Name: 在 3D 流体芯片中模拟全肺切除术后的内皮糖萼 - 制造基于血管的器官芯片系统的方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-16T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: 学习利用器官芯片技术模拟全肺切除术后血管内皮糖萼损伤的方法。该3D流体芯片系统采用硅弹性体构建，可更准确地再现生理条件下的糖萼动态，为血管疾病治疗策略研究提供可靠的体外模型。

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作者谨向伍斯特理工学院生物医学工程系致以最诚挚的感谢，感谢他们提供的支持与指导。特别感谢 Megan Ouellette、John Martel 和 Sudish Vengat 在合作研究中提出的创新性想法，这些贡献极大地提升了本研究的质量与可行性。此外，我们还要感谢 Samantha Cocchiaro 和 Udaya Rattan 在实验室中的工作，以及他们所提供的关键支持与协助。

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作者声明无利益冲突。

血管建模是一个重要的新兴探索领域。成功构建精确的血管模型，对于推动组织工程和药物开发领域的发展具有重要意义。本文介绍了一种生成器官芯片（OOC）血管系统的新方法，可用于模拟肺叶切除术或任何其他血管系统或几何结构，以研究糖萼（GCX）损伤与肺叶切除术后并发症之间的潜在关联。从更广泛的角度来看，通过调整几何结构或其他疾病状态（如动脉粥样硬化或动脉瘤），该方法也可适用于模拟其他血管系统。
本文所述的器官芯片（OOC）系统相较于市场上其他OOC系统具有多项优势。该系统采用简单的制造工艺，成本低廉，相较于其他OOC方案更具经济性。这使得系统易于进行适应性改造，从而为模拟和评估多种不同血管区域提供了可能。这些应用可涵盖肺血管系统的生理与病理状态，包括肺动脉高压、血管重塑，以及内皮细胞对机械应力、炎症和缺氧的响应。此外，该系统还为药物测试、癌症转移研究、再生医学策略以及微血管通透性研究提供了平台。与其他多数OOC系统相比，该系统运行所需的设备成本更低，其中主要开支仅为一台蠕动泵。
标准器官芯片系统常见的问题是其脆弱性以及操作困难。这些系统需...

肺切除术是一种侵入性高风险外科手术，用于摘除右肺或左肺1。该手术通常作为治疗多种严重疾病（如肺癌、肺结核和创伤性肺损伤）的一种选择2。尽管该手术具有潜在疗效，但仍存在显著风险，术后并发症发生率较高，包括心律失常和肺水肿等1。
肺切除术通过将心脏的全部心输出量导向剩余肺组织，对心血管动力学产生深远影响3。这种血流重定向已知会增加剩余肺血管系统内的压力和剪切应力4。在血流模式发生巨大改变的情况下，血管内皮糖萼（GCX）在感知这些血流变化中发挥关键作用5。
糖萼（GCX）是一种凝胶状层，能够根据环境变化调节生化活动6,7。研究表明，与静态培养相比，持续暴露于均匀流动时其表达增加，而暴露于紊乱血流时则减少8,9。GCX在整个血管系统中厚度可变，范围为0.1–1 µm，作为覆盖血管内皮细胞的关键力传导层发挥作用10。该网络由密集的糖类、脂质和蛋白质层构成，如图1所示。这些糖类可结合形成聚糖，可游离存在于血液中，或与蛋白质或脂质结合，从而形成蛋白聚糖、糖蛋白或糖脂7,11。蛋白聚糖由糖胺聚糖（GAG）链组成，通过血浆蛋白或受体与细胞膜结合。这些GAG包括硫酸乙酰肝素（HS）、透明质酸（HA）、硫酸软骨素（CS）、硫酸皮肤素和硫酸角质素12。其中硫酸乙酰肝素是主要的GAG，占GCX中总GAG的50%以上。这些侧链可连接到嵌入的核心蛋白上，核心蛋白包括通过糖基磷脂酰肌醇锚定的Glypican家族蛋白（glypicans）、具有跨膜结构域的Syndecan家族蛋白（syndecans），以及表面黏附受体CD44。上述复合物在调控生长因子、抗炎反应、促进血管舒张以及调节血管通透性方面发挥关键作用13。
<img alt="内皮细胞示意图；磷脂双分子层、整合素受体、糖蛋白相互作用。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67246/67246fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="图1"> 
图1：糖萼成分示意图。 内皮糖萼结构成分的示意图。该示意图展示了位于血管管腔侧的顶端糖萼，显示其膜结合的蛋白聚糖和糖蛋白。由 BioRender.com 制作 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67246/67246fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
尽管肺切除术与糖萼（GCX）损伤之间的确切关联尚未得到充分研究，但肺切除术引起的血流模式改变与GCX完整性之间存在合理的相关性。已知血管系统中紊乱的血流会损害GCX6。我们假设，肺切除术后残余血管中紊乱血流增加以及剪切应力的变化可能随时间推移对GCX造成损伤。这种加速的退化过程可能促进术后并发症和疾病的发生，从而增加患者整体健康状况的固有风险13。
本方案旨在模拟肺切除术后的肺血管系统，遵循下述概述的一般操作流程 图2. 在计算机辅助设计模型上进行了流体模拟，该模型复制了有人类肺血管系统在有和没有肺切除术情况下的结构。肺切除术模型是通过在三维建模软件中设计三维肺血管系统而创建的，其尺寸依据来自CT扫描和文献数据，并进一步简化以适用于计算流体动力学（CFD）软件中的流动模拟。模拟确定了若干感兴趣区域，这些区域的选择依据是在肺切除术模型中相较于对照组剪切应力升高的部位。这些感兴趣区域被选中用于复制并构建 体外 模型。该 体外 该模型采用流体腔室设计，模拟具有正常几何结构和肺切除术后几何结构的多段血管，以重现不同的血流条件。
将人肺微血管内皮细胞（HLMVECs）培养于经纤维连接蛋白包被的聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底上，该基底形状模拟选定的分叉区域。使用蠕动泵将微血管内皮细胞培养基持续灌注通过系统。最后，对细胞及糖萼（GCX）进行固定，用特异性识别GCX的抗体进行免疫荧光染色，并通过荧光显微镜观察，以评估其在流体剪切力作用后的状态。本实验方案的总体时间线见表1。
<img alt="CT scan to COMSOL flow simulation to Organ-on-Chip setup; PDMS molds in fluid dynamics experiment." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67246/67246fig2.jpg" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="Figure 2"> 
图2器官芯片开发流程 开发新型器官芯片系统以研究肺部肺切除术影响的步骤1) 生成的人类肺血管系统CT扫描图像。2) 用于确定三维CAD模型感兴趣区域的CT扫描几何结构。3) 用于确定感兴趣几何结构的流体流动模拟 体外 模型。（4) 基于模拟结果中感兴趣区域构建的PDMS模具5将模具插入亚克力外壳中以固定模具进行灌注6) 流动腔室组装完成装置（7将完整的流动室装置转移至培养箱中（8) 经剪切应力处理后拍摄的明场和荧光图像。使用 BioRender.com 制作 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67246/67246fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
表1：通用实验方案时间线。 实验方案中各操作步骤的通用顺序及每个步骤的平均持续时间（小时）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67246/Table%201.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

<table><tbody><tr><td>#8-32 x 3/4 英寸 组合圆头镀锌机械螺钉（8 件装）</td><td>Everbilt</td><td>204274613</td><td>-</td></tr><tr><td>0.25% EDTA-胰蛋白酶</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056&amp;nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-565-269</td><td>-</td></tr><tr><td>35×10 mm 培养皿，Nunclon Delta</td><td>Thermo Scientific</td><td>153066</td><td>-</td></tr><tr><td>50 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-565-271</td><td>-</td></tr><tr><td>各种橡胶塞</td><td>Fisherbrand</td><td>14-132</td><td></td></tr><tr><td>BioLite 细胞培养处理培养瓶（25 cm²）</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-556-009</td><td>-</td></tr><tr><td>BioLite 细胞培养处理培养瓶（75 cm²）</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-556-010</td><td>-</td></tr><tr><td>COMSOL Multiphysics</td><td>COMSOL</td><td>N/A</td><td>-</td></tr><tr><td>双面胶带&amp;nbsp;</td><td>3M</td><td>16758005</td><td>-</td></tr><tr><td>Epredia Richard-Allan Scientific 盖玻片&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>22-050-218</td><td>-</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>ThermoFisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>A5256701&amp;nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>ThermoFisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>33016015&amp;nbsp;</td><td>20 &amp;mu;g/mL 稀释液</td></tr><tr><td>Fisherbrand Isotemp 数控水浴锅：型号 210</td><td>Fisherbrand</td><td>15-462-10Q</td><td>-</td></tr><tr><td>Fisherbrand 无菌注射器（60 mL）</td><td>Fisherbrand</td><td>14-955-461</td><td>-</td></tr><tr><td>人肺微血管内皮细胞</td><td>Sigma Aldrich</td><td>540-05A&amp;nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>Keyence BZX810 荧光显微镜</td><td>Keyence</td><td>N/A</td><td>-</td></tr><tr><td>Krayden Dow Sylgard 184 硅橡胶弹性体试剂盒，透明（1.1 磅）</td><td>Dow</td><td>4019862</td><td>-</td></tr><tr><td>Marga Cipta 铸造亚克力板，1/2 英寸厚，48×96 英寸</td><td>Marga Cipta</td><td>N/A</td><td>-</td></tr><tr><td>Masterflex L/S Easy-Load II 泵头</td><td>MasterFlex</td><td>77200-50</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 精密泵管，铂固化硅胶，L/S 16；25 英尺</td><td>MasterFlex</td><td>96410-16</td><td>-</td></tr><tr><td>Masterflex L/S 标准蠕动泵</td><td>Masterflex</td><td>07522-20</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器 0.2 至 2 &amp;mu;L</td><td>Fisherbrand</td><td>FBE00002</td><td>-</td></tr><tr><td>微量移液器 10 至 100 &amp;mu;L</td><td>Fisherbrand</td><td>FBE00100</td><td>-</td></tr><tr><td>微量移液器 100 至 1000 &amp;mu;L</td><td>Fisherbrand</td><td>FBE01000</td><td>-</td></tr><tr><td>微量移液器 5 至 50 &amp;mu;L</td><td>Fisherbrand</td><td>FBE00050</td><td>-</td></tr><tr><td>微血管内皮细胞生长培养基（500 mL）</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>111-500</td><td>-</td></tr><tr><td>Nalgene 无菌注射器滤器</td><td>Thermo Scientific</td><td>725-2520</td><td>-</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TS-100 荧光显微镜</td><td>Nikon</td><td>NI-TS100</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（DPBS，10X），Dulbecco 配方</td><td>Thermo Scientific</td><td>J61917.K3</td><td>-</td></tr><tr><td>Prusament PLA Prusa Galaxy 黑色 1 kg</td><td>Prusa</td><td>PRM-PLA-GLX-1000</td><td>-</td></tr><tr><td>Rebel Hybrid 显微镜，正置与倒置一体，Discover Echo</td><td>ECHO</td><td>76376-746</td><td>-</td></tr><tr><td>硅酮密封胶&amp;nbsp;</td><td>Loctite</td><td>908570</td><td>-</td></tr><tr><td>SolidWorks</td><td>Dassault Systemes</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>带放大刻度条的无菌聚苯乙烯一次性移液管（10 mL）</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11E</td><td>-</td></tr><tr><td>带放大刻度条的无菌聚苯乙烯一次性移液管（25 mL）</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11</td><td>-</td></tr><tr><td>带放大刻度条的无菌聚苯乙烯一次性移液管（50 mL）</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11F</td><td>-</td></tr><tr><td>带放大刻度条的无菌聚苯乙烯一次性移液管（5 mL）</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11D</td><td>-</td></tr><tr><td>链霉亲和素，Alexa Fluor 488 标记物</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>S32354</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素，Alexa Fluor 488 标记物</td><td>Invitrogen</td><td>S32354</td><td>-</td></tr><tr><td>注射器储液器&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>300865</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Alfa Aesar 1 升 牛血清白蛋白，第五组分，35% 溶液，试剂级，无脂肪酸，含叠氮化物作为防腐剂</td><td>Thermo Scientific</td><td>N12H004</td><td>-</td></tr><tr><td>管路连接器</td><td>Fisherbrand</td><td>01-000-161</td><td>-</td></tr><tr><td>含 DAPI 的 VECTASHIELD 抗荧光淬灭封片剂&amp;nbsp;</td><td>Vectashield</td><td>H-1200-10</td><td>-</td></tr><tr><td>VWR 水套式 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Avantar&amp;nbsp;</td><td>10810-744&amp;nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>WGA 生物素化抗体</td><td>Vector</td><td>B-1025</td><td>-</td></tr></tbody></table>

在三维流体芯片中模拟肺叶切除术后血管内皮糖萼——一种基于血管的器官芯片系统的构建方法

Modeling the Endothelial Glycocalyx Post-Pneumonectomy in a 3D Fluidic Chip - An Approach to Fabricating a Vascular-based Organ-on-Chip System

内皮糖萼（GCX）是一种富含碳水化合物的结构，覆盖于内皮细胞管腔表面，在调控细胞对刺激的反应中发挥关键作用。GCX由跨膜蛋白组成，可作为细胞响应的机械转导器。在稳态条件下，GCX可自然维持其结构与稳定性，但在高剪切应力暴露下可能发生损伤，并引发多种后果。尽管已有研究探讨剪切应力对内皮细胞的一般性影响，但其对血管系统——特别是肺切除术后——的影响程度与作用尚不明确。为深入探究此问题，本研究采用综合方法，构建了肺血管系统在肺切除术前与术后的计算机辅助设计（CAD）模型。通过计算流体模拟，识别出剪切应力与压力升高的关键区域，并在器官芯片（OOC）系统中重现这些区域的流体环境。将人肺微血管内皮细胞（HLMVECs）接种至与选定血管段形状一致的模具中，以表征升高剪切应力的影响。

关键词：内皮糖萼，剪切应力，肺切除术，器官芯片，计算流体动力学，人肺微血管内皮细胞 体外实验结束后，对人肺微血管内皮细胞（HLMVECs）进行免疫染色，以定性评估在肺切除术诱导的正常及增高的应力条件下糖萼层（GCX）的健康状况。通过结合计算建模与实验分析，加深了我们对剪切应力变化如何影响GCX的理解，并阐明了其对血管功能及术后并发症的作用机制。

流体模拟层流稳态研究的结果显示，与对照模型相比，肺切除模型的某些分叉处剪切应力有所增加，如图11所示。在实验步骤2.8中可视化显示，红色区域表示高剪切应力区域，而蓝色区域表示低剪切应力区域。
<img alt="主动脉的三维流体动力学模拟、压力分布图分析、血流动力学研究结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67246/67246fig11.jpg" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="图11"> 
图11：模拟的兴趣区域。流体模拟可视化肺切除模型上的兴趣区域。（A）对照模型中较浅的蓝色区域显示较高的剪切应力区域。（B）左肺切除模型中的红色区域表示较高的剪切应力区域。两个模型...

本文介绍了一种用于构建模拟肺切除术的器官芯片（OOC）系统的实验方案。该系统旨在研究糖萼损伤与肺切除术后并发症之间可能存在的关联。

内皮糖萼（GCX）是一种富含碳水化合物的结构，覆盖于内皮细胞管腔表面，在调控细胞功能中发挥关键作用……

Mensah 实验室致力于血管研究，正在开发用于研究内皮糖萼及其在血管疾病中作用的新技术。近期进展包括建立更先进的体外糖萼研究模型，以及探索针对疾病中内皮糖萼健康维护与修复的治疗策略。实验挑战主要包括现有的体外模型尚不完善，无法准确模拟健康的糖萼结构，以及定量和测量技术复杂困难。我们目前对这一领域的贡献拓展了对内皮糖萼的现有认知，特别是在其于癌症转移、受损糖萼再生以及与血管表面受体相互作用方面的作用。我们的方法提供了一种经济高效的技术，用于构建器官芯片血管系统，该系统所表达的内皮糖萼相较于传统技术更为成熟且具有生物模拟特性。首先，在一个50毫升离心管中称取10份硅胶弹性体基础材料。将一份固化剂倒入含有硅弹性体基础液的试管中，最终体积为30毫升。充分混合，得到均匀的溶液。然后将混合均匀的溶液倒入模具中，将模具放入真空室中对PDMS脱气30至60分钟，或直至无气泡残留。将脱气后的PDMS从真空室中取出，并在室温下固化48小时。从PLA模具中取出固化的PDMS，然后在每块细胞培养板中放置两段双面胶带。接下来，将每个PDMS血管结构的一半分别放置在细胞培养皿中的胶带上。使用微量移液器，沿PDMS血管结构滴加数滴30微升的纤连蛋白。根据需要倾斜PDMS，用移液器吸头将纤连蛋白均匀涂布于表面。孵育30分钟后，从PDMS中吸除纤连蛋白溶液。然后将PDMS片段置于超净台内自然干燥。在PDMS血管结构半片的每一端放置3D打印的堵头，以防止细胞悬液泄漏，每片使用两个堵头。使用微量移液器，将 300 微升 HLMVEC 细胞悬液接种到每块 PDMS 上，然后孵育。随后将两半部分放回超净台，移除四个塞子。加入 HLMVEC 培养基，使 PDMS 血管结构的两半完全浸没，再次孵育 6 至 10 小时。现在从含有血管半片的培养皿中吸除人肺微血管内皮细胞（HLMVEC）培养基。将每个PDMS半片放入聚碳酸酯块中，确保对齐准确。在PDMS血管的两端涂抹硅胶密封剂。将一英寸长的软管插入底部PDMS部件的两端。然后将带有顶部PDMS半片的上层丙烯酸块翻转，对准到底部丙烯酸块上。用螺栓将两块丙烯酸块固定在一起，并确保带螺纹的块位于底部。使用3D打印的堵头封闭管路的自由端。取下其中一个堵头，用微量移液器向血管系统中轻轻注入500 µL的HLMVEC培养基。倾斜以去除气泡，然后重新装上堵头。将组装好的芯片和无菌组件放入生物安全柜中。连接所有管路并组装流体系统，确保进样管路连接到注射器储液槽的底部，以促进重力流。现在用HLMVEC培养基轻轻预润流体系统。使用一个50毫升的血清移液管。将30毫升培养基注入注射器储液罐顶部，并以低速运行蠕动泵以填充管路。用PBS清洗每个PDMS血管半片5分钟，加入足量溶液以完全浸没血管部分。流体模拟结果显示，在肺切除模型中，与对照模型相比，血管分叉处的剪切应力显著升高。明场显微镜证实，在静态和流动条件下，24小时后于93.1毫升/分钟流速下，HLMVEC细胞均能均匀贴壁。入口分叉处的荧光成像显示，对照模型和肺切除模型中的细胞层均完整且分布良好。在第二次分叉后立即进行成像，结果显示对照组和肺切除模型均出现明显的细胞丢失。在两个模型中，第二次分叉下游区域的细胞仍保持贴壁状态，并显示出一致的染色。血管模型中DAPI染色均匀的细胞核表明，尽管受到流体剪切作用，细胞仍维持了融合状态。早期的对照模型试验由于系统启动过程中引入了气泡，导致细胞分布不均。

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科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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在此，我们介绍一种利用微加工微流控平台构建三维简化且未分化的皮肤模型的实验方案。通过平行流动方法，可实现 原位 通过注射泵控制，在真皮层隔室上沉积以供上层接种上皮细胞。...

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在开放式器官芯片上重建人类上皮组织的细胞结构与功能

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我们介绍一种利用3D生物打印技术在标准六孔板上高通量制备具有可调尺寸和特定图案血管通道的实验方案，该技术被称为“孔板上的血管”（vessels-on-a-plate,...

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学习利用器官芯片技术模拟全肺切除术后血管内皮糖萼损伤的方法。该3D流体芯片系统采用硅弹性体构建，可更准确地再现生理条件下的糖萼动态，为血管疾病治疗策略研究提供可靠的体外模型。

在三维流体芯片中模拟肺叶切除术后血管内皮糖萼——一种基于血管的器官芯片系统的构建方法

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