体外模型中组织矿化的全面表征

我们的研究致力于理解并改善骨再生过程。本文旨在利用多种互补的技术手段，全面表征组织矿化，以促进骨再生治疗中有前景候选方案的早期识别。为评估新形成矿化组织的质量与结构，我们采用了多种互补方法，包括结合深度学习分析的高分辨率三维显微CT成像、纳米压痕、组织学检查、背散射扫描电子显微镜成像以及拉曼光谱分析。

骨缺损的修复是再生医学领域面临的主要挑战。我们开发了组织外植体模型，可便于评估骨再生过程并随时间监测矿化情况。首先，使用自体骨软骨移植系统，在已处死绵羊的股骨外侧髁上制造一个直径为4.75毫米的缺损。

使用骨科锤子在髁部制造一个深度为10毫米的缺损，并从中取出骨软骨外植体。制备添加了40微克/毫升BMP-2的磷酸钙水泥，将水泥糊状物装入3毫升注射器中，然后使用18号针头将水泥注入外植体的缺损处。

打开显微断层扫描X射线仪，将外植体管放置在样品台上。设置分辨率为10.7微米，曝光时间为1200毫秒，使用1毫米铝滤光片，电压为80千伏，电流为125微安。每次旋转0.45度时采集三幅图像并进行平均，以提高信噪比。

为进行图像分割，使用集成的分割向导训练深度学习模型，以区分骨组织与骨水泥。从重建的显微计算机断层扫描图像中选取一个包含骨组织、骨水泥及背景的代表性区域，并对这一首帧图像进行分割。随后，在模型选项卡中生成深度学习模型，并选择3D U-Net程序。

然后右键单击生成的模型，设置实验参数：深度为 5，图像块大小为 32×32，采用 Adadelta 算法，步长比率为 0.25，数据倍数为 10X。使用已分割的帧，点击“train”按钮来训练深度学习模型。训练完成后，定义第二个帧，并使用 predict 功能对其进行自动分割。

然后，单击导出以发布训练好的模型，并通过选择“分割”、“导出模型”、“分割完整数据集”将其应用于整个显微计算机断层扫描数据集。首先，将从绵羊采集的骨软骨组织样本放入含有25毫升脱水溶液的40毫升玻璃小瓶中进行脱水处理。将小瓶置于旋转轮上，在室温下旋转1小时。

最后一次洗涤后，将脱水溶液替换为25毫升二甲苯。将玻璃小瓶置于旋转轮上，在室温下放置1小时。接着，加入10%过氧化苯甲酰、10%邻苯二甲酸二丁酯，以及450微升用丙醇按1:20稀释的N,N-二甲基苯胺，然后将玻璃小瓶在-20摄氏度下放置过夜。

现在将外植体放入塑料盒中的中等大小包埋模具内。将甲基丙烯酸甲酯、过氧化苯甲酰、邻苯二甲酸二丁酯以及 N,N-苯胺溶液倒入模具中。用氮气流对模具排气处理五分钟。

将盒子密闭，并置于4°C环境中48小时，以完成甲基丙烯酸甲酯（MMA）的聚合与硬化。两天后，从模具中取出含有外植体的树脂。使用金刚石锯沿长轴方向切割含有外植体的聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate）块，以3,000 RPM的转速和3毫米/分钟的切割速度，制备厚度为1.5毫米的切片。

使用粒度递增的碳化硅砂纸研磨样品。用10纳米厚的碳膜对厚样品进行碳镀。将样品固定在铝制样品台上，然后在样品顶部与样品台之间涂上导电银漆，以实现电子电荷向地面的导出。

将样品台放置在扫描电子显微镜（SEM）载物台上。关闭腔室并启动真空。打开电子束，调节SEM设置以在背散射电子模式下工作。

将灰度标准设定为碳25、铝225、硅253。使用标准样品对扫描电镜进行校准后，以背散射电子模式采集样品图像。利用样品的背散射电子图像将灰度值转换为钙含量。

然后绘制图像的钙分布含量。将样品置于拉曼显微光谱仪的载物台上。在测量前校准波数以确保准确性，并对激光进行准直。

采集拉曼光谱时，使用波长为785纳米、功率为30毫瓦的激光器。积分时间设置为20秒。重复测量三次，光谱范围为350至1,800厘米⁻¹，光栅刻线为每毫米1,200条。

在纳米压痕系统校准完成后，将样品置于光学系统中，并确定纳米压痕的位置。然后将样品移至压痕装置下方。设置压痕深度为900纳米，加载和卸载速度为40毫米每分钟，加载与卸载之间暂停15秒。

将骨组织的泊松比设置为 0.3，并开始纳米压痕实验。