合人血清共同孵育，并在不同时间点分析酶活性的保留情况。我们将酶在这些条件下保持活性的能力称为其血清稳定性，而酶活性的分析方法则利用了酶底物与其反应产物在吸光度上的差异。血清稳定性的概念不仅适用于酶，也已应用于其他多种治疗方式。例如，此前通过监测RNA适配体在胎牛血清中孵育后的降解情况，评估了靶向新冠病毒刺突蛋白的RNA适配体的血清稳定性1。抗菌肽在与混合人血清孵育后抑制细菌生长的能力也已被评估2。
HsADA1 是一种催化腺苷或2-脱氧腺苷分别转化为肌苷或2-脱氧肌苷的酶3。腺苷在260 nm处有吸收峰，而肌苷在250 nm处的吸收最强4。当HsADA1加入腺苷后，可在酶标仪上通过260 nm处吸收强度的降低检测到吸收峰的这一变化。HsADA1酶在人体中具有重要意义，其缺乏会导致严重的联合免疫缺陷症（ADA-SCID）5。HsADA1的牛同源物BtADA1可作为酶替代疗法用于治疗ADA-SCID，我们先前已证明野生型HsADA1在与人混合血清孵育后会失去活性，这可能限制其作为治疗剂的应用6。因此，我们选择野生型HsADA1酶来演示测定酶在血清中稳定性的实验流程。HsADA1的详细纯化方法此前已有报道6。
在以下方案中（详见图1），我们演示了如何将野生型HsADA1与混合人血清在37 °C下共同孵育。在此期间，于规定时间点采集测试样品，并迅速冷冻以供后续分析。待所有样品采集完成后，进行微孔板检测，将每个样品与底物混合，通过检测吸光度的下降程度来反映酶活性的保留情况。本文展示了HsADA1在血清中稳定性的代表性结果。由于该指标可能与评估其他酶的潜在治疗价值相关，我们还讨论了将本方案适用于改造后的Homo sapiens犬尿氨酸酶（HsKYNase）及其他酶类时需考虑的因素。HsKYNase是一种参与色氨酸代谢的酶，能够将色氨酸代谢产物犬尿氨酸和羟基犬尿氨酸（OH-Kyn）分别降解为邻氨基苯甲酸和羟基邻氨基苯甲酸（OH-AA）。通过酶介导调控色氨酸代谢可能具有治疗意义7。

<table><tbody><tr><td>腺苷&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9251-25G</td><td>25 g</td></tr><tr><td>BioTek Synergy HT 微孔板读板仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBind 微量离心管：蛋白级&amp;nbsp;</td><td>菲舍尔科技&amp;nbsp;</td><td>13-698-795</td><td>2 mL</td></tr><tr><td>甘油</td><td>菲舍尔科技&amp;nbsp;</td><td>G33-4</td><td>4 L</td></tr><tr><td>HsKYNase66-W102H-T333N</td><td>本实验室制备</td><td></td><td></td></tr><tr><td>人混合血清</td><td>MP Biomedicals</td><td>92931149</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>羟基犬尿氨酸</td><td>Cayman Chemicals</td><td>27778</td><td></td></tr><tr><td>肌苷&amp;nbsp;</td><td>TCI</td><td>I0037</td><td>25 g</td></tr><tr><td>PBS，1×&amp;nbsp; pH 7.4±0.1</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>5'-磷酸吡哆醛一水合物，99%&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>228170010</td><td>1 g</td></tr><tr><td>UV-STAR 微孔板，96 孔，COC 材质，平底</td><td>Greiner Bio</td><td>&amp;nbsp;655801</td><td></td></tr><tr><td>野生型人腺苷脱氨酶1</td><td>本实验室制备</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

测定人腺苷脱氨酶1酶的血清稳定性

Determining the Serum Stability of Human Adenosine Deaminase 1 Enzyme

酶稳定性的概念通常指酶的热稳定性，即酶在温度升高时保持其结构和活性的能力。对于治疗性酶而言，其他稳定性指标也可能至关重要，尤其是其在37 °C人血清中维持功能的能力，我们称之为血清稳定性。本文描述了一种 体外 评估野生型血清稳定性的检测方法 Homo sapiens 使用基于吸光度的微孔板法测定人腺苷脱氨酶I（HsADA1）酶活性。具体而言，本文描述了缓冲液和试剂的配制方法、HsADA1在血清中与样本共孵育的操作流程、利用微孔板读数仪分析测试样品的方法，以及相应的数据分析方法，用以确定HsADA1酶在血清中随时间变化所保留的活性比例。我们进一步讨论了将本方案拓展应用于其他酶类时需考虑的因素，并以一个实例加以说明 智人 犬尿氨酸酶，以帮助将该方案拓展适用于其他关注血清稳定性的酶。

图中显示了使用野生型 HsADA1 进行检测时得到的结果。图 3A、B 展示了在向野生型 HsADA1 的 1× PBS/血清-酶混合物样品中加入腺苷后，其在 260 nm 处的吸光度随时间下降的曲线。这种随时间变化的吸光度下降数据是用户在成功完成基于微孔板的检测后可预期的结果，与向腺苷中加入足量功能性 HsADA1 后所产生的吸光度数据相似。图 3C、D 展示了阴性对照组的吸光度曲线，这些对照组在加入腺苷后不含任何酶。与实际的酶样品相比，这些阴性对照组的吸光度变化几乎可以忽略不计。从图 3可以看出，酶反应曲线的斜率随孵育时间而变化。例如，第 0 天时间点的斜率明显比第 5 天时间点的斜率更陡峭。
图4展示了野生型HsADA1在37 °C下分别于1×PBS或混合人血清中孵育时，其活性随时间保留的比例。具体而言，图3A、B中所有吸光度下降曲线的斜率均归一化为其各自组别第0天的斜率。如图4所示，野生型HsADA1在1×PBS与混合人血清中的活性保留存在差异。具体而言，该酶在混合人血清中失活更快，在第5天时仅保留约其初始活性的10%。当HsADA1在1×PBS中孵育时，仍可检测到活性下降，但此时酶保留了约75%的活性。该结果与Jennings等人的研究一致，后者也报道在37 °C下与血清孵育48小时后，活性下降近40%6。Lu等人也证实，HsADA1在室温（25 °C）下的胸膜液、腹膜液和脑脊液中其活性亦会下降8。
为展示本方案的灵活性，我们采用该方法检测了另一种人源酶的血清稳定性，即一种经改造的人源犬尿氨酸酶变体，此前被称为 HsKYNase66-W102H-T333N7HsKYNase66_W102H-T333N 能高效催化 OH-Kyn 转化为 OH-AA，其功能与野生型 HsKYNase 酶相似；尽管该酶实际上是经改造的人源犬尿氨酸酶变体的双氨基酸回复突变体，该变体具有改变的底物特异性，即能够高效降解犬尿氨酸生成邻氨基苯甲酸。7OH-Kyn 在 379 nm 处具有强吸收，而 OH-AA 无此吸收，因此当加入我们设计的 HsKYNase 变体时，OH-kyn 的吸光度显著下降可被检测到9,10. 图 5A，B 展示了添加 OH-Kyn 后，来源于 HsKYNase 的 1× PBS/血清-酶混合物样品在 379 nm 处的吸光度下降曲线。 图 5C，D 展示了不含酶的测试对照组的吸光度曲线。与HsADA1类似，各样品间的吸光度曲线斜率存在明显差异。这一点尤为明显 图 5A，因为0 h时间点的斜率明显比3 h和24 h时间点更陡峭。 图6 显示了经测试的HsKYNase在不同时间点所保留活性的相应比例。与HsADA1类似，HsKYNase66-W102H-T333N在血清中失活速度比在PBS中更快（24小时内活性损失约85%，而在PBS中约损失40%）。尽管该酶变体的血清稳定性此前未被检测过，但其表现符合其他HsKYNase变体的一般趋势，即在血清中24小时内也会丧失大部分活性。 37 °C7. 
一般来说，由于pH、盐浓度、温度等多种因素的影响，酶的活性可能会随着时间的推移而降低11。因此，若实验结果未呈现这一趋势，则可能被视为异常。例如，如果酶活性随时间显著升高，则可能表明实验结果无效。此处假设酶的反应条件保持不变，仅从时间角度进行讨论。
<img alt="HsADA1 孵育过程；流程图；酶稀释、腺苷制备、96 孔板中的紫外吸收。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图 1：HsADA1 实验方案步骤的流程图。 该图展示了本方案中所遵循的各个步骤。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="96孔板动力学分析设置；用于控制温度和读数间隔的软件界面。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2：酶标仪动力学读数设置。 设置了一个动力学读数程序，用于在37 °C条件下以最短时间间隔连续30分钟测量260 nm处的吸光度。该图显示了用于建立此程序的选定参数。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="野生型HsADA1稳定性分析图；血清和PBS对照；随时间变化的A260吸光度" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：添加后 HsADA1 的吸光度随时间变化曲线 200 µM 腺苷 (A) 加入后血清孵育的 HsADA1 的吸光度随时间变化曲线 200 µM 腺苷。B) 用1× PBS孵育的HsADA1。C血清阴性对照。D1× PBS 阴性对照（n = 3） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="HsADA1 酶活性随时间变化的曲线图，显示在 1xPBS 与人混合血清中的相对活性。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图 4：HsADA1 酶活性保留情况。 在 37 °C 条件下，比较 HsADA1 在 1x PBS 与人混合血清中的活性保留比例。检测了 HsADA1 在 1x PBS 和人混合血清中孵育 5 天内的原始活性保留比例（柱状图表示均值 ± 标准差，n=3）。采用双尾非配对 t 检验进行统计分析，*p&lt;0.05，**p &lt; 0.01，***p &lt; 0.001。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="Kynase在A379、血清/PBS pH 7.4条件下的稳定性图谱；0-24小时吸收度变化，四种条件。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5：添加后 HsKYNase66-W102H-T333N 的吸光度随时间变化曲线 400 µM OH-Kyn (A血清孵育的HsKYNase在加入后吸光度随时间变化的曲线 400 µM OH-Kyn.B) 用1×PBS孵育的HsKYNase。C) 血清阴性对照。D1× PBS 阴性对照（n=3） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="酶活性图，HsKynase_66 变体在 1xPBS 与人血清中随时间变化的结果" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 6"> 
图6：HsKYNase66-W102H-T333N 的活性保留情况。在 37 °C 条件下，分别于 1x PBS 和混合人血清中测定其酶活性。检测了 HsKYNase66-W102H-T333N 在 24 小时内于 1x PBS 与混合人血清中孵育后原始活性的保留比例（柱状图表示均值 ± 标准差，n=3）。采用双尾非配对 t 检验进行统计分析；***p &lt; 0.001。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充图1：腺苷和肌苷的标准曲线。绘制了0-200 µM范围内的标准曲线。将腺苷或肌苷以指定浓度加入1x PBS中，然后测定260 nm处的吸光度。（n=3）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图 2：OH-Kyn 的标准曲线。绘制了 0–400 µM 范围内的标准曲线。将 OH-Kyn 按标注浓度加入 1× PBS 中，随后测定 379 nm 处的吸光度。（n=3）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%202.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图3：加入200 µM腺苷后，在260 nm处随HsADA1浓度增加的吸光度随时间变化曲线。（A）不同浓度HsADA1的反应曲线。（B）吸光度曲线线性区域斜率相对于1x PBS对照组的倍数变化（柱状图 = 均值 ± 标准差，n=3）。采用双尾非配对t检验，**p &lt; 0.01，****p &lt; 0.0001。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%203.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图4：加入400 µM OH-Kyn后，在379 nm处随着工程化HsKYNase浓度增加的吸光度随时间变化曲线。（A）不同浓度工程化HsKYNase的反应曲线。（B）吸光度曲线线性区域斜率相对于1x PBS对照组的倍数变化（柱状图 = 均值 ± 标准差，n=3）。采用双尾非配对t检验，****p &lt; 0.0001。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%204.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图 5：使用热失活酶在 400 µM OH-Kyn 条件下于 379 nm 处测得的吸光度随时间变化曲线。将热失活的 HsKYNase 酶加入含有 400 µM OH-Kyn 的 1× PBS 溶液中，随后测定 379 nm 处的吸光度。（n=3）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%205.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文详细介绍了表征酶在人血清中于37 °C孵育时保持其功能能力的方法，这一药理学特性被称为血清稳定性。这种能力可能是预测酶的药代动力学特征及其是否适用于治疗用途的关键因素。

酶稳定性的概念通常用于指酶的热稳定性——即其在温度升高时保持结构和活性的能力……

我们的实验室致力于免疫学、工程学和代谢领域的交叉研究，以改善人类健康。我们利用蛋白质和细胞工程方面的专业知识，开发新型疗法并调控生物学功能。如果研究人员希望延长蛋白类生物药物在体内的循环半衰期，本实验方案可帮助使用者判断血清稳定性是否为限制其效果的关键步骤。理解这一关键点将有助于指导未来的蛋白质工程研究聚焦于实际需求领域。我们将探讨的一个问题是：在癌症治疗背景下，经过改造而具有增强血清稳定性的蛋白质是否比未经改造的对应物具有更高的治疗效果。我们还将进一步探究，由于这种稳定性的提升，是否可以通过减少给药剂量来实现治疗效果。

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