监测电穿孔诱导的基因工程Tet-On放电HEK细胞中动作电位生成的变化

电穿孔通过高压电脉冲暂时增加细胞膜的通透性。目前已有多种基于电穿孔技术且快速发展的临床治疗方法，靶向肌肉细胞和神经元细胞。因此，研究电穿孔如何影响这些可兴奋细胞产生动作电位的能力至关重要。

体外实验对于理解电穿孔对可兴奋细胞的影响非常重要。然而，原代心肌细胞和神经元具有非常复杂的离子通道表达谱，使得解析兴奋与电穿孔之间的相互作用极为困难。我们开发了一种利用四环素诱导放电型HEK细胞来监测电穿孔引起动作电位生成变化的实验方案。

这些细胞表达最少数量的钠离子和钾离子通道，使其具有兴奋性。因此，该细胞简化了实验操作以及对所得结果的理论分析。通过使用我们的方案，我们发现非常轻微的电穿孔已能显著影响细胞的存活率。

这些结果将为电穿孔和细胞可接受性的理论模型构建奠定基础，有助于推动科学界改进心脏、大脑和骨骼肌中快速发展的基于电穿孔的治疗方法。首先，用移液器将一毫升磷酸盐缓冲液加入双孔盖玻片培养皿的一个孔中。加入10微升无菌的、浓度为每毫升一毫克的聚-L-赖氨酸溶液，并用移液器充分混匀。

在超净台中室温下无菌孵育1.5小时，然后去除含多聚赖氨酸的PBS，无需进一步洗涤。为接种细胞，取1.5毫升离心管，用培养基将多西环素储备液按1:10比例稀释。随后，从T-25培养瓶中移除培养基。

在37摄氏度的二氧化碳培养箱中，用2.5毫升胰蛋白酶EDTA溶液消化细胞2分钟。加入2.5毫升新鲜培养基，轻轻吹打使细胞从培养表面脱落。计算建立培养所需的胰蛋白酶消化后细胞悬液的体积。

从1,470微升中减去先前计算的细胞悬液体积，以计算培养基的体积。为制备含有可诱导S HEK细胞的样品，将计算出的培养基体积和胰蛋白酶消化后的细胞悬液移入一个孔中。加入30微升的多西环素稀释液。

在将培养 chamber 置于二氧化碳培养箱前，用移液器轻轻吹打混匀。制备非兴奋性 NS HEK 细胞样品时，将计算体积的培养基加入孔中，并为不含多西环素的 S HEK 细胞加入计算体积 90% 的细胞悬液。实验前，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳培养箱中孵育 chamber 两至三天。

实验前，取3微升膜电位染料储备液，加入1.5毫升离心管中。将敞口的离心管置于超净台中室温环境下静置约15分钟，使乙醇挥发，染料干燥。随后向管中加入997微升4摄氏度的冷培养基，溶解染料至终浓度为12微摩尔。接下来，从孔中移除培养基。

向细胞中加入一毫升电位敏感性染料溶液。将细胞置于4°C冰箱中孵育20分钟。随后，移除电位敏感性染料溶液，并将其保存在离心管中，可在同一天内用于最多六次连续实验的重复使用。

用Tyrode溶液轻柔清洗细胞三次。最后一次清洗后，用移液器向孔中加入一毫升低钾Tyrode溶液。首先，准备用于电穿孔的HEK细胞，然后使用显微镜系统发出的TTL信号触发脉冲发生器，以实现脉冲传递与图像采集的同步配置。

在腔室底部放置两根平行的铂铱合金丝电极，电极直径为 0.8 毫米，内侧边缘之间的距离为 5 毫米。将腔室固定在显微镜下，然后将电极连接至脉冲发生器。使用电压和电流探头，将脉冲发生器的输出端连接至示波器，以便在实验过程中验证脉冲是否正确传递。

在明场下聚焦细胞，并对位于电极中间区域的细胞进行成像。以每秒至少25帧的速度，以延时模式采集80张图像。使用635纳米的激发波长照射细胞，设置曝光时间为10毫秒，并在约700纳米处检测发射光信号。

采集后，等待两分钟。在脉冲发生器界面上将电压调节至63伏特。每隔两分钟以相同方式记录一次延时图像。

在采集图像过程中，在第10幅图像采集时施加一个持续时间为100微秒的单次电脉冲。以63、75、88、100、125、150、175和200伏的脉冲电压分别采集图像。将细胞所暴露的电场强度估算为施加电压与电极间距的比值。

进行数据分析时，先将延时录像导出为 TIFF 格式，然后将单个实验中施加不同电压的所有延时录像放入同一个文件夹中。重命名每个延时录像文件，以便 MATLAB 能够识别电场强度。对于实验开始时未施加电脉冲的采集数据，使用“000Vcm”命名。

接下来，打开从 GitHub 下载的应用程序。点击“选择数据文件夹”以选择包含一个实验延时记录的文件夹。为选择像素，请使用两个滑块来确定膜结构清晰成像的低阈值，以及用于在分析中消除碎片的高阈值。

现在，点击“分析数据”。在“分析”选项卡中，将显示一个包含提取参数的表格。在表格右侧，会显示使用每个电场时相对荧光随时间变化的曲线图。

从表格左上方的下拉菜单中选择特定电场对应的图表。检查所有图表，并在出现错误的峰检测时进行手动校正。在“分析”选项卡底部选择“清除自动峰”以清除自动检测到的峰。

单击图表以手动确定新的峰时间点。如有必要，在“分析”选项卡底部选择“重新运行自动峰检测”，以再次执行自动峰检测。提取的参数将根据新的峰进行调整。

随后，在“分析”选项卡的右下角选择“导出数据”，将数据导出至与点阵图文件、电子表格文件以及每种所用电场均对应的 PNG 图像相同的文件夹中。每厘米 126 伏特的电脉冲在可兴奋细胞中引发了多个荧光峰，表现为随时间变化的荧光信号出现明显的振荡。随着电场强度的增加，细胞反应发生变化，在每厘米 400 伏特时表现出持续性去极化。

非兴奋性细胞在最低电场强度下未表现出明显的峰形响应，表明无兴奋发生。在较高电场强度下，非兴奋性细胞也表现出持续性去极化，表明发生了电穿孔。兴奋性细胞在每厘米150伏时出现最多的峰数量，当电压超过此值后，峰的数量呈下降趋势。