为细胞外囊泡分离设置成功的分选
2024年10月11日
该协议提供了对间充质基质细胞释放的细胞外囊泡 （EV） 进行分类的详细描述。特别关注仪器设置和分选条件的优化。目标是对细胞外囊泡进行分类，同时保留其特性。
因此，我们研究的主要重点是研究间充质基质细胞，即用于组织再生的细胞外囊泡。我们研究的一个问题和目标是将无细胞方法与细胞疗法一起转化为临床应用。表征至关重要，如今要获得纯囊泡进行深度表征非常困难，因为没有实现高纯度的方案。
因此，我们希望实施细胞分选仪技术来研究、表征并最终转化为临床实践这种基于细胞外囊泡的新方法，我们的方案包括四个部分，样品制备、细胞外囊泡表征、分选和分选后分析。我们将专注于排序部分。如您所见，一些命令将在分拣软件上执行，而另一些命令将在触摸屏上执行。
与其他 EV 分离方法相比，我们的方案具有显著优势。首先，在 35 psi 下使用 70 个微型喷嘴可保持 EV 后分拣的完整性。然后可以分离特定的 EV 群体，最后，仪器允许保存分选设置，以使过程可重现。
在我们的实验室中，我们正在努力开发用于细胞外囊泡分析的新型多色组合。特别是，我们专注于仪器设置和荧光染料的研究。我们相信，能够识别和分离稀有的囊泡种群，可以很好地改善它们的表征，也可以很好地研究它们在生物过程中的作用。
首先，打开细胞分选仪的压力管路和真空系统。打开仪器，打开生物安全柜，然后启动分选仪软件。对流体系统加压，然后打开流体系统。
激活液滴驱动喷嘴中的压电晶体，该晶体振动以产生液滴。执行去鼓泡程序以消除系统中的气泡。然后在高压差下运行一管 5 毫升的清洁溶液 5 分钟，然后用一管 5 毫升的去离子水运行五分钟。
要执行手动启动程序，请转到激光控制选项卡并打开激光功率。检查流的垂直对齐方式。对于激光光斑测定，请按 Laser stream intercept（激光流截距）选项卡。
单击绿色箭头按钮，然后按照触摸屏显示器上的说明进行作。初始化 IntelliSort，并设置丢弃驱动频率以及导致流形成 Droplet 的默认振幅值。对于精细激光对准程序，将一管 5 mL 的 QC 对准微珠装入进样器中，并在 QC 方案中运行。
在精细对齐选项卡上，在 X 轴和 Y 轴上选择所需的参数，以可视化紧密压实和均匀的拉延筋。检查手动对准后，执行自动 QC，将 QC 珠的直径设置为 3 微米。将 QC 采集保存在软件对齐方案中。
要完成 IntelliSort，请将偏转板定位在分拣机中的正确位置，然后将电压打开至约 3， 000 伏。选择 6 管支架排序输出。在流指示器上选择流以启用它们并执行测试流。
启用 IntelliSort 自动丢弃延迟确定按钮以设置正确的丢弃延迟并再次验证流。然后激活 IntelliSort 维护模式并手动验证丢弃延迟。在分选仪软件中加载手动的 drop-delay 方案并采集荧光对照微珠。
插入正确的幻灯片支架后，选择 sort，然后选择 drop-delay 向导和 sort logic。用荧光显微镜验证 97% 的荧光珠存在于第五个水坑上。首先，设置单元格排序器并激活 IntelliSort。
执行散射校准后，对每个样品执行样品采集步骤。要为样品分选创建新方案，请在工具栏上选择 file（文件），然后选择 protocol（协议）和 new（新建）。单击分拣软件上的数据采集设置。
在采集参数窗口中，选择感兴趣的通道并禁用其他通道。然后将一管 5 毫升的样品放入采样器中。在触摸屏上，单击加载按钮。
在排序软件工具栏上，选择 acquisition （采集），然后按 start（开始）。当样品属性窗口出现时，插入样品名称并单击 Okay。要创建门控策略，请选择 histogram，然后选择 create histogram。
创建三个点图，第一个点图的 X 轴上是 488-FSC1-Height 对数，Y 轴上是 488-SSC-Height 对数。第二个在 X 轴上具有 488-FSC-2 高度对数，在 Y 轴上具有 488-SSC-Height Log，第三个在 X 轴上具有 488 513 X 26 CFSE 高度对数，在 Y 轴上具有 488-SSC 高度对数。单击 acquisition ，然后单击 start 并插入样本的名称。
在采集过程中，绘制标识 CFSE 负面事件的区域，以及标识 CFSE 正面事件的区域。然后在 sort （排序） 选项卡上，确定要排序的区域。当流速稳定时，选择 acquisition（采集），然后选择 Stop（停止）。
通过在分拣软件的工具栏上选择 sort 开始分拣。要保存排序设置，请在工具栏中选择 sort，然后单击 save sort settings。为了检查分选群体的纯度，首先获取一管 5 毫升的清洁溶液，在高压差下放置 10 分钟，然后获取一管 5 毫升的去离子水，放置 10 分钟。
采集 0.22 微米、过滤的 PBS 并检查是否不存在 CFSE 阳性事件。然后在 100 微升 0.22 微米过滤的 PBS 中稀释 5 微升分选样品。获取分选的样品并记录体积 CFSE 分选后，脂肪来源的细胞外囊泡中 CD9 、 CD63 、 CD81 和 CD44 的表达没有变化。
纳米颗粒跟踪分析表明，囊泡的尺寸分布在分选前后保持一致。透射电子显微镜分析表明，分选过程没有显着改变囊泡的形态。此外，处理为 0.1% Triton X-100 减少了确认其囊泡起源的 CFSE 阳性囊泡的数量。
概述
本研究聚焦于来自间充质基质细胞的细胞外囊泡（EVs）的分选用于组织再生。该协议强调优化仪器设置以实现高纯度并保持分选后EVs的完整性。
关键研究组成部分
研究领域
- 细胞外囊泡
- 间充质基质细胞
- 组织再生
背景
- 细胞外囊泡纯化的挑战
- EV表征对临床应用的重要性
- 现有协议的当前局限性
使用的方法
- 用于EV分选的细胞分选技术
- 间充质基质细胞作为生物系统
- 分选条件和软件设置的优化
主要结果
- 协议实现EV的高纯度分离
- 分选后EV完整性的保持
- 促进罕见EV群体的识别
结论
- 该研究展示了一个可靠的EV分选协议，最小化质量损失。
- 这种方法对于推进无细胞治疗的临床应用具有相关性。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-purity isolation of extracellular vesicles (EVs) from mesenchymal stromal cells is critical for advancing cell-free regenerative medicine and translational research. This protocol addresses the reproducibility and integrity challenges that have limited EV characterization and downstream application in biopharma R&D. Reliable EV sorting enables robust target validation and supports the development of next-generation therapeutic platforms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of EV-mediated biological pathways relevant to tissue regeneration.
- Supports functional target validation by isolating pure EV populations for mechanistic studies.
- Facilitates predictive confidence in EV-based therapeutic hypotheses by ensuring sample integrity.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible EV preparations for downstream phenotypic or molecular assays.
- Improves assay reliability by minimizing sample heterogeneity and contamination.
- Enables scalable preparation of EVs for high-throughput screening and platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Aligns EV isolation with disease-relevant models for translational biomarker discovery.
- Ensures continuity from discovery to preclinical validation by maintaining EV integrity and phenotype.
- Reduces biological risk in advancing EV-based candidates through the pipeline.
Pipeline & Workflow Integration
This EV sorting protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting both early mechanistic studies and translational research on cell-free therapies.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on EV function and regenerative mechanisms.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative EV samples for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides size distribution and purity metrics via nanoparticle tracking and re-analysis.
- Translational Research: Maintains EV phenotype for biomarker and efficacy studies in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Standardizes EV sorting for cross-project and cross-team applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in EV research.
- Operational Value: Enhances reproducibility, scalability, and standardization of EV isolation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust EV characterization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of EV-based therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry and EV biology for optimal instrument setup and gating strategies.
- Demands access to advanced cell sorting instrumentation and nanoparticle tracking analysis.
- Necessitates adherence to MISEV and MIFlowCyt EV guidelines for cross-team standardization.
- May require adaptation of nozzle size and pressure settings for different EV sources or applications.
- Purity and integrity checks are essential to validate sorted EV populations for downstream use.
