视网膜血管中糖尿病诱导的黏附白细胞定量

我们实验室的研究重点是了解糖尿病中视网膜病变的成因以及如何预防该病变。多家实验室已证实，在糖尿病条件下，眼内小血管中白细胞过度积聚（即白细胞黏附）现象加剧。这可能促进糖尿病视网膜血管的阻塞与退化。该技术可实现对视网膜血管系统中白细胞黏附严重程度的可视化与定量分析，可用于评估不同治疗方法（包括药物）疗效的相关研究。

[指导教师] 设置加压灌注装置时，依次连接0.9%生理盐水袋、静脉导管套件、四通旋塞阀和灌胃针。打开灌注系统，以每分钟18至20毫升的流速用生理盐水冲洗管路和端口2分钟，以排除所有气泡。将麻醉后的小鼠仰卧位放置在灌注台上。肉眼辨认剑突。用优势手持止血钳夹住并固定皮肤，随后将止血钳换至非优势手并提起皮肤。接着，使用剪刀以与脊柱呈90度角的方向剪除一块皮肤，暴露腹外壁。在可见剑突和肋骨的情况下，沿两侧解剖腹壁，注意避免损伤任何器官或主要血管。此时应透过膈肌观察到心室和肺。用剪刀尖在靠近脊柱的一侧膈肌处做一 incision。剪开胸骨后暴露胸腔内心脏。用非优势手持镊子夹住心脏心尖附近部位。用优势手持连接静脉导管的灌胃针穿刺心尖。确保灌胃针的球形针头略微从穿刺点突出，以避免完全穿透左心室或进入肺血管系统。随后打开旋塞阀，使0.9%生理盐水开始流动。同时用剪刀剪开右心耳。持续灌注2至3分钟，轻柔地左右、上下移动针头，防止血管扭曲，并促进心脏血液排出。灌注结束后，旋转旋塞阀手柄以关闭生理盐水流动，使注射器中的液体流向灌胃针。然后在30至35秒内手动灌注10毫升刀豆蛋白A（concanavalin A）溶液。对麻醉小鼠心脏灌注刀豆蛋白A溶液后，将小鼠侧放。用非优势手的食指按住上眼睑，拇指按住下眼睑。轻柔地牵拉眼睑及周围皮肤，使眼球突出，部分脱出于眼窝之外。接着，用优势手持弯头剪刀以45度角从下方托起眼球，剪断肌肉附着点和视神经。将剪刀作为刮铲使用，将眼球转移至小容器中。将眼球置于牙科蜡上，准备切开眼球。在解剖显微镜下，用显微镊夹住附着于眼球后部的巩膜皱褶或残留肌肉组织，调整眼球方向，使角膜朝向一侧。在紧靠角膜缘后方且与其平行的位置做一切口。使用显微剪沿眼球杯周缘分离眼前段结构（包括晶状体），确保视网膜完全与巩膜分离。用显微刮铲将视网膜从巩膜中取出。若视网膜仍通过视神经与巩膜相连，可将显微剪插入视网膜与巩膜之间以切断视神经。将未固定的视网膜置于载玻片上，滴加一滴PBS。在视网膜上做4至5条放射状切口，形成三叶草样图案，使其平铺展开。在显微镜下以10倍物镜（总放大倍数100倍）观察平铺的视网膜。视网膜血管的荧光显微观察显示，糖尿病小鼠视网膜表现出轻度白细胞黏附，每只视网膜通常有3至12个白细胞，而非糖尿病对照组为1至3个。与糖尿病样本中轻微的白细胞聚集相比，在脂多糖（lipopolysaccharides）诱导的炎症模型中观察到显著的白细胞簇集现象。