新城疫病毒血清学血凝抑制试验中抗原制备的优化

我们的研究重点是优化血凝抑制试验中的抗原制备。为了提高新城疫病毒（NDV）抗体检测的准确性，我们提供了一种快速、准确制备4-HAU抗原溶液的方法。HI试验仍是检测NDV抗体最常用的方法。

然而，包括自动化液体处理系统、高通量血清学平台以及先进成像工具在内的新技术也可整合到血凝抑制（HI）检测中。这些技术能够实现更快速、更准确的分析，尤其在处理大批量样本时具有显著优势。我们建立了一种高效的方法，结合严格的反向滴定法和明确定义的校正流程，可更准确地检测抗原储备液的血凝（HA）滴度。

该方法提供了一种准确的检测途径，并最大限度减少计算任务，从而提高检测效率和可靠性，有助于加强家禽群体中的疾病监测与控制。鸡红细胞悬液以及血凝抑制（HA HI）结果的目视判读仍可能引入变异性。本实验室将致力于标准化红细胞悬液的制备，并探索利用计算机视觉或其他方法对HA HI检测结果进行数字化，以降低主观性，提升结果的一致性。

首先，将 3 毫升 Alserver 溶液加入无菌的 15 毫升锥形离心管中。从三只非免疫鸡的翅静脉各采集 1 毫升血液。然后，立即将采集的血液转移至抗凝管中，并通过倒置轻轻混匀管内物质。

用无菌 PBS 填充试管，使总体积达到 12 毫升。轻轻混匀溶液，以确保各组分均匀分布。然后，将试管放入配备水平转子的离心机中，在 500 ×g 条件下离心 10 分钟。

离心后，小心移除试管中的上清液和白细胞层。使用移液器，将红细胞沉淀通过倒吸法混匀于99毫升无菌PBS溶液中，制备成1%红细胞悬液。为重悬冻干抗原，向含有该抗原的安瓿瓶中加入2毫升无菌PBS。

轻轻振荡安瓿瓶，使内容物完全溶解，并静置两到三分钟，以减少气泡的形成。将重悬后的溶液分装至1.5毫升离心管中，于-20 °C冰箱中保存，直至使用。首先，将40、80、120和160 µL的PBS分别加入一次性96孔V型底微孔板中相邻的四个孔内。

向每个孔中加入20微升重悬的抗原，并上下吹打10次以进行稀释。然后，明确标记一个新的微孔板用于后续步骤，并向第1至第5行的每个孔中加入25微升PBS。使用多通道移液器，将25微升稀释后的抗原溶液加入第1至第5行的第一个孔中。

上下吹打溶液至少五次，以确保均匀分布。然后，从每行的第一个孔中转移25 µL至第二个孔，并充分混匀。在第11列之后，弃去最终溶液的25 µL。

接着，从抗原浓度最低的孔开始，向每个孔分别加入 25 微升 PBS 和 1% 鸡红细胞悬液。将微量滴定板置于微孔板振荡器上充分混匀。将板静置于室温台面上约 30 分钟，使第 12 列孔中的红细胞完全沉降。

使用此处所示公式计算制备4-HAU抗原溶液的稀释倍数。根据给定公式确定所需4-HAU溶液的总体积以及抗原储备液和PBS的所需体积。使用移液器将计算出体积的PBS转移至容器中。

加入相应体积的抗原储备液，并充分混匀以制备4-HAU抗原溶液。然后，将25、50、75、100、125和150微升的PBS分别加入微量滴定板中相邻的六个孔内。向每孔加入25微升4-HAU抗原溶液，并用移液器上下吹打10次，以确保充分稀释。

使用多通道移液器，将初始排中每种稀释后的抗原溶液各25微升转移至另一排的孔中。然后，向每个孔中加入25微升PBS，再向每个孔中加入25微升1%鸡红细胞悬液。将板置于微孔板振荡器上，振荡约20秒，以充分混匀孔内液体。

仔细观察各孔中的血凝模式，并记录结果。