Name: 为细胞外囊泡分离设置成功的分选 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学习使用细胞分选仪技术从间充质基质细胞中分离高纯度细胞外囊泡的方法。该方案优化仪器设置以保持囊泡完整性，有助于组织再生研究和无细胞治疗的临床转化应用。

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感谢 Emanuele Canonico 提供的技术支持。本研究的部分工作在 ALEMBIC 完成，ALEMBIC 是由 IRCCS Ospedale San Raffaele 和 Università Vita-Salute San Raffaele 建立的先进显微镜实验室。Enrico Ragni 和 Laura de&#160;Girolamo 的工作得到了意大利卫生部“&#34;Ricerca Corrente&#34;”项目的支持。

Fluorescence-Based Sorting of Adipose-Derived Extracellular Vesicles

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

由于细胞外囊泡（EVs）体积微小，且接近大多数流式细胞仪的检测极限，因此对其分析和分选具有挑战性。我们的目标是建立一种分离经CFSE标记的AMSC来源EVs的实验方案。选择CFSE作为染色方法，是因为其报道的EVs标记效率高（≥90%），且不会像抗体染色那样产生蛋白聚集体等非特异性颗粒。然而，仍有可能遗漏少数不含酯酶的EVs，未来需要进一步研究以鉴定能够标记此类颗粒的染色方法，从而优化分选方案19。
我们的目标是建立一种分选条件，能够在不改变细胞外囊泡（EVs）物理特性的前提下实现高纯度EVs的收集。通过充分利用所用分选仪的技术性能，并采取特定措施（例如根据喷嘴尺寸降低标准分选压力），成功实现了该条件的建立。我们利用FSC聚苯乙烯微球对这些分选条件进行了建立和验证。随后，将该方案应用于脂肪来源干细胞（ASC）EVs的分选，共重复实验四次，均获得一致的结果，从而证实了本方案的可重复性。
然而，需要注意一些关键方面和局限性，我们在此列出。（i）分选样品的纯度：由于仪器的背景噪声在重新分析时始终存在，因此很难确凿地证明分选后的CFSE阳性细胞外囊泡（EVs）的纯度。但是，我们可以认为已富集了CFSE阳性的群体。在CFSE阴性群体中未检测到CFSE阳性事件，表明我们的分选过程是成功的，间接证明了分选样品的纯度。（ii）分选样品的潜在污染：我们不能排除分选组分中可能含有仪器无法检测的小囊泡，这些小囊泡可能会被无意中包含在分选液滴中。（iii）分选后EVs的完整性：我们意识到仪器施加的压力可能会对囊泡造成损伤。为减轻这一影响，我们采用了70 µm喷嘴，并将压力从标准的60 psi降低至35 psi。此外，我们谨慎地制备样品，避免使用可能改变EVs物理特性的超速离心步骤。尽管采取了这些预防措施，我们仍无法保证分选后的EVs保持完整且未发生改变。因此，我们建议进行分选后的分析，并在可能的情况下开展功能测试，以评估EVs的状态。
以下是一些可能的方案修改与故障排除建议。本方案所设定的参数基于可调节压力的仪器；然而，对于压力设置较为固定的仪器，建议使用100 µm喷嘴，以降低压力，从而尽可能保持细胞外囊泡（EVs）的完整性。
尽管存在上述考虑，我们仍认为本方案相较于其他EV分离方法具有显著优势。首先，该方法能够分离特定的EV亚群。虽然我们选择使用CFSE（一种可标记具有完整细胞膜结构的荧光染料）对囊泡进行染色，但也可利用单克隆抗体对特定EV亚群进行分选。在此类情况下，额外的染色对照至关重要。国际细胞外囊泡学会（International Society for Extracellular Vesicles, ISEV）、国际流式细胞术促进学会（International Society for Advancement of Cytometry, ISAC）以及国际血栓与止血学会（International Society on Thrombosis and Haemostasis, ISTH）已发布了关于开展可重复流式细胞术实验的全面指南。详细说明可参见MISEV 20231 和MIFlowCyt-EV指南18。其次，该方法相较于需多次超速离心的其他方法更为省时。
在我们看来，该方案可能是分离和收集特定群体细胞外囊泡的有效策略，这些细胞外囊泡在治疗方面具有潜在应用价值。

细胞外囊泡（EVs）是一类由几乎所有细胞释放的、具有膜结构的异质性囊泡，由脂质双分子层包被，自身无法复制1。它们存在于多种生物体液中，如血液血浆、血清、唾液、母乳、尿液、支气管肺泡灌洗液、羊水、脑脊液以及恶性腹水2。EVs的主要功能之一是在供体细胞与受体细胞之间转运多种分子，包括核酸、蛋白质、脂质和碳水化合物。这一过程可通过多种机制实现，例如直接膜融合、受体-配体相互作用、内吞作用以及吞噬作用3,4。因此，研究表明EVs在众多生理和病理过程中发挥着重要作用，并在疾病新型生物标志物、药物递送载体以及治疗剂方面展现出巨大潜力5,6。
间充质基质细胞（MSCs）是一类多能细胞，可从多种组织中分离获得，包括脂肪组织、牙髓、脐带血、胎盘、羊水、华通胶，甚至脑、肺、胸腺、胰腺、脾脏、肝脏和肾脏。近年来，这类细胞在再生医学领域引起了广泛关注7。脂肪来源的间充质干细胞（ASCs）可通过比骨髓等其他来源更为微创的方式从脂肪组织中获取，从而降低严重并发症的风险，并避免伦理问题8。
此外，脂肪组织中的间充质干细胞浓度显著高于骨髓（1% 对比 &#62;0.01%）以及其他来源，如真皮、牙髓、脐带和胎盘。间充质干细胞因其具有分化能力以及能够分泌多种生长因子、趋化因子和细胞因子，在受损组织和细胞的再生中发挥关键作用；这些治疗益处不仅归因于其分化能力，还归因于其分泌多种生长因子、趋化因子和细胞因子的特性。一个显著的例子是间充质干细胞在骨科疾病治疗中的潜力，这一术语 &#34;肌肉骨骼系统疾病&#34; 在中国临床试验注册中心（clinicaltrials.gov，访问于13日）注册的临床研究数量更多th 2024年5月
此外，间充质干细胞（MSCs）还能分泌细胞外囊泡（EVs），通过向受损细胞或组织传递信息，发挥与母细胞相似的生物学活性，从而参与组织再生9,10。因此，MSC-EVs 可能成为细胞治疗的一种有价值的替代方案，实现无细胞治疗策略11，目前已有两项涉及 MSC-EVs 用于骨科疾病的临床研究（NCT05261360 和 NCT04998058）。然而，EVs 在临床应用方面仍存在若干挑战。例如，EV 分离技术存在一些问题：大多数方法无法保证囊泡的纯度或完整性。此外，某些分离技术操作复杂、耗时较长且重复性低，不适合临床应用12。
另一方面，细胞分选是一种常用的方法，可通过特异性荧光标记物从异质性细胞悬液中分离单个细胞13。该方法可用于多种应用，并可适用于不同类型的样本。然而，尽管细胞分选是一项成熟且广泛应用的技术，外泌体（EV）分选仍然极具挑战性，因为大多数外泌体的尺寸低于即使最灵敏的流式细胞仪的最低检测阈值。某些特性使分选仪更适用于此目的。首先，采用气流中的液流系统（Jet-in-air），即悬浮颗粒的液流在空气中而非流动池内被激光检测，该系统通过减少样本所受的应力来保护样本。第二个重要特点是，在液流与收集透镜之间设有&#34;遮蔽&#34;杆，可降低仪器的背景光学噪声。尽管背景噪声较低，但并未完全消除，其构成一个参考信号，为低于检测阈值的事件提供部分观察窗口：这对于分析接近仪器&#34;检测限&#34;的事件极为重要14。最后，该分选仪配备双通路前向散射光（FSC）检测系统，并配有两种不同的掩模，可提高对样本中大小颗粒的分辨能力。
基于此，我们开发了一种利用高灵敏度细胞分选仪分离羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记的间充质干细胞来源细胞外囊泡（MSC-EVs）的方案。为了尽量减少对细胞外囊泡（EVs）的操作并保持其完整性和数量，我们在样本制备过程中避免了超速离心步骤。此外，我们调整了分选条件以最大限度地减少对囊泡的应力损伤，包括进一步优化仪器参数，通过减小喷嘴尺寸相关的分选压力（70 μm 喷嘴，压力为 35 psi）来实现。

<table><tbody><tr><td>5(6)-羧基荧光素二乙酸盐&amp;nbsp;N-琥珀酰亚胺酯</td><td>Merck</td><td>150347-59-4</td><td></td></tr><tr><td>脂肪间充质基质细胞</td><td>Wepredic, Parc d'affaires, 35760 Saint-Gr&amp;eacute;goire, France</td><td></td><td>本研究中使用的细胞</td></tr><tr><td>Alexa 488 抗小窝蛋白抗体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>IC5736G</td><td>流式细胞术抗体</td></tr><tr><td>APC 抗人 CD44 抗体</td><td>BioLegend</td><td>338805</td><td>流式细胞术抗体</td></tr><tr><td>APC 抗人 CD63 抗体</td><td>BioLegend</td><td>353007</td><td>流式细胞术抗体</td></tr><tr><td>APC 抗人 CD81 (TAPA-1) 抗体</td><td>BioLegend</td><td>349509</td><td>流式细胞术抗体</td></tr><tr><td>APC 抗人 CD9 抗体</td><td>BioLegend</td><td>312107</td><td>流式细胞术抗体</td></tr><tr><td>BC CytoFLEX S</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>配备蓝光、红光和紫光三种激光器的 BC CytoFLEX S</td></tr><tr><td>Flow-Check Pro 荧光微球</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63493</td><td>用于 MoFLO Astrios EQ 的荧光对照微球</td></tr><tr><td>FlowJo 软件（版本 10.8.1）</td><td>BD</td><td>version 10.8.1</td><td>分析软件</td></tr><tr><td>IntraSure 试剂盒</td><td>BD Biosciences</td><td>641776</td><td>用于细胞内染色的固定和透化处理</td></tr><tr><td>Megamix-Plus FSC</td><td>BioCytex</td><td>7802</td><td>FSC 聚苯乙烯微球&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MoFLO Astrios EQ</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>配备蓝光、黄绿光、紫光和红光四种激光器的 MoFLO Astrios EQ</td></tr><tr><td>小鼠抗 FLOT1 抗体</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610820</td><td>Western Blot 抗体</td></tr><tr><td>NanoSight NS300</td><td>Malvern</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>兔抗 Calnexin 抗体</td><td>Origene</td><td>TA336279</td><td>Western Blot 抗体</td></tr><tr><td>兔抗 CD9 和 CD81 抗体（ExoAb 抗体试剂盒）</td><td>System Biosciences</td><td>EXOAB-KIT-1</td><td>Western Blot 抗体</td></tr><tr><td>兔抗 TSG101 抗体&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>HPA006161</td><td>Western Blot 抗体</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>9036-19-5</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Rainbow 荧光颗粒</td><td>Spherotech</td><td>URFP-30-2</td><td></td></tr><tr><td>Ultracel 100 kDa MWCO</td><td>Merck</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>VER01 - Verity 微壳</td><td>Exometry</td><td></td><td>用于散射校准的有机硅酸盐微球</td></tr></tbody></table>

设定外泌体分离的成功分选条件

Setting a Successful Sorting for Extracellular Vesicle Isolation

间充质基质细胞（MSCs）释放的细胞外囊泡（EVs）含有具再生和抗炎作用的一组微小RNA。因此，纯化的MSC-EVs被视为多种疾病下一代治疗的潜在选择。在本方案中，我们报告了从常用于骨科再生医学应用的脂肪来源MSCs（ASCs）上清液中成功分离EVs的策略。
首先，我们介绍了样品制备过程，重点描述了细胞外囊泡（EV）的分离以及使用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）进行荧光标记的步骤；随后，我们详细说明了分选过程，该过程是本实验方案的主要部分。
除了遵循 MISEV 2023 和 MIFlowCyt EV 指南所定义的规则外，我们还采用了针对喷嘴尺寸、频率和鞘液压力的特定实验条件。形态学参数通过使用选定直径的微球建立，这些微球的直径覆盖了细胞外囊泡（EV）尺寸的理论范围。在 ASC-EV 分选后，我们通过分选仪重新分析分选组分，并结合纳米颗粒追踪分析技术验证 EV 尺寸分布，以进行纯度检测。
由于细胞外囊泡（EVs）的重要性日益增加，获得纯净的EV群体用于研究和表征变得至关重要。在此，我们展示了一种有效的分选策略，可用于实现这一目标。

已使用FSC聚苯乙烯微球进行分选，以验证仪器设置和分选条件。FSC聚苯乙烯微球为混合荧光微球，粒径分别为100 nm、300 nm、500 nm和900 nm，在FITC通道中可见。图7A显示了分选前四群微球在SSC对数刻度与FITC对数刻度的散点图。对100 nm、300 nm和500 nm的荧光微球群体进行设门并分选。分选后的微球用于纯度与富集度分析，作为初步的概念验证（图7B）。所有群体在分选后均达到高纯度。参考背景噪声在分选前后的散点图中始终可见。
为满足MISEV2018/2023中列出的要求，并证明囊泡的性质及其纯度水平，研究人员开展了实验以分析细胞外囊泡（EVs）上存在或缺失的标志物。EVs对某些特定表面标志物呈阳性15：CD9、CD63、CD81和CD44。其中，CD9、CD63和CD81属于膜蛋白中的四跨膜蛋白家族，是鉴定外泌体最常见的标志物16。CD44是一种在间充质干细胞（MSCs）和脂肪源性干细胞（ASCs）中高表达的标志物17。
细胞内流式细胞术实验表明，EVs 对细胞质蛋白 Caveolin 呈阳性。此外，Western 印迹证实 EVs 对 CD9、CD81、TSG101 和 Flotillin 呈阳性，而对 Calnexin 呈阴性（图 2）。
接下来，按照本方案中所述的方法对CFSE标记的ASC-EVs进行分选。该分选程序重复进行了四次，每次均严格保持相同的样本制备、染色和分选条件（表1）。通过这种方式，验证了本方案的可重复性。
为分析经CFSE分选的ASC-EVs群体，并证明其特性在分选后未发生变化，进行了一系列实验。特别是，分选后CD9、CD63、CD81和CD44的表达水平未发生改变（图6A）。
另一个关键点涉及细胞外囊泡（EVs）的尺寸，以及由于压力诱导的应力，在分选过程后其尺寸可能发生的变化。由于样品量较少，分选后的分析难以进行，但纳米颗粒追踪分析表明，两个ASC-EVs样品（分选前和分选后）的粒径分布相同（图6B）。最后，通过透射电子显微镜（TEM）对EVs进行分析表明，分选后的EVs形态似乎未发生显著改变（图6C）。
值得注意的是，根据 MIFlowCyt-EV 框架指南的建议18，经0.1% Triton X-100处理样本后，CFSE阳性EVs数量减少，从而支持其囊泡来源（图8).
<img alt="图7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67232/67232fig07.jpg" /> 
图7：&#160;FSC 聚苯乙烯微球分选。（A）分选前微球的SSC/FITC散点图。分选后重新分析微球的SSC/FITC散点图：（B）100 nm分选微球，（C）300 nm分选微球，以及（D）500 nm分选微球。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67232/67232fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67232/67232fig08.jpg" /> 
图 8：&#160;在 Triton X-100 存在下细胞外囊泡膜的降解。将浓度为 0.1% 的 Triton X-100 加入样品中，在室温下孵育 15 分钟。图中展示了三次独立实验中未经处理（左）和经处理（右）样品的代表性散点图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67232/67232fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>实验</td>
			<td>分选出的EVs数量&#160;</td>
			<td>CFSE+ 分选EVs数量</td>
			<td>压力 (psi)</td>
			<td>喷嘴直径 (mm)</td>
			<td>频率 (Hz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>74 x 106</td>
			<td>4.8 x 106</td>
			<td>35</td>
			<td>70</td>
			<td>66000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>44 x 106</td>
			<td>7 x 106</td>
			<td>35</td>
			<td>70</td>
			<td>66000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>38 x 106</td>
			<td>3 x 106</td>
			<td>35</td>
			<td>70</td>
			<td>66000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>16 x 106</td>
			<td>2 x 106</td>
			<td>35</td>
			<td>70</td>
			<td>66000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：分选程序的重复性

本方案详细描述了间充质基质细胞释放的细胞外囊泡（EVs）的分选方法。特别是，重点介绍了仪器设置以及分选条件的优化。目标是在保持细胞外囊泡特性的同时对其进行分选。

间充质基质细胞（MSCs）释放的细胞外囊泡（EVs）含有多种具有再生和抗炎作用的微小RNA。

因此，我们研究的主要重点是研究间充质基质细胞及其分泌的细胞外囊泡在组织再生中的作用。我们研究面临的一个问题和目标是将无细胞疗法与细胞治疗相结合，推进其临床应用。表征分析至关重要，而目前要获得高纯度的囊泡以进行深入表征仍然非常困难，因为尚无能够实现高纯度分离的标准操作流程。因此，我们希望采用细胞分选技术来研究、表征并最终将这种基于细胞外囊泡的新方法转化为临床实践。我们的方案包括四个部分：样本制备、细胞外囊泡表征、分选以及分选后分析。我们将重点介绍分选部分。如您所见，部分操作将在分选仪软件上进行，另一些则在触摸屏上完成。与其它细胞外囊泡（EV）分离方法相比，我们的方案具有显著优势。首先，在35 psi压力下使用70微米喷嘴可保持EV分选后的完整性。其次，能够分离特定的EV亚群。最后，仪器支持保存分选参数设置，从而确保实验过程的可重复性。在我们的实验室中，我们致力于开发用于细胞外囊泡分析的新型多色检测方案。特别是，我们专注于仪器设置以及荧光染料的研究。我们相信，能够识别并分离出稀有的囊泡亚群，将有助于更精确地表征这些囊泡，并推动对其在生物过程中作用的深入研究。首先，打开细胞分选仪的压力管路和真空系统。开启仪器，打开生物安全柜，并启动分选软件。对流体系统加压，然后开启流体系统。启动液滴驱动，使喷嘴中的压电晶体振动，从而产生液滴。执行去气泡程序，以消除系统中的气泡。随后，在高差压条件下运行5毫升离心管的清洗液5分钟，接着用5毫升去离子水运行5分钟。执行手动启动程序时，请转至激光控制选项卡并开启激光电源。检查液流的垂直对准情况。为确定激光光斑位置，请按下激光液流拦截选项卡。单击绿色箭头按钮，然后按照触摸屏显示器上的说明操作。初始化 IntelliSort，设置液滴驱动频率以及默认振幅值，以使液流形成液滴。对于精细激光校准步骤，将装有 5 毫升 QC 校准微球的试管放入进样器中，并运行 QC 校准程序。在精细校准选项卡中，选择 X 轴和 Y 轴上的理想参数，以观察紧密聚集且准直良好的微珠。手动校准确认无误后，使用直径为三微米的质控微珠执行自动质控。将质控采集结果保存至软件校准协议中。为完成 IntelliSort 的设置，请将偏转板放置在分选仪中的正确位置，并将电压调至约 3,000 伏。选择六管架作为分选输出。在流指示器上选择液流以启用它们，并执行测试液流。启用 IntelliSort 自动液滴延迟确定按钮，以设置正确的液滴延迟时间，并再次验证液流。然后激活 IntelliSort 维持模式，手动验证液滴延迟时间。在分选仪软件中加载手动液滴延迟方案，并获取荧光控制微球。插入正确的载玻片架后，选择分选，然后依次选择延迟丢弃向导和分选逻辑。使用荧光显微镜确认97%的荧光微珠存在于第五个液滴中。开始前，设置细胞分选仪并激活IntelliSort。完成散射校准后，对每个样本执行样本采集步骤。要创建样本分选的新方案，请在工具栏中依次选择文件、方案和新建。单击分选软件中的数据采集设置。在采集参数窗口中，选择感兴趣的通道并禁用其他通道。然后将装有样品的5 mL离心管放入进样器中。在触摸屏上，单击加载按钮。在分选软件的工具栏上，选择采集，然后点击开始。当样本属性窗口出现时，输入样本名称并点击确定。为创建设门策略，选择直方图，然后创建直方图。创建三个点图，第一个点图的 X 轴为 488-FSC1-Height 对数，Y 轴为 488-SSC-Height 对数；第二个点图的 X 轴为 488-FSC-2 Height 对数，Y 轴为 488-SSC-Height 对数；第三个点图的 X 轴为 488 513 X 26 CFSE Height 对数，Y 轴为 488-SSC Height 对数。点击采集，然后点击开始，并输入样品名称。采集过程中，圈选识别CFSE阴性细胞群和CFSE阳性细胞群的区域。随后在分选选项卡中，确定需要分选的区域。当流速稳定后，选择采集，然后点击停止。开始分选时，在分选仪软件的工具栏中选择“分选”功能。如需保存分选设置，请在工具栏中选择“分选”，然后点击“保存分选设置”。为检测分选后细胞群体的纯度，首先以高差压条件采集5 mL清洗液，持续10分钟，随后采集5 mL去离子水，同样持续10分钟。获取经0.22微米滤膜过滤的PBS，并确认其中不存在CFSE阳性事件。然后将5微升分选后的样本加入100微升经0.22微米滤膜过滤的PBS中进行稀释。采集分选后的样本并记录体积。在经CFSE分选后，脂肪来源的细胞外囊泡中CD9、CD63、CD81和CD44的表达未发生变化。纳米颗粒示踪分析显示，囊泡在分选前后其大小分布保持一致。透射电子显微镜分析表明，分选过程未显著改变囊泡的形态。此外，经0.1% Triton X-100处理后，CFSE阳性囊泡数量减少，证实了其囊泡来源。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

为细胞外囊泡分离设置成功的分选

来源：DeMarino, C.，等．远离病毒的高产量细胞外囊泡制备物的纯化．J. Vis. Exp.

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