可扩展的生物制造工艺流程用于生产与分离自然杀伤细胞来源的基于细胞外囊泡的癌症生物治疗剂

我们的研究聚焦于一类天然具有杀伤癌细胞能力的免疫细胞所产生的小型囊泡。这些囊泡在治疗原发性和继发性实体瘤（例如脑部肿瘤）方面具有良好的治疗潜力。在本研究中，我们采用一种双模式树脂，通过尺寸排阻色谱法分离囊泡，利用树脂的物理筛分作用将囊泡与污染物分离，同时通过静电作用进一步将污染物截留在树脂内部，从而最大限度地提高产物纯度。

随后，我们在使用前对囊泡进行灭菌、浓缩和缓冲液置换。本视频中介绍的生物制造流程采用了具有临床相关性的条件，可在成本上实现规模化，有效生产大量高纯度的细胞外囊泡。这使得学术实验室能够借助可靠且可重复的生产与分离工艺，更有信心地投入资源研究此类治疗剂。目前，我们正在探索这些囊泡在临床前模型中的治疗潜力，并进一步加深对其作用机制的理解。

首先，根据制造商的说明启动快速蛋白质液相色谱系统。采用滴对滴方法进行连接，以确保柱内不引入空气。使用合适的收集管设置组分收集器，以收集样品。

调整分馏设置至所需的收集体积。从80°C冰箱中取出40至80毫升预先准备好的细胞外囊泡或富含细胞外囊泡的条件培养基，并在37°C下快速解冻。在4°C条件下以10,000 G离心30分钟，然后将上清液转移至新管中。

为了降低双链DNA水平，用5毫摩尔的氯化镁和每毫升50单位的核酸内切酶处理富含细胞外囊泡（EV）的条件培养基。在37摄氏度下孵育样品2至4小时，并进行适度混匀。当层析系统准备就绪后，将富含EV的条件培养基装入60毫升注射器中，并连接至样品管路。

单击“手动运行”以启动系统，并将流速设置为零。根据软件提示，预先保存运行程序，然后单击“开始”。

选择双过滤的PBS缓冲液，以每分钟2毫升的流速运行，确保溶液流经层析柱。待吸收值稳定后，按下自动调零UV。改变流路，使样品在进入层析柱前直接流入废液瓶。5至20秒后，将样品导向层析柱。

当紫外吸收值达到约230毫吸收单位时，点击“组分收集”。样品完全注入后，将缓冲系统切换为双过滤PBS，以继续纯化。当紫外吸收值达到约1,600毫吸收单位时，再次点击“组分收集”。

运行结束后，将色谱图保存为 PDF 文件。用 20 至 30 毫升 90% 乙醇冲洗超滤装置的每个组件。在 4,000 ×g 条件下离心 5 至 10 分钟，弃去滤过液。

然后用无菌 PBS 进行冲洗，以平衡装置，并重复之前的离心步骤。合并所有稀释后的 NK-EV 组分。为最大限度保证无菌，使用 0.22 微米注射器滤器过滤稀释后的 NK-EV 溶液，滤器需预先用双滤 PBS 润湿。

将滤液收集到已灭菌的浓缩装置中。以4,000 G离心15至40分钟。离心后，使用血清学移液管混匀上层滤膜室中的溶液。

再次在4,000 G下离心10分钟。将过滤装置倒置并连接至收集装置以收集NK-EV。在2,000 G下离心NK-EV 2分钟，将纯化产物转移至无菌管中。

根据制造商的说明启动纳米颗粒跟踪分析系统。观察流动池中是否存在气泡。如果存在气泡，用20%乙醇和双过滤水冲洗流动池以去除气泡。

待其清晰后，小心地将激光模块重新插入纳米颗粒跟踪分析仪中。关闭仪器门，点击“启动相机”。将捕获设置调整为屏幕增益2，相机水平14。

打开加热器以使流动池温度稳定。点击“标准测量”在SOP选项卡下创建一个脚本，用于在23摄氏度、流速为30的条件下采集一分钟的捕获数据。将文件夹名称和文件名添加到路径名称中以保存数据。

涡旋混匀纯化的NK-EV产物，并使用双滤过的PBS进行稀释。将稀释后的样品涡旋混匀后，将其加入1毫升上样注射器中，避免引入气泡。小心地将注射器连接至仪器的上样管路。

缓慢推入一半样品，注射器中保留约 0.5 毫升。当屏幕上可见颗粒时，调节摄像头焦距，使每个颗粒周围最多出现一个光环。在“硬件”选项卡下，点击“输注”并设置速率为 1,000，持续五秒，然后将速率降至 30。

点击运行脚本。确认设置正确后，点击“是”，并按照软件提示操作。完成采集后，当软件提示处理或导出文件时，点击“取消”。

每种稀释度完成五次捕获后，导入全部五次捕获结果进行分析。选中文件并点击“处理所选文件”。在“处理”选项卡下，将分析参数设置为屏幕增益2，检测阈值15。

检查并单击“确定”以进行分析。处理完成后，无需勾选其他选项框，直接单击“是”，或单击“导出”以导出文件。纯化的NK-EV粒径范围为76.30至174.30纳米，平均浓度为每毫升1.39×10¹²个EVs。

此外，荧光定量结果显示蛋白质浓度约为300毫克/毫升，双链DNA浓度为225毫克/毫升。人K562白血病细胞经NK-EVs处理后，细胞活力呈剂量依赖性下降，EC50为9.33×10⁹个EVs/毫升。