Name: 使用单分子磁镊分析端粒蛋白-DNA 相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-30T14:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: 了解单分子磁镊技术用于分析端粒蛋白TRF2与人类端粒DNA的相互作用机制。该方法可精确测量蛋白质-DNA复合物的解离动力学及环状结构形成，为端粒生物学研究提供重要工具。

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本工作得到中国国家自然科学基金［资助号 32071227 至 Z.Y.］、中国天津市自然科学基金（22JCYBJC01070 至 Z.Y.）以及精密测试技术及仪器国家重点实验室（天津大学）［资助号 pilab2210 至 Z.Y.］的支持。

Studying TRF1/2 Interactions with Telomeric DNA Using Single-Molecule Assay

作者声明不存在竞争性财务利益或其他利益冲突。

本方案采用磁镊技术在单分子水平上对TRF进行操控57,58,59。我们利用磁珠将TRF从基因组DNA片段中分离出来。在完成限制性酶切后，TRF会结合到磁珠上，从而易于与基因组DNA片段分离。该方法可利用磁镊对样品进行操控，磁镊能够有效捕获磁珠，而光镊则受限于透明度问题。此外，虽然原子力显微镜（AFM）也可用于单分子操控，但需要额外步骤将TRF从磁珠上解离，并将其固定在云母表面与悬臂针尖之间。相比之下，磁镊为TRF的单分子操控提供了更直接且高效的方法，无需这些额外操作步骤41。
保持基因组DNA和端粒重复序列片段（TRFs）的完整性至关重要，因为单分子操作依赖于完整的TRFs。利用磁镊技术，我们通过固定TRFs的两端来拉伸和松弛这些片段，以研究蛋白质-DNA相互作用。对磁珠施加的力进行精确测量是单分子力学实验的基础54。因此，在磁镊系统中，应将立方形磁铁与相机光路平行或正交排列（见步骤4.3.3下方的注释），以确保根据已建立的公式精确记录磁珠的三维位置54,60。磁铁偏移量对于确定其位置以及作用在磁珠上的力至关重要。我们使用厚度约为0.2 mm的#2盖玻片以保持一致性，或针对不同类型的盖玻片在计算公式中调整该偏移量54。帧率对于捕捉蛋白质-DNA相互作用的动力学过程极为关键，因此需要设置为零快门死区时间，以完整记录磁珠的运动数据。由脚本编码控制的电机运动在设计单分子力学实验中起核心作用。诸如力加载速率、施加的力及作用时间等关键参数应通过迭代方式进行设定和优化。单分子实验中所用的蛋白质浓度需经过充分的滴定实验，以确定研究蛋白质-DNA相互作用的最佳浓度。初始的力测试可采用力斜坡（force-ramp）实验结合力谱技术进行，而力跃迁（force-jump）实验则用于在恒定力条件下评估目标相互作用的力学特性。
在采用本方案时，可能会遇到一些挑战。如果TRF1或TRF2在E. coli中未能表达，应先进行小规模预实验，裂解细胞后通过SDS-PAGE电泳和染色分析蛋白表达情况，并使用标签特异性抗体进行Western Blot验证。应核对构建质粒，确保克隆正确，无突变、移码或提前终止密码子，并确认所用启动子适用于E. coli。可通过测试不同E. coli菌株（如BL21(DE3)、Rosetta）、调整培养温度（15–25 °C）、诱导时间（2–16 h）以及IPTG浓度（0.1–1 mM）来优化表达条件。对于包涵体问题，应在超声处理前后分析细胞沉淀物。针对密码子偏好性问题，可选用提供稀有tRNA的菌株或进行密码子优化。尝试不同的培养基（如LB、TB、自诱导培养基），并通过调整摇床转速和培养液体积来改善通气条件。若存在毒性问题，可使用严格调控的启动子或低拷贝数载体，并添加葡萄糖（0.2%）以抑制lac启动子的泄漏表达。应通过适当的抗生素筛选维持质粒稳定性，并优化细胞裂解方法以确保蛋白完全释放61,62。
如果在单分子实验中未发现TRF系留结构，可能的原因之一是初始基因组DNA用量不足。建议使用相当于500 ng TRF的基因组DNA来建立单分子力学实验。在磁力镊子实验中持续难以检测到TRF系留结构，可能是由于基因组DNA消化时间过长所致。应将消化过程控制在12小时以内，以避免星号活性（star activity）的发生。此外，端粒DNA单链突出末端可能形成G-四链体结构，从而抑制生物素标记寡核苷酸与磁珠的退火结合。为防止该情况，应将钾离子或钠离子浓度维持在1 mM以下，以抑制G-四链体的形成，提高在单分子实验体系中形成TRF系留结构的可能性。另外，在退火步骤（步骤3.2.5）中适当提高加热温度，有助于破坏G-四链体结构，促进生物素标记寡核苷酸与TRF的有效结合。
在存在TRF1或TRF2蛋白的情况下，由于端粒上存在大量这些蛋白的结合位点，TRF DNA链可能会发生紧密压缩，导致在磁力镊子实验中难以拉伸。通过滴定蛋白浓度，有助于确定适用于单分子力学实验的最佳浓度。可利用电泳迁移率变动分析（EMSA）或表面等离子共振（SPR）实验评估蛋白与DNA的结合亲和力，测定解离常数（Kd），从而为单分子实验选择合适的蛋白浓度提供依据。
从基因组DNA产生的TRF数量有限，可能会降低单分子检测的效率。因此，与使用人工合成的端粒DNA构建体相比，收集单分子数据可能需要更长时间。然而，直接从人类基因组中获取的端粒具有若干人工端粒DNA（通常通过细菌质粒或PCR方法制备）所不具备的优势。其一，人类TRF在长度上具有异质性，可用于研究蛋白质-DNA相互作用对端粒长度的依赖性；而人工端粒DNA通常长度均一，若要制备不同长度的人工端粒DNA，则耗时且费力。此外，人类TRF含有来自细胞的原始序列，包括自然存在的修饰、突变和损伤等天然标记，从而能够在生理或病理条件下研究蛋白质-DNA相互作用，这是使用人工端粒DNA无法实现的。
该方案对于端粒生物学领域的单分子水平研究至关重要，并可能促进靶向端粒的药物发现。

端粒是位于染色体末端的保护性结构1,2,3。细胞分裂过程中端粒的缩短会导致细胞衰老和机体老化，而端粒的异常延长则与癌症的发生相关4,5。为了确保端粒正常发挥功能，其复制、延长以及对损伤的响应必须受到高度调控6,7,8。由六个亚基组成的端粒保护蛋白复合物（Shelterin）在端粒保护中起核心作用9,10,11。对端粒更深入的理解将为端粒生物学提供宝贵的见解。
TRF1 和 TRF2 是端粒保护蛋白复合物 shelterin 的核心亚基，属于端粒 DNA 结合蛋白12,13。TRF1 和 TRF2 均通过其 Myb 结构域与端粒中的重复 DNA 序列 TTAGGG 结合14。它们通过共有的 TRFH 结构域形成二聚体，从而能够环绕端粒双链 DNA 并招募其他端粒相关蛋白15,16,17,18,19。TRF2 在端粒 D-loop 和 T-loop 的形成中尤其关键20,21。由于 TRF1 和 TRF2 在端粒保护中发挥至关重要的作用，它们已成为潜在的抗癌药物靶点22,23,24,25。
研究人员已投入大量努力来探究端粒处的蛋白质-DNA相互作用。已采用电泳迁移率变动分析（EMSA）和表面等离子共振（SPR）等生物化学方法来检测结合亲和力20,26。利用冷冻电子显微镜（cryo-EM）、X射线晶体学和核磁共振（NMR）已解析出大量端粒结合蛋白与DNA形成的复合物结构27,28,29。超分辨率成像技术，如随机光学重建显微镜（STORM），揭示了TRF2依赖性的T环形成过程21。最近，纳米孔测序技术已被开发用于分析端粒序列特征4,30,31。这些结构研究极大地增进了我们对端粒蛋白-DNA相互作用的理解。为进一步探索端粒蛋白-DNA相互作用的动态过程，开发新技术至关重要。
单分子技术是研究端粒上蛋白质-DNA相互作用的有力手段32,33,34。单分子力学方法，如磁镊、光镊和原子力显微镜（AFM），已被用于研究TRF2依赖性的DNA形变、揭示TRF2介导的人类端粒染色质的柱状堆叠结构，以及观察端粒酶的持续性催化过程等应用35,36,37,38,39,40。这些方法在探究拓扑构象以及蛋白质-DNA结合与解离动力学方面尤为有效。
然而，制备含有端粒重复序列的单分子结构仍存在挑战，这限制了单分子力学方法在相关研究中的应用。为克服这一局限，我们开发了一种单分子力学方法，用于研究全长人端粒上的全局蛋白质-DNA相互作用41。该方法直接从人细胞中提取端粒DNA，避免了人工合成端粒DNA的繁琐制备过程，有助于在跨越数千碱基对的长片段天然端粒上开展动力学过程的研究。
在本实验方案中，我们详细描述了使用磁力镊子（一种常用的单分子力学工具）探测端粒蛋白-DNA相互作用的各个步骤42,43,44。我们以TRF2为例，展示了端粒蛋白的表达与纯化方法，以及如何从人源细胞中制备端粒DNA。此外，我们还介绍了如何在磁力镊子系统上建立单分子实验以研究端粒蛋白-DNA相互作用，并涵盖了后续的单分子实验数据分析。本方案将有助于端粒生物学及靶向端粒药物研发领域的研究人员。

<table><tbody><tr><td>抗地高辛</td><td>Roche</td><td>11214667001</td><td></td></tr><tr><td>BfaI</td><td>新英格兰生物实验室 (NEB)</td><td>R0568S</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900933</td><td></td></tr><tr><td>CMOS 相机&amp;nbsp;</td><td>Mikrotron</td><td>MC1362</td><td></td></tr><tr><td>CviAII</td><td>新英格兰生物实验室 (NEB)</td><td>R0640S</td><td></td></tr><tr><td>DIG-11-dUTP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-803-DIGXL</td><td></td></tr><tr><td>DNA 提取液</td><td>G-CLONE</td><td>EX0108</td><td></td></tr><tr><td>DNase I，无 RNase，Hc Ea</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>EN0523</td><td></td></tr><tr><td>dNTP 混合物</td><td>南京诺唯赞生物科技股份有限公司 (Vazyme)</td><td>P032-02</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Solarbio</td><td>D1070</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-270&amp;nbsp; 磁珠</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>65305</td><td>链霉亲和素磁珠</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne 磁珠</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>65001</td><td>链霉亲和素磁珠</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>天津第六化学试剂厂</td><td>1083</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>北京华威锐科化工有限公司</td><td>SMG66258-1</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Solarbio</td><td>II0070</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Solarbio</td><td>I8070</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>天津第六化学试剂厂</td><td>A1079</td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>EN0523</td><td></td></tr><tr><td>Klenow 片段 (3&amp;prime;-5&amp;prime; 外切酶缺陷型)</td><td>新英格兰生物实验室 (NEB)</td><td>M0212S</td><td></td></tr><tr><td>LabView</td><td>国家仪器公司</td><td>https://www.ni.com/en-us/shop/product/labview.html</td><td>图形化编程软件&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LiCl</td><td>毕得医药科技有限公司 (bidepharm)</td><td>BD136449</td><td></td></tr><tr><td>溶菌酶</td><td>Solarbio</td><td>L8120-5</td><td></td></tr><tr><td>MseI</td><td>新英格兰生物实验室 (NEB)</td><td>R0525S</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>上海阿拉丁</td><td>C111533</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td>分光光度计</td></tr><tr><td>NdeI</td><td>新英格兰生物实验室 (NEB)</td><td>R0111S</td><td></td></tr><tr><td>Ni NTA Beads 6FF</td><td>常州智晟生命科技有限公司</td><td>SA005025</td><td></td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜</td><td>ABclonal</td><td>RM02801</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Solarbio</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶 K</td><td>碧云天生物技术有限公司 (beyotime)</td><td>ST535-500mg</td><td></td></tr><tr><td>rCutSmart 缓冲液</td><td>新英格兰生物实验室 (NEB)</td><td>B6004S</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4875</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>SERVA Electrophoresis GmbH</td><td>2124902</td><td></td></tr><tr><td>Sumo 蛋白酶</td><td>碧云天生物技术有限公司 (beyotime)</td><td>P2312M</td><td></td></tr></tbody></table>

使用单分子磁镊分析端粒蛋白- dna 相互作用

Analyzing Telomeric Protein-DNA Interactions Using Single-Molecule Magnetic Tweezers

染色体末端的保护性结构——端粒，对于维持细胞寿命和基因组稳定性至关重要。其正常功能依赖于复制、延伸和损伤应答等高度调控的过程。 Shelterin 复合物，尤其是端粒重复序列结合因子 1（TRF1）和 TRF2，在端粒保护中发挥关键作用，并已成为药物研发中潜在的抗癌靶点。这些蛋白质可结合于端粒 DNA 的重复序列 TTAGGG，促进保护性结构的形成，并招募其他端粒相关蛋白。结构生物学方法和先进成像技术已揭示了端粒蛋白与 DNA 相互作用的机制，但要研究其动态过程仍需依赖单分子技术。磁镊、光镊和原子力显微镜（AFM）等工具已被用于研究端粒蛋白-DNA 相互作用，揭示了诸如 TRF2 依赖性的 DNA 变形以及端粒酶催化过程等重要细节。然而，构建含有端粒重复序列的单分子体系仍是一项具有挑战性的任务，可能限制了单分子力学方法在该领域的广泛应用。为解决这一问题，我们开发了一种利用全长人端粒 DNA 结合磁镊技术研究相互作用的方法。本实验方案详细描述了 TRF2 的表达与纯化、端粒 DNA 的制备、单分子力学实验的建立以及数据分析流程。该详尽指南将有助于从事端粒生物学及靶向端粒药物研发的研究人员。

图1A展示了TRF1和TRF2的示意图结构域和结构，其分别由439和542个氨基酸组成，可在原核细胞中表达。TRF1的制备方法已在文献中先前报道41。本文中，我们提供了TRF2制备的详细描述及代表性结果。图1B显示了用于在E. coli中表达TRF2的质粒图谱。我们评估了E. coli中诱导前后TRF2的表达情况，如图1B所示。纯化及标签切割过程也通过SDS-PAGE进行了分析（图1C）。按照本方案，两种端粒结合蛋白TRF1和TRF2均在E. coli中成功表达。
使用四种限制性内切酶联合消化人类基因组，可获得以末端限制性片段（TRF）形式存在的端粒DNA。按照图2A所示流程图，我们从人类细胞中提取了基因组。这些酶可选择性地消化基因组DNA，而完整保留全长的端粒DNA，从而为单分子实验提供材料。我们已利用多种人类细胞系对TRF DNA的制备进行了广泛测试。通过琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性，结果如图2B所示。随后采用Southern印迹法分析TRF，使用与端粒重复序列TTAGGG互补的荧光标记寡核苷酸探针进行杂交（图2C），具体方法参见文献41,56。通常情况下，人类TRF的长度平均为数千碱基对。
单分子实验在如图3A所述组装的流动池中进行。硝酸纤维素涂层覆盖在带负电荷的玻璃表面，提供一个亲水性基质以吸附抗体。牛血清白蛋白（BSA）封闭硝酸纤维素基质中未被抗地高辛抗体结合的区域。不含铁纳米颗粒的聚苯乙烯微球用作参考微球。TRF连接结构通过硝酸纤维素基质上的地高辛抗体与磁性微球表面的生物素-链霉亲和素之间的亲和相互作用形成（图3B）。将TRF1或TRF2引入流动池，通过自由扩散与TRF DNA连接结构结合。利用磁镊调节磁场，对磁性微球施加力以拉伸和松弛TRF连接结构，从而实现对蛋白质-DNA相互作用的探测。
通过编写控制磁镊电机运动的脚本，设计了一种单分子力学检测方法。图示流程图提供了在MatLab中为磁镊单分子检测创建该脚本的系统化方法（图4A）。磁铁沿z轴移动，范围为0-25 mm。根据磁铁构型，利用文献中描述的公式54，基于磁铁位置计算作用力。针对特定的力加载速率，在MatLab中设计并编程磁铁的位置和移动速度，以实现所需的力操控曲线，如力斜坡检测示例所示（图4B-D）。
以TRF1为例，我们使用单分子磁镊探究了端粒DNA-蛋白质相互作用。实验装置可配置为力斜坡（force-ramp）测定模式，如图5A所示，在拉伸过程中力-伸长曲线呈现锯齿状特征，这是由于蛋白质-DNA相互作用断裂所致；而在松弛过程中曲线平滑，反映出无蛋白质介导环状结构的DNA纤维。该装置也可配置为力跃变（force-jump）测定模式，如图5B、C所示，使我们能够在特定受力条件下测量伸长变化以及蛋白质-DNA相互作用的持续时间。端粒DNA-蛋白质复合物的解离动力学可从这些测量结果中推导得出（图5D）。此外，DNA-蛋白质复合物中环状结构的形成可通过伸长变化得以揭示（图5E）。进一步地，可在该端粒DNA实验体系中滴定蛋白质浓度。此外，来源于人细胞的端粒DNA长度具有异质性，使我们能够研究不同长度端粒中环状结构的形成机制（图6）。
<img alt="TRF蛋白分析；质粒图谱；用于蛋白表达的SDS-PAGE凝胶电泳。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：TRF1/2的表达与纯化。（A）TRF1和TRF2的结构域结构。（B）在大肠杆菌（E. coli）中表达TRF2所用的pET28a-SUMO-TRF2质粒图谱。（C）表达与纯化各阶段样品的SDS-PAGE分析。泳道1：未用IPTG诱导。泳道2：细胞裂解后获得的IPTG诱导沉淀。泳道3：细胞裂解后获得的IPTG诱导上清。泳道4：Ni柱流穿组分。泳道5：用低咪唑缓冲液洗涤以去除杂质蛋白。泳道6：用含300 mM咪唑的缓冲液洗脱6xHis-SUMO-TRF2。泳道7：用SUMO蛋白酶消化SUMO标签。泳道8：再次通过Ni柱纯化，并用含20 mM咪唑的缓冲液洗脱去除6xHis和SUMO标签后的TRF2。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig01largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="端粒分析：DNA消化、探针标记；凝胶电泳结果；端粒序列研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：末端限制性片段（TRF）的制备。（A）从人细胞制备TRF的流程图。（B）使用1%琼脂糖凝胶检测5种人细胞系的基因组DNA完整性。（C）通过Southern印迹法对5种人细胞系进行TRF分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="聚苯乙烯微球实验示意图；用于力测量分析的磁珠装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：单分子力学实验的制备。 （A）用于单分子力学实验的流动池制备流程图。（B）使用磁镊进行单分子力学实验的示意图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="磁力测量过程及力-位置图；包含作用力计算脚本" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：单分子力学实验的设计。（A）生成用于执行力-斜坡实验的脚本的流程图。（B）磁体沿 z 轴的运动轨迹。（C）与磁体运动相对应的作用力曲线。（D）磁体位置与所产生的作用力之间的关系。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="力-伸展分析、图表与数据、生物物理学中的实验装置、Ftest、Fmax、结果" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5：通过单分子磁镊探测端粒DNA-蛋白质相互作用。 （A）在含有20 mM HEPES（pH 7.5）、1 mM EDTA和100 mM NaCl的缓冲液中，于23 °C下，采用力斜坡实验（N = 10）探测TRF1-端粒相互作用。TRF1浓度为10 nM，力加载速率为±1 pN/s。（B）在力跃实验中拉伸并松弛TRF连接物。施加的力程序为Frest = 0 pN，Ftest = 2 pN - 8 pN，Fhigh = 10 pN，Fmax = 20 pN。缓冲液和温度条件与（A）相同。帧速率为200 Hz。（C）在TRF1浓度为10 nM的力跃实验中探测TRF1-端粒相互作用。（D）TRF1-端粒复合物的解离动力学。在测试力下的解离速率对数（均值±标准差，n = 206）符合Kramer-Bell-Evans模型（红色曲线及图例公式）。插图显示在Ftest下的平均解离时间（&lt;τ&gt;）。（E）TRF1-端粒复合物断裂事件时伸展变化（ΔL）的分布。黑色和红色曲线代表高斯拟合。本图经Li等41许可修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="端粒分析：ΔL 与 TRF1 的关系图及端粒DNA断裂事件；端粒结构示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 6"> 
图6：TRF1在端粒中形成的DNA环的数量与大小。（A）在[TRF1] = 20 nM时，DNA环大小（ΔL）与端粒长度的依赖关系。曲线表示高斯拟合结果。（B）在[TRF1] = 40 nM时，ΔL与端粒长度的依赖关系。（C）ΔL与每个端粒的断裂事件数N之间的相关性。零阶相关系数为r = -0.20，p &lt; 0.001（样本量 = 1496）。（D）示意图展示了一种可能机制，解释ΔL与N之间的负相关关系，提示TRF1可将含有初级环状结构域的单个端粒压缩成高级拓扑结构。本图经Li等41许可修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
补充文件 1：用于生成脚本的 MatLab 代码 scripts.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/JoVE67251-coding%20files-MatLab%20code%20for%20generating%20scripts.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 2：恒力检测脚本.txt。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/JoVE67251-coding%20files-Script%20for%20constant%20force%20assay.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 3：力斜坡实验脚本.txt。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/JoVE67251-coding%20files-Script%20for%20force%20ramp%20assay.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表 1：配方 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>

本方案展示了如何利用单分子磁镊技术研究端粒DNA结合蛋白（端粒重复序列结合因子1 [TRF1] 和 TRF2）与从人类细胞中提取的长端粒之间的相互作用。文中描述了端粒和端粒重复序列结合因子的制备步骤、单分子实验的操作流程，以及数据采集与分析方法。

使用单分子磁镊分析端粒蛋白- DNA 相互作用

染色体末端的保护性结构——端粒，对于维持细胞寿命和基因组稳定性至关重要。其正常……

单分子方法已被用于研究端粒蛋白与DNA的相互作用。然而，构建含有端粒重复序列的单分子体系仍是一项具有挑战性的任务。在本方案中，我们概述了表达并纯化TRF2蛋白、制备端粒DNA、建立单分子力学实验以及分析所得数据的各个步骤。单分子技术是研究端粒蛋白与DNA相互作用的有力工具。单分子力学方法，如磁镊、光镊和原子力显微镜（AFM），已被用于研究TRF2依赖的DNA形变，揭示TRF2介导人端粒染色质形成柱状堆积结构，并观察端粒酶催化活性等多种应用。我们采用单分子磁镊技术研究端粒DNA与蛋白质的相互作用，能够在施加外力的条件下，精确测量蛋白质与DNA相互作用过程中DNA长度的变化。通过这些测量，我们推导出了端粒DNA-蛋白质复合物的解离动力学。此外，还揭示了这些复合物内部环状结构的形成。目前已利用冷冻电镜、X射线晶体学和核磁共振技术解析出大量端粒结合蛋白与DNA复合物的结构。这些结构方法推动了我们对端粒蛋白与DNA相互作用的理解。为了进一步研究这些相互作用的动力学特性，我们开发了一种专门用于起始端粒蛋白与DNA相互作用的单分子力学方法。单分子技术是研究端粒酶中蛋白与DNA相互作用的有力手段，尤其适用于蛋白质拓扑构象的确认以及蛋白-DNA结合与解离动力学的分析。开始转化大肠杆菌BL21 DE3细胞时，将50微升感受态细胞悬液置于冰上解冻。向感受态细胞悬液中加入1微升pET28a-SUMO TRF2质粒DNA，轻轻涡旋混匀。转化完成后，取100微升细胞悬液涂布于含有50微克/毫升卡那霉素的Luria-Bertani（LB）琼脂平板上。将细胞在37摄氏度下孵育过夜。次日，挑取转化细胞的单菌落，接种于5毫升含有50微克/毫升卡那霉素的LB培养基中进行培养。在37摄氏度、220转/分钟振荡条件下孵育18小时。孵育后，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为1毫摩尔/升，以诱导培养物表达。在20摄氏度下孵育17小时，以促进蛋白表达。将粗蛋白提取物与上样缓冲液一起上样至SDS-PAGE凝胶中。首先在Tris-甘氨酸缓冲液中以100伏电压运行样品30分钟，随后以120伏电压运行50分钟。然后使用考马斯亮蓝染色以观察蛋白质表达。进行蛋白质纯化时，将粗蛋白提取物在4摄氏度下以38,000G离心40分钟，并通过0.22微米注射器滤膜过滤上清液。将过滤后的上清液加入已用结合缓冲液预平衡的镍柱中。用结合缓冲液洗涤柱子，并用预先配制的咪唑梯度稀释蛋白，收集12个组分，每管1毫升。向浓缩并置换缓冲液后的蛋白中加入甘油，使其终浓度为50%，用于储存。通过SDS-PAGE分析成功证实了TRF2在大肠杆菌（Escherichia coli）中的表达，结果显示在诱导前和诱导后均出现对应于TRF2的明显条带。首先，将含有端粒限制性片段DNA的1×10⁷个HeLa细胞系在1,000×g下离心3分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于200 µL PBS中。经SDS、蛋白酶K和氯化钠处理后，将细胞悬液在16,900 × g离心10分钟。将上清液转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，避免混入漂浮的脂质或沉淀物。高速离心后，用500 µL 70%乙醇洗涤沉淀。干燥DNA沉淀后，小心地将其重悬于475微升TE缓冲液中，并通过轻弹管底轻轻混匀。然后加入25微升浓度为10毫克/毫升的RNase A，轻弹管壁直至沉淀完全溶解。接着加入1/10体积的3摩尔醋酸钠和两倍体积的预冷100%乙醇，将离心管置于-80摄氏度环境中冷冻2至3小时。离心并用70%乙醇洗涤后，向DNA沉淀中加入100微升TE缓冲液。轻弹管壁混匀，置于4摄氏度环境中两小时，使其充分溶解。进行DNA消化时，将4微克基因组DNA与1微升CVIA 2、2微升10倍消化缓冲液及适量水混合，总体积为20微升。将混合物在25摄氏度下孵育12小时。在热循环仪中，将混合物于75摄氏度加热3分钟，随后每30秒降低温度0.1摄氏度，直至达到25摄氏度。清洁并干燥后，用20微升0.1%硝酸纤维素涂抹底部盖玻片，并加入参考微珠。将盖玻片在 100 摄氏度下烘烤 4 分钟。组装流动池夹心结构，加热至 85 摄氏度后，用两根棉签轻轻按压组件，直至石蜡膜完全密封通道。使用磁铁将 10 微升 M270 磁珠用 50 微升工作缓冲液洗涤 5 次。洗涤后，将珠子加入到已消化的基因组DNA上，转移至1.5毫升离心管中。轻轻弹动离心管数次，以混匀珠子与DNA样品。将混合物置于冰上孵育1小时。孵育后，使用磁铁将磁珠沉降，每次用500微升工作缓冲液洗涤，共洗涤三次，每次间隔10分钟。将样品重悬于工作缓冲液中，取30微升混合物加入流动池。30分钟后冲洗未结合的磁珠。将流动池放置在物镜上方后，选择一对呈垂直排列的5毫米立方磁铁，并将磁铁支架与磁镊光路的X轴对齐以进行成像。启动图形化编程软件，连接磁镊控制器。调节视野以定位流动池底部的一个参考微球，并轻微调整物镜位置，使参考微球呈现出清晰的衍射环。编写一个 MATLAB 脚本以控制力斜坡实验中的电机运动。将该脚本导入图形化编程软件，用于测试单分子实验。在较低流速下，向流动池中加载 200 微升浓度为 10 纳摩尔的 TRF1。结合30分钟后，选择一个力斜坡实验的程序，设置力加载速率为正负一皮牛顿每秒。命名数据文件并运行实验。通过琼脂糖凝胶电泳确认基因组DNA的完整性，结果显示不同人类细胞系中的TRF长度一致。通过Southern印迹法检测到TRF中的端粒重复序列，显示出清晰的杂交信号。力-伸展曲线在力程实验中拉伸时呈现锯齿状模式，表明蛋白质与DNA相互作用的断裂。端粒DNA-蛋白质复合物的解离动力学显示，作用力与解离速率之间存在线性关系。此外，通过研究人类细胞中端粒DNA的长度异质性，可探讨不同长度端粒中的环状结构形成机制。

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