Name: 可扩展的生物制造工作流程，用于生产和分离基于自然杀伤细胞来源的细胞外囊泡癌症生物治疗药物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-16T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: 学习自然杀伤细胞来源的细胞外囊泡（NK-EVs）的可扩展生物制造工作流程，通过尺寸排阻色谱法分离高纯度囊泡。该方法适用于癌症生物治疗研究，为实体瘤治疗提供可靠的临床级生产方案。

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作者谨此感谢 Simon Sauvé、Roger Tam 和 Xu Zhang 博士对本文手稿的审阅意见。本研究得到了加拿大政府基因组研究与发展计划（GRDI）第七阶段（2019–2025）的运营资助，由 JRL 和 LW 获得；同时获得加拿大自然科学与工程研究委员会 RGPIN-2019-05220 项目资助、癌症研究学会/渥太华大学 24064 项目资助、加拿大卫生研究院（CIHR）研究运营资助 175177（由 LW 获得）、CIHR 硕士奖学金（由 MK 获得），以及伊丽莎白二世科学与技术研究生奖学金（QEII-GSST）（由 FSDB 获得）的支持。

Biomanufacturing and Characterization of NK-Extracellular Vesicles

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所有作者均声明无利益冲突或披露事项。

多项研究表明，NK-EVs 作为抗癌治疗剂具有巨大的潜力4,5,7,9,16,22,23,24,25,26,27,28,29,30。然而，为进一步开展临床前测试及未来的临床应用，亟需建立一种可扩展且符合药品生产质量管理规范（GMP）的生物制造系统，以实现高纯度 NK-EVs 的大量生产。为解决这一问题，先前一项研究采用封闭式中空纤维生物反应器（HFB）系统，持续培养 NK 细胞并获得富含 NK-EVs 的条件培养基（CM），适用于后续实验。由于其三维结构设计，HFB 系统能够高度模拟血管系统的环境，并具有极高的比表面积，可支持超过十亿个细胞长期培养，从而显著提高 EV 的产量7,31,32。尤为重要的是，该研究首次报道了利用 HFB 系统培养 NK 细胞，这可能得益于所用细胞系对 IL-2 的自给自足特性7。
必须采取额外步骤以确保HFB系统的无菌性以及高纯度NK-EVs的生产。这些预防措施在缺乏无菌洁净室的条件下尤为重要，而许多研究机构可能正面临这种情况。在将HFB系统移入生物安全柜之前，需仔细喷洒70%乙醇，以对所有外表面进行消毒。此外，所有鲁尔锁接头均需用封口膜包裹，以最大限度降低污染风险。这一点尤为关键，因为该生物制造流程不使用抗生素，而抗生素已知会影响细胞及其衍生产品的生化特性33。在细胞产品生物制造过程中，采用了多种指标评估细胞健康状况。例如，每日检测储液罐培养基的pH值、葡萄糖和乳酸水平，这些是监测细胞健康状况的重要替代指标。除定量评估外，对HFB系统的定性观察（如培养基颜色以及浑浊等污染的可见迹象）也有助于监测细胞健康状况。每日收集的条件培养基（CM）中的细胞计数并未被发现能代表整体培养物活力的有效指标（数据未显示）。这可能是由于在CM取样时收集到了滞留在管路中无法循环区域（即ECS与ECS注射器端口之间的小段管路）的死亡细胞，从而低估了整体细胞培养的活力。只有在每批次生产结束时从HFB系统收获的NK细胞才能提供反映培养体系健康状况的可靠指标。这些细胞在不同生产批次中始终表现出高于70%的活力值7。综上所述，这些质量评估方法共同确保了高纯度NK-EVs的持续生产。
已开发出多种分离技术用于纯化和分离EVs34。其中一种方法是尺寸排阻色谱法（SEC），该方法利用填充有多孔材料——树脂的色谱柱，根据分子大小进行分离。在此过程中，较大的EVs更快地流出色谱柱；该方法被称为基于尺寸排阻的穿流纯化。同时，较小的污染物（如双链DNA、游离蛋白（如核酸内切酶）、盐类、酚红等）则因静电作用力被保留在树脂中并进一步滞留（即使用了双模态树脂）。基于SEC的处理可去除非EV结合的蛋白质，同时保持EV原有的结构和功能35，36。此外，SEC纯化易于放大，且不会影响高得率和高纯度，因此是分离用于生物治疗用途的NK-EVs的合适选择。尽管具有上述优势，SEC仍存在一些缺点，例如穿流液（洗脱液）相对稀释；因此需要通过超滤（UF）进行浓缩，同时UF也允许缓冲液置换。非无菌的UF装置在使用前需用70%乙醇和PBS冲洗，并置于生物安全柜中以确保无菌状态。通常，穿流液可浓缩至初始体积的35–50倍，同时去除可能进入洗脱液的小分子物质。在进行FPLC-SEC联合UF操作之前，需先进行差速离心和核酸内切酶处理，以去除残留的细胞、细胞碎片以及长片段的抗原性双链DNA7。
NK-EV 产品分离后，根据 MISEV2018 和 MISEV2023 指南进行表征和功能验证，以确定该产品是否适用于后续使用6,18每次分离可获得 1.0 - 1.5 mL 高纯度 NK-EV 产物，其最低浓度为 1 × 1012 EVs/mL，平均浓度为1.39 × 1012 颗粒/mL。此前，Gupta 等人确定中位 EV 剂量 体内 是 3.37 × 108 小鼠每公斤体重的EVs数量37. 采用中位剂量进行治疗需要 8.43 x 106 每只体重为25 g的小鼠所接受的EVs剂量，远低于保证的最低剂量（1 x 1012 颗粒/mL），通过该工艺获得的产量足以满足临床前实验或达到给药剂量目标。每次分离均进行支原体和微生物检测，作为产品质量控制评估的一部分。此外，先前的研究已证实终产品中不存在常见病毒成分和内毒素，且经Western blot分析未检测到被视为宿主细胞污染物的细胞组分。7,34最后，采用经过验证的高灵敏度基于刃天青的细胞活力检测法对NK-EVs的功能性进行功能评估。20. 该活力检测法通过代谢活跃的细胞将刃天青（弱荧光）还原为试卤灵（强荧光），从而评估经NK-EV处理后的细胞活力。与其他替代性细胞活力检测方法相比，本研究采用的基于刃天青的检测法对细胞活力变化高度敏感（背景噪声极低），且可在更短的孵育时间内观察结果（获得具有统计学意义的结果所需时间少于30分钟）20通常，NK-EVs 对 K562 细胞活力表现出剂量依赖性效应。综上所述，上述结果表明，该 NK-EVs 产品已达到临床前评估的产品放行标准，适用于后续应用。
综上所述，本基于方案的研究描述了具有临床级潜力的自然杀伤细胞外囊泡（NK-EVs）的生物制造过程。如前所述，NK-EVs 是在无血清、无异源物、无饲养层细胞且无抗生素的条件下，利用封闭式中空纤维生物反应器（HFB）系统生产的7。采用快速蛋白液相色谱-尺寸排阻层析结合超滤（FPLC-SEC/UF）的方法对 NK-EVs 进行分离与纯化。在将产品用于下游应用之前，必须对 NK-EVs 进行表征和功能验证，以确保其适用性。如研究结果所示，遵循该生物制造方案可成功制备大量高纯度的 NK-EVs，这些囊泡对癌细胞表现出靶向性的细胞毒性。因此，所述的生物制造方案可为未来需要生产临床级 NK-EVs 的研究提供重要支持。

在21世纪st 世纪以来，人类在抗击癌症方面取得了显著进展，这主要得益于癌症免疫治疗药物的兴起。这类药物通过调动免疫系统来对抗癌症。自然杀伤细胞来源的细胞外囊泡（NK-EVs）已成为免疫治疗新兴领域中极具前景的候选手段。自然杀伤细胞（NK细胞）在固有免疫和适应性免疫中均发挥整合性作用，对病毒感染细胞、应激细胞及恶性肿瘤细胞的清除至关重要。它们通过一系列强大的抗癌机制，以细胞毒性方式清除异常细胞。1,2,3其中一种机制是细胞外囊泡（EVs）的产生与分泌，这些纳米级双层结构含有多种生物分子，如蛋白质、RNA和DNA，在介导细胞间通讯中发挥关键作用。4,5,6NK-EVs 由于其独特的载体特性，成为极具前景的无细胞治疗剂。这些特性包括体积小，可实现基于滤膜的除菌；生物相容性高；在肿瘤组织中具有优先富集的倾向；可递送多种类型的 cargo；能够跨越血脑屏障等生物屏障；且毒性极低。NK-EVs 在多个方面避免了给药前需通过化疗进行患者淋巴细胞耗竭的必要性：1）传统上，淋巴细胞耗竭旨在为细胞治疗创造更有利的体内环境，使输注的细胞得以增殖并发挥治疗作用；2）与细胞不同，EVs 不具备复制能力，且体积显著更小；3）EVs 通过与细胞不同的机制发挥作用，且相较于细胞具有更低的免疫原性。5,6,7此外，NK-EVs 始终表现出 体外 在多种癌症模型中表现出疗效，并且还显示出对促进抗癌反应的免疫细胞具有免疫调节作用8,9. 体内 结果证实了这些发现，显示经 NK-EV 治疗后肿瘤发生退缩，且毒性反应可忽略不计10,11,12因此，基于NK-EV的治疗策略在应对冷型、免疫惰性实体瘤的治疗挑战方面具有广阔前景13,14,15,16,17.
我们最近的研究通过生物制造技术解决了一个制约NK-EVs临床转化的重大瓶颈7。该文章提出了一种经济高效且可放大的NK-EVs生物制造工作流程的概念验证，该流程经过精心设计，以确保生产过程中的质量控制检测。该方法持续生产出大量高纯度的基于NK-EVs的癌症生物治疗产品，并依据MISEV2018指南对产品进行了全面表征18。通过增大生物反应器卡匣尺寸或并行运行多个生物反应器，可实现生物制造流程的可扩展性。同样，通过采用基于快速蛋白液相色谱（FPLC）的尺寸排阻色谱（SEC）、超滤（UF）以及基于滤膜的除菌技术，EV分离流程的可扩展性也易于实现。封闭式中空纤维生物反应器（HFB）系统在无需添加血清、饲养细胞体系或抗生素的条件下，成功培养了IL-2自给型NK细胞系（NK92-MI细胞）。该过程使用了一种商业化的化学成分明确且无异源成分的培养基（目前已有符合GMP标准的商业化版本）。结果表明，在单个中等尺寸生物反应器卡匣中，仅用5至7天即可成功生产出大量NK细胞（109个活细胞）和NK-EVs（1012个EVs），并对两种产物进行了广泛表征。在整个生物制造过程中，通过pH值、葡萄糖和乳酸水平等可量化指标，以及培养基颜色变化和污染迹象等视觉指标，每日监测细胞健康状况，这些是预测细胞和EV质量的关键因素。对HFB系统中收获的NK细胞活力和功能（特别是细胞毒性）的后续评估显示，其显著优于传统培养瓶培养体系7。同样，纯化后的NK-EVs表现出高纯度特征，不含细菌、支原体、常见病毒及细胞组分，且内毒素水平极低。重要的是，纯化后的NK-EVs占最终产品中所有纳米颗粒的99.9%以上7。最后，这些纯化的NK-EVs保留了NK细胞的关键特征，包括表面标志物（CD2、CD45、CD56）、细胞因子载荷（GzmB、PFN、IFN-g），并在针对白血病K562细胞的实验中表现出强效的细胞毒性，而K562细胞系是评估NK细胞毒性的金标准细胞系7。
本方案详细阐述了上述可扩展的生物制造流程。该方案阐明了利用FPLC-SEC联合超滤（UF）及基于滤膜的除菌方法来分离自然杀伤细胞外囊泡（NK-EVs）的技术方法。此外，方案还描述了关键步骤，包括通过纳米颗粒追踪分析（NTA）对产品进行表征、利用多种工具（蛋白质/双链DNA定量及微生物检测）进行质量评估，以及通过细胞活力检测对纯化的NK-EV产品在抗癌细胞中的功能进行验证。通常情况下，该流程可从约40 mL富含EV的条件培养基中获得1.0–1.5 mL的NK-EV产品，平均浓度为1.18 × 1012 EVs/mL7，总产量至少达到1 × 1012 个EVs。该工艺可释放满足多种下游应用需求的产品，适用于需要大量高质量EVs的探索性研究、临床前研究以及多组学研究（蛋白质组学、转录组学、基因组学、代谢组学、脂质组学和表观基因组学），并具备向临床转化的潜力，且已证明具有良好的可重复性。

<table><tbody><tr><td>0.1 &amp;micro;m 真空过滤装置 Filtropur V50&amp;nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>83,3941,002</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m Acrodisc 注射器滤器&amp;nbsp;</td><td>Pall Corporation</td><td>PN4612</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MB9204560TF-LAB</td><td></td></tr><tr><td>10 kDa Centricon Plus-70 离心过滤器</td><td>Sigma</td><td>UFC701008</td><td></td></tr><tr><td>60 mL 注射器&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>96孔平底透明黑色聚苯乙烯TC处理微孔板&amp;nbsp;</td><td>Costar</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0491</td><td></td></tr><tr><td>AKTA 快速蛋白液相色谱仪&amp;nbsp;</td><td>GE Lifesciences</td><td>29022094</td><td></td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide 针头 - 18G</td><td>BD Biosciences</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase 核酸酶&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E1014-25KU</td><td></td></tr><tr><td>BioTek Synergy H1 多功能酶标仪</td><td>BioTek&amp;nbsp;</td><td>SH1M2G-SN</td><td></td></tr><tr><td>Blue Juice 凝胶上样缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10816015</td><td></td></tr><tr><td>CaptoCore 700 树脂&amp;nbsp;</td><td>Cytiva</td><td>17548102</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer Auto 2000 细胞活力计数仪&amp;nbsp;</td><td>Nexcelom BioScience LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10 冻存培养基&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C2874</td><td></td></tr><tr><td>DPBS&lt;sup&gt;&amp;minus;/&amp;minus;&lt;/sup&gt;&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP399-1</td><td></td></tr><tr><td>双LED蓝光/白光透射仪&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>LB0100</td><td></td></tr><tr><td>Duet P3202 流量控制泵&amp;nbsp;</td><td>FiberCell Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>乙醇&amp;nbsp;</td><td>Commercial Alcohols</td><td>P006EAAN</td><td></td></tr><tr><td>外泌体耗竭型胎牛血清&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>A2720803</td><td></td></tr><tr><td>Fluorobrite DMEM&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>A18967-01</td><td></td></tr><tr><td>血糖仪</td><td>AccuCheck</td><td>Model 930</td><td></td></tr><tr><td>HiScale 层析柱 10/40&amp;nbsp;</td><td>Cytiva</td><td>29360550</td><td></td></tr><tr><td>ImmunoCult-XF（GMP级培养基替代品）</td><td>StemCell Technologies</td><td>100-0956</td><td></td></tr><tr><td>ImmunoCult-XF T细胞扩增培养基&amp;nbsp;</td><td>StemCell Technologies</td><td>10981</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇&amp;nbsp;</td><td>EMD</td><td>PX1834-1</td><td></td></tr><tr><td>K562 细胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基&amp;nbsp;</td><td>BioBasic</td><td>SD7002</td><td></td></tr><tr><td>L-乳酸检测试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab65331</td><td></td></tr><tr><td>中空纤维培养器（中等规格）&amp;nbsp;</td><td>FiberCell Systems</td><td>C2011</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>支原体PCR检测试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab289834</td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NS300&amp;nbsp;</td><td>Malvern</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH&amp;nbsp;</td><td>Supelco</td><td>SX0607N-6</td><td></td></tr><tr><td>NK92-MI 细胞&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-2408</td><td></td></tr><tr><td>pH 试纸-Mquant&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>1,09533</td><td></td></tr><tr><td>PrestoBlue HS 细胞活力检测试剂&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P50200</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 4 荧光计&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR 检测试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>Q33262</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 检测试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>Q33231&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Flex 检测管条&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q33252</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Flex 荧光计&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q33327</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 蛋白质 BR 检测试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A50669</td><td></td></tr><tr><td>Quick Load 1Kb Plus DNA 标准品&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>N0469S</td><td></td></tr><tr><td>SYBRSafe DNA 凝胶染料 Invitrogen</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>注射泵&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus</td><td>984730</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T-9284</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure TAE 缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15558042</td><td></td></tr><tr><td>ViaStain 吖啶橙和碘化丙啶（AO/PI）染色液&amp;nbsp;</td><td>ESBE Scientific</td><td>CS2-0106</td><td></td></tr></tbody></table>

可扩展的生物制造工艺流程用于生产与分离自然杀伤细胞来源的基于细胞外囊泡的癌症生物治疗剂

Scalable Biomanufacturing Workflow to Produce and Isolate Natural Killer Cell-Derived Extracellular Vesicle-Based Cancer Biotherapeutics

自然杀伤细胞来源的细胞外囊泡（NK-EVs）正在被研究作为癌症生物治疗剂。这类囊泡具有独特的性质，既可作为靶向癌细胞的细胞毒性的纳米囊泡，又可作为免疫调节信号传递介质。一种可放大的生物制造工艺流程能够生产出大量高纯度的NK-EVs，以满足临床前及临床应用的需求。该工艺采用封闭式中空纤维生物反应器，在符合药品生产质量管理规范（GMP）标准的无血清、无异源物、无饲养层细胞且无抗生素的条件下，实现NK92-MI细胞系持续生产NK-EVs。本研究基于标准化操作流程，概述了利用尺寸排阻色谱法、超滤法以及基于滤膜的除菌工艺来分离纯化NK-EVs的生物制造流程。通过纳米颗粒追踪分析对NK-EVs产品进行关键表征，并采用经验证的基于细胞活力的效价检测方法评估其对癌细胞的功能活性。该可放大的生物制造工艺通过遵循最佳实践并确保可重复性，有望显著推动NK-EV类癌症生物治疗药物的临床转化。

NK-EVs 具有内在的细胞毒性功能，并在多种癌症模型中表现出高效性。然而，目前关于适用于 NK-EVs 大规模生产的生物制造工艺流程，尚缺乏统一的标准6,21。我们之前的研究已证实，采用封闭式中空纤维生物反应器（HFB）系统可大量制备高纯度的 NK-EVs 产品7。作为后续研究，本基于实验方案的研究详细描述了该生物制造工艺流程，并通过制备和分离 NK-EVs 产品来验证其可重复性（图 1）。此外，在产品放行前必须进行关键的产品表征与验证，本研究中展示了相关的新颖且原始的数据。
由于HFB系统具有操作简便、可靠性高、可扩展性强以及符合GMP规范等优点，因此被选用于NK-EV的生产7。在HFB系统的设置过程中，NK细胞通过左侧ECS端口注入，并接种至生物反应器盒中（图2）。同时，将培养基瓶通过侧端口连接至HFB系统，使培养基在整个系统中循环流动。NK细胞在无血清、无异源成分、无饲养层细胞且无抗生素的培养基中进行培养，当葡萄糖含量降至50%以下时更换培养基，以维持并最大程度保障细胞的长期健康状态。条件培养基（CM）每日收集，经差速离心处理后，于-80 °C冷冻保存，直至进行后续处理。随后，通过差速离心联合FPLC-SEC并结合超滤（UF）和过滤技术进行EV的分离纯化（图3）。最终获得浓缩且无菌的NK-EV产品，终体积约为1.0 - 1.5 mL。文中提供了NK-EV经FPLC-SEC分离的代表性层析图谱（图4）。在进行FPLC-SEC处理前，富含NK-EV的条件培养基需经核酸内切酶处理，显著降低双链DNA（dsDNA）水平，从而减少潜在的宿主（NK）细胞污染物7。因此，该EV分离流程可有效去除NK-EV产品中的细胞碎片及RNA/DNA污染物，这对于确保终产品具有较低的非预期免疫原性，并适用于后续研究至关重要。
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67227/67227fig04.jpg" /> 
图4：快速蛋白液相色谱尺寸排阻法分离NK-EV过程中生成的色谱图。 蓝线代表吸光度（mAU；最大读数为2000 mAU），红线代表电导率，红色文字代表运行日志，灰色阴影区域代表分步收集的NK-EV（由T2至T7组分表示）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67227/67227fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
分离后，通过基础的NK-EV表征和质量控制检测，评估NK-EV产品是否可用于后续下游实验。采用纳米颗粒追踪分析（NTA）测定NK-EV产品的粒径范围和浓度，其直径范围为76.30 - 174.30 nm（D10 78.38 &#177; 2.07 nm, D50 106.72 &#177; 2.43 nm，以及 D90 169.80 &#177; 4.17 nm）和平均浓度为1.39 × 1012 EVs/mL（图 5A- B）。此外，荧光计定量显示蛋白质和双链DNA浓度为298.90 &#177; 66.62 mg/mL 和 225.60 &#177; 37.7 ng/mL，分别对应于最终产品图5C- D）。这相当于平均比率为 5.06 x 106 EV/&#181;g 蛋白质和6.16 x 1012 EV/&#181;g DNA。微生物和支原体检测结果均为阴性（数据未显示）。这些结果与先前研究中对NK-EVs的表征一致7较早的出版物7 还依据MISEV指南对NK-EV产品进行了进一步的深入表征（即透射电镜、Western印迹、内毒素水平、病毒实体检测，以及表面抗原和细胞因子的流式细胞术分析）。
最后，通过经验证的高灵敏度、基于刃天青的细胞活力检测法评估了NK-EV产品的功能（即对癌细胞的细胞毒性），该检测在NK-EV处理白血病细胞系K562后进行7,20。NK-EV处理K562细胞3小时后，细胞活力呈现剂量依赖性变化，对应的EC50为9.33 × 109 EVs/mL（即杀死50%细胞群体所需的剂量；图6A-B）。因此，根据上述产品放行标准，NK-EV产品被认为适用于进一步的实验研究。
<img alt="图5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67227/67227fig05v3.jpg" /> 
图5：纯化后的NK-EV产物表征。（A）通过NTA测定的NK-EV产物粒径分布，数据表示5次独立实验的平均值，每次实验包含10个技术重复（5次视频采集×2种稀释度）。（B）通过NTA测定的NK-EV颗粒产物浓度（particles/mL），数据表示5次独立实验的平均值±标准差（SD），每次实验设技术重复2次。（C）使用荧光计测定的NK-EV产物蛋白浓度（mg/mL），数据表示5次独立实验的平均值±标准差（SD），每次实验设技术重复3次。（D）使用荧光计测定的NK-EV产物双链DNA浓度（ng/mL），数据表示5次独立实验的平均值±标准差（SD），每次实验设技术重复3次。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67227/67227fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67227/67227fig06v3.jpg" /> 
图6：纯化后的NK-EV产物功能验证。 通过高灵敏度的基于刃天青的细胞活力检测法，检测不同浓度NK-EV处理3小时后对人K562白血病细胞的杀伤效应，结果显示NK-EV具有剂量依赖性的细胞毒性。(A) 标准化的检测结果（绿色实线代表未处理的K562白血病细胞对照组，黑色虚线代表经去垢剂裂解的K562白血病死细胞对照组）；数据来自11次独立实验，每组设三个技术重复，以均值±标准误（SEM）表示。(B) NK-EV处理的EC50曲线分析（采用可变斜率拟合），包含95%置信区间/预测带（红色虚线代表50%效应响应水平）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67227/67227fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

自然杀伤细胞来源的细胞外囊泡（NK-EVs）作为癌症生物治疗剂具有广阔的应用前景。本研究基于方法学，提出了一种可放大的封闭式生物制造工艺流程，旨在持续生产并分离出大量高纯度的NK-EVs。在整个生物制造过程中进行过程控制检测，确保所获得的EVs符合产品放行的质量标准。

自然杀伤细胞来源的细胞外囊泡（NK-EVs）正在被研究作为癌症生物治疗剂。它们具有独特的细胞毒性特性……

我们的研究聚焦于一类天然具有杀伤癌细胞能力的免疫细胞所产生的小型囊泡。这些囊泡在治疗原发性和继发性实体瘤（例如脑部肿瘤）方面具有良好的治疗潜力。在本研究中，我们采用一种双模式树脂，通过尺寸排阻色谱法分离囊泡，利用树脂的物理筛分作用将囊泡与污染物分离，同时通过静电作用进一步将污染物截留在树脂内部，从而最大限度地提高产物纯度。随后，我们在使用前对囊泡进行灭菌、浓缩和缓冲液置换。本视频中介绍的生物制造流程采用了具有临床相关性的条件，可在成本上实现规模化，有效生产大量高纯度的细胞外囊泡。这使得学术实验室能够借助可靠且可重复的生产与分离工艺，更有信心地投入资源研究此类治疗剂。目前，我们正在探索这些囊泡在临床前模型中的治疗潜力，并进一步加深对其作用机制的理解。首先，根据制造商的说明启动快速蛋白质液相色谱系统。采用滴对滴方法进行连接，以确保柱内不引入空气。使用合适的收集管设置组分收集器，以收集样品。调整分馏设置至所需的收集体积。从80°C冰箱中取出40至80毫升预先准备好的细胞外囊泡或富含细胞外囊泡的条件培养基，并在37°C下快速解冻。在4°C条件下以10,000 G离心30分钟，然后将上清液转移至新管中。为了降低双链DNA水平，用5毫摩尔的氯化镁和每毫升50单位的核酸内切酶处理富含细胞外囊泡（EV）的条件培养基。在37摄氏度下孵育样品2至4小时，并进行适度混匀。当层析系统准备就绪后，将富含EV的条件培养基装入60毫升注射器中，并连接至样品管路。单击“手动运行”以启动系统，并将流速设置为零。根据软件提示，预先保存运行程序，然后单击“开始”。选择双过滤的PBS缓冲液，以每分钟2毫升的流速运行，确保溶液流经层析柱。待吸收值稳定后，按下自动调零UV。改变流路，使样品在进入层析柱前直接流入废液瓶。5至20秒后，将样品导向层析柱。当紫外吸收值达到约230毫吸收单位时，点击“组分收集”。样品完全注入后，将缓冲系统切换为双过滤PBS，以继续纯化。当紫外吸收值达到约1,600毫吸收单位时，再次点击“组分收集”。运行结束后，将色谱图保存为 PDF 文件。用 20 至 30 毫升 90% 乙醇冲洗超滤装置的每个组件。在 4,000 ×g 条件下离心 5 至 10 分钟，弃去滤过液。然后用无菌 PBS 进行冲洗，以平衡装置，并重复之前的离心步骤。合并所有稀释后的 NK-EV 组分。为最大限度保证无菌，使用 0.22 微米注射器滤器过滤稀释后的 NK-EV 溶液，滤器需预先用双滤 PBS 润湿。将滤液收集到已灭菌的浓缩装置中。以4,000 G离心15至40分钟。离心后，使用血清学移液管混匀上层滤膜室中的溶液。再次在4,000 G下离心10分钟。将过滤装置倒置并连接至收集装置以收集NK-EV。在2,000 G下离心NK-EV 2分钟，将纯化产物转移至无菌管中。根据制造商的说明启动纳米颗粒跟踪分析系统。观察流动池中是否存在气泡。如果存在气泡，用20%乙醇和双过滤水冲洗流动池以去除气泡。待其清晰后，小心地将激光模块重新插入纳米颗粒跟踪分析仪中。关闭仪器门，点击“启动相机”。将捕获设置调整为屏幕增益2，相机水平14。打开加热器以使流动池温度稳定。点击“标准测量”在SOP选项卡下创建一个脚本，用于在23摄氏度、流速为30的条件下采集一分钟的捕获数据。将文件夹名称和文件名添加到路径名称中以保存数据。涡旋混匀纯化的NK-EV产物，并使用双滤过的PBS进行稀释。将稀释后的样品涡旋混匀后，将其加入1毫升上样注射器中，避免引入气泡。小心地将注射器连接至仪器的上样管路。缓慢推入一半样品，注射器中保留约 0.5 毫升。当屏幕上可见颗粒时，调节摄像头焦距，使每个颗粒周围最多出现一个光环。在“硬件”选项卡下，点击“输注”并设置速率为 1,000，持续五秒，然后将速率降至 30。点击运行脚本。确认设置正确后，点击“是”，并按照软件提示操作。完成采集后，当软件提示处理或导出文件时，点击“取消”。每种稀释度完成五次捕获后，导入全部五次捕获结果进行分析。选中文件并点击“处理所选文件”。在“处理”选项卡下，将分析参数设置为屏幕增益2，检测阈值15。检查并单击“确定”以进行分析。处理完成后，无需勾选其他选项框，直接单击“是”，或单击“导出”以导出文件。纯化的NK-EV粒径范围为76.30至174.30纳米，平均浓度为每毫升1.39×10¹²个EVs。此外，荧光定量结果显示蛋白质浓度约为300毫克/毫升，双链DNA浓度为225毫克/毫升。人K562白血病细胞经NK-EVs处理后，细胞活力呈剂量依赖性下降，EC50为9.33×10⁹个EVs/毫升。

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