监测电穿孔诱导的基因工程 Tet-On 加标 HEK 细胞中动作电位产生的变化
September 6th, 2024
为了研究 体外可兴奋细胞的反应，该方案描述了在基因工程 tet-on 加标 HEK 细胞的简单可兴奋细胞模型上由于电穿孔而产生的动作电位产生的变化的光学监测，以及跨膜电压的变化，并自动提取相关参数。
电穿孔通过高压电脉冲暂时增加细胞膜通透性。有几种基于电穿孔的快速开发的临床治疗方法，靶向肌肉和神经元细胞。因此，研究电穿孔如何影响这些可兴奋细胞触发动作电位的能力至关重要。
体外实验对于了解电穿孔对可兴奋细胞的影响非常重要。然而，原代肌细胞和神经元具有非常复杂的离子通道表达谱，这使得解开激发和电穿孔之间的相互作用极具挑战性。我们开发了一种方案，使用 tet-on 加标 HEK 细胞监测电穿孔诱导的动作电位产生变化。
这些细胞表达最少的钠和钾通道补充，使它们可兴奋。因此，该单元简化了实验和所得结果的理论分析。使用我们的方案，我们发现非常温和的电穿孔已经可以极大地影响细胞的可接受性。
这些结果将为开发电穿孔和细胞可接受性的理论模型铺平道路，这将有助于社区改进心脏、大脑和骨骼肌中迅速出现的基于电穿孔的疗法。首先，将 1 毫升 PBS 移液到双孔盖玻片室载玻片的一个孔中。加入 10 μL 无菌、每毫升 1 毫克的聚-L-赖氨酸溶液，并用移液管充分混合。
在室温下无菌条件下在层流罩中孵育 1.5 小时，然后用聚-L-赖氨酸去除 PBS，无需进一步洗涤。为了接种细胞，在 1.5 mL 试管中的培养基中制备 1 比 10 稀释的多西环素储备液。现在，从 T-25 培养瓶中取出培养基。
在 37 摄氏度的二氧化碳培养箱中，用 2.5 毫升胰蛋白酶 EDTA 溶液对细胞进行胰蛋白酶消化 2 分钟。加入 2.5 mL新鲜培养基，轻轻吸取细胞，使其从表面分离。计算建立培养物所需的胰蛋白酶消化细胞悬液的体积。
从 1， 470 微升中减去先前计算的细胞悬液体积，以计算培养基的体积。要制备带有可激发 S HEK 细胞的样品，请将计算体积的培养基和胰蛋白酶消化的细胞悬液移液到一个孔中。加入 30 μL 多西环素稀释液。
在将腔室放入二氧化碳培养箱之前，通过轻轻移液充分混合。为了制备具有不可激发的 NS HEK 细胞的样品，将计算体积的培养基移液到孔中，并加入不含多西环素的 S HEK 细胞计算体积的 90%的细胞悬液。实验前，将腔室在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳培养箱中孵育 2 到 3 天。
实验前，将 3 微升电位染料储备溶液移液到 1.5 毫升试管中。将打开的试管在室温下置于层流罩中约 15 分钟，让乙醇蒸发并干燥定电位染料，然后向试管中加入 997 微升 4 摄氏度的冷培养基，使染料溶解至终浓度为 12 微摩尔。接下来，从孔中取出培养基。
向细胞中加入 1 毫升电位染料溶液。将细胞冷藏在 4 摄氏度下并孵育 20 分钟。之后，取出电位染料溶液并将其保存在试管中，以便在一天内进一步重复使用，最多可进行六次连续实验。
用 tyrode 溶液轻轻洗涤细胞 3 次。最后一次洗涤后，将 1 毫升低钾 tyrode 溶液移液到孔中。首先，准备用于电穿孔的 HEK 细胞，然后使用来自触发脉冲发生器的显微镜系统的 TTL 信号配置脉冲传输与图像采集的同步。
在腔室底部，放置两个平行的铂铱丝电极，直径为 0.8 毫米，内边缘之间的距离为 5 毫米。将腔室固定在显微镜下，然后将电极连接到脉冲发生器。使用电压和电流探头，将脉冲发生器的输出连接到示波器，以验证实验期间脉冲传递是否正确。
将细胞聚焦在明场上，并对位于电极之间中间的细胞进行成像。在延时模式下以至少每秒 25 帧的速率采集 80 张图像。用 635 纳米的激发波长照射细胞，将曝光时间设置为 10 毫秒，并在大约 700 纳米处检测发射。
采集后，请等待 2 分钟。将脉冲发生器接口上的电压调整为 63 伏。以相同的方式每 2 分钟录制一次延时摄影。
在这些采集过程中，在采集第 10 张图像时应用单个 100 微秒的脉冲。采集脉冲电压为 63、75、88、100、125、150、175 和 200 伏的图像。将电池暴露于的电场估计为施加的电压与电极距离比。
对于数据分析，将延时记录导出为 TIFF 格式，然后将单个实验中施加电压的所有延时记录放入一个文件夹中。重命名每个延时记录，以便 MATLAB 可以识别电场。对于实验开始时未应用脉冲的采集，请使用短语 000Vcm 对其进行重命名。
接下来，打开从 GitHub 下载的应用程序。单击 Select data folder（选择数据文件夹）以选择包含某个实验的延时录像的文件夹。要选择像素，请使用两个滑块来确定获得清晰膜图像的阈值下限和从分析中消除碎片的阈值上限。
现在，单击 Analyze data（分析数据）。在 Analysis（分析）选项卡中，将出现一个包含提取参数的表格。在表格的右侧，将显示所用每个电场随时间变化的相对荧光图。
从表格上方左侧的下拉菜单中选择给定电场的图形。检查所有图形，并在检测到假峰时执行手动校正。选择 Analysis（分析）选项卡底部的 Clear AUTO peaks（清除自动峰）以清除自动检测到的峰。
单击图表可手动确定新的峰值时间点。如有必要，请选择 Analysis（分析）选项卡底部的 Rerun AUTO peak detection（重新运行 AUTO 峰检测）以再次执行自动峰检测。提取的参数现在将调整为新的峰值。
然后，选择 Analysis"选项卡右下角的 Export Data"，将数据导出到与点图文件、电子表格文件和 PNG 图像相同的文件夹中。每厘米 126 伏特的电脉冲在可激发的电池中触发了多个荧光峰，如荧光随时间变化的不同振荡所示。随着电场强度的增加，响应发生变化，并以每厘米 400 伏特的速度表现出持续的去极化。
非兴奋细胞在最低电场强度下没有表现出显着的峰值，表明没有激发。在较高的电场强度下，非可激发细胞也表现出持续的去极化，表明存在电穿孔。在每厘米 150 伏特处观察到可激发电池中的最大峰值数，随着电压增加超过该点，峰值数呈下降趋势。
概述
本研究使用基因工程模型调查电穿孔对可兴奋细胞动作电位产生的影响。该协议侧重于光学监测跨膜电压变化和动作电位动力学。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 电生理学
背景
- 电穿孔通过高压脉冲增加细胞膜通透性。
- 了解电穿孔对可兴奋细胞的影响对临床应用至关重要。
- 原代肌细胞和神经元对于研究离子通道相互作用呈现复杂挑战。
- HEK细胞为此类研究提供了简化模型。
研究目的
- 监测电穿孔诱导的动作电位生成变化。
- 利用tet-on尖峰HEK细胞获得更清晰的洞见。
- 加深对电穿孔对可兴奋细胞行为影响的理解。
使用的方法
- 用于动作电位评估的光学监测技术。
- 应用于基因工程HEK细胞的电穿孔。
- 自动提取相关电生理参数。
- 用于受控观察的体外实验设置。
主要结果
- 电穿孔显著影响HEK细胞中的动作电位生成。
- 成功监测了跨膜电压的变化。
- 自动方法提供了可靠的数据提取。
- 研究结果有助于理解电穿孔对可兴奋细胞的影响。
结论
- 该协议为研究可兴奋细胞中的电穿孔提供了宝贵工具。
- 获得的洞见可能为针对肌肉和神经元细胞的临床应用提供信息。
- 进一步的研究可以扩展这些发现的影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
Electroporation-based therapies increasingly target excitable tissues, but off-target effects on neuronal and muscle cells present significant safety and efficacy challenges. This protocol enables quantitative, high-content assessment of electroporation-induced changes in action potential generation using a simplified, genetically engineered HEK cell model. The approach supports predictive de-risking and mechanistic understanding at critical discovery and preclinical inflection points for biopharma portfolios developing electroporation-enabled modalities.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of electroporation effects on excitable cell function using a controlled, minimal ion channel system.
- Supports mechanistic de-risking by isolating excitation and electroporation interplay without confounding native cell complexity.
- Facilitates predictive confidence in target engagement and safety liabilities for electroporation-based interventions.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible, optically monitored assay for quantifying action potential changes across electric field strengths.
- Delivers standardized, automated extraction of electrophysiological parameters for robust data comparison.
- Enables scalable evaluation of compound or device effects on excitable cell responses to electroporation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with translational modeling of electroporation effects in cardiac, neural, and muscle tissues.
- Supports continuity from discovery-stage mechanistic insights to preclinical risk assessment for therapy development.
- Informs biomarker strategies for monitoring electroporation-induced functional changes in target tissues.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum for electroporation-enabled therapeutics, bridging mechanistic validation and translational modeling.
- Discovery Biology: Quantifies action potential disruption and recovery, clarifying electroporation impact on excitable cell function.
- Screening: Offers a standardized, high-content assay for evaluating electric pulse parameters and candidate interventions.
- Analytics: Provides automated, quantitative readouts of transmembrane voltage and action potential metrics for cross-condition comparison.
- Translational Research: Supports modeling of dose-response and safety thresholds relevant to in vivo applications.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for mechanistic studies and preclinical risk assessment across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in electroporation effects on excitable cells and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable workflows for cross-team adoption.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient triage of electroporation-based assets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of therapies targeting excitable tissues.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, optical imaging, and quantitative data analysis.
- Needs access to fluorescence microscopy, pulse generation, and automated analysis software.
- Demands cross-team standardization of assay setup and data interpretation for reproducibility.
- Adaptation to other excitable cell models may require protocol optimization.
- Interpretation is limited to the simplified ion channel context of engineered HEK cells.
