实时、高通量显微镜定量人中性粒细胞胞外陷阱释放并评估拮抗剂的药理学

我们开发了一种实时显微镜检查方法，用于定量中性粒细胞胞外陷阱或 NET。这些 NET 在先天免疫防御中起着重要作用。然而，很明显，NET 在组织中的积累有助于多种炎症和自身免疫性疾病的病理生理学。

由于 NETs 的病理意义，人们对 NETosis 拮抗剂开发的兴趣有所上升。为了研究 NETosis 抑制，我们开发了一种实时显微镜方法，用于量化人类 NET 释放，使我们能够以高通量方式研究 NETosis 及其抑制。中性粒细胞是敏感细胞，由于机械、微生物和其他类型的压力，它们在纯化过程中会改变对刺激的反应。

因此，验证中性粒细胞分离方案以最大限度地减少中性粒细胞活化非常重要。因此，这项技术可以研究健康和患病个体的 NET 释放。此外，它还使我们能够研究不同生理刺激诱导的 NET 形成的动力学。

通过这种高通量显微镜技术，我们能够证明 NETosis 拮抗剂 CIT-013 是一种靶向瓜氨酸组蛋白 2A 和 4 的单克隆抗体，能够用 IC 50 或 4.6 纳摩尔有效抑制 NET 释放。这表明该测定适用于测试 NETosis 拮抗剂。在锂肝素管中收集健康志愿者的外周血后，将血液转移到新鲜的 50 毫升试管中。

用 DPBS 冲洗肝素锂管并将其转移到同一个 50 毫升管中，确保血液与 DPBS 的比例为 1:1。混合后，在密度梯度溶液上加入稀释的血液。以 400 G 离心血液 40 分钟，以最小的加速和断裂。

用 10 毫升移液器丢弃顶部血浆层。然后，使用塑料巴斯德移液管丢弃外周血单核细胞和密度梯度溶液。轻轻摇晃含有红细胞和中性粒细胞的层，然后将其重新悬浮在 15 毫升 DPBS 中。

加入 25 毫升 6% 葡聚糖和 0.9% 氯化钠溶液，倒置试管混合。孵育 25 分钟后，用 10 mL 移液管将顶部中性粒细胞层转移到新鲜的 50 mL 试管中，并以 500 G 离心 10 分钟。倒出试管以弃去上清液，并将沉淀重新悬浮在 10 毫升氯化铵钾裂解缓冲液中。

加入 40 mL相同的裂解缓冲液，在室温下孵育，同时不断倒置试管，直到溶液变为半透明。将试管以 350 G 离心 10 分钟。去除上清液后，缓慢滴加 5 毫升培养基，10% 加于中性粒细胞沉淀物上，不要使中性粒细胞悬浮。

轻轻旋转试管，直到中性粒细胞沉淀顶部的大多数红细胞重新悬浮在培养基中。去除上清液后，将中性粒细胞沉淀重悬于 10 毫升 10% 培养基中，完全重悬后，加入最多 50 毫升 10% 培养基并离心混合物，然后将沉淀重悬于 10 毫升中性粒细胞胞外捕获或 NET 测定缓冲液中。首先，向 96 孔板的每个孔中加入 0.001% 聚-L-赖氨酸溶液，并在 37 摄氏度下孵育 1 小时。

用 200 微升 DPBS 清洗孔 3 次，然后风干孔。接下来，在 Neutrophil Extracellular Trap 或 NET 检测缓冲液中重悬所需数量的中性粒细胞。将 NET 检测缓冲液中的四倍浓缩 DNA 染料转移到每个孔中。

将 NET 测定缓冲液中的四倍浓缩 NETosis 刺激物添加到相应的孔中。然后，在 NET 测定缓冲液和中性粒细胞悬液中加入四倍浓缩的 NETosis 拮抗剂到相应的孔中。将板以 100 G 离心 2 分钟。

然后，将板插入放置在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳培养箱中的活细胞显微镜分析系统中。将含有嗜中性粒细胞悬浮液的 96 孔成像板放入活细胞显微镜分析系统中后，打开系统软件。单击 schedule to acquire，然后单击加号按钮以启动。

然后，选择 scan on schedule 并单击 Next。要从头开始创建新容器，请在 create vessel （创建容器） 部分中选择 New （新建），然后单击 Next （下一步）。在 Scan Type （扫描类型） 部分中，选择 Standard （标准），然后单击 Next （下一步）。

选择扫描设置作为逐个单元格、无。图像通道，相差为绿色。采集时间，100 毫秒，物镜 20 倍。

然后单击 Next。从 Vessel Selection 部分，选择要扫描的适当容器类型，然后单击 Next。指定容器在抽屉中的位置，然后单击 Next。

在 Scan Pattern （扫描模式） 部分中，选择需要扫描的孔和每个孔的图像数量。单击 Next。在 Vessel Notebook （船只笔记本） 部分中，提供有关船只的信息。

输入板名称，然后单击 Next。在 Analysis Setup 部分中，选择 defer analysis until later，然后单击 Next。在 Scan Schedule 部分中，选择 create new schedule with scans at intervals of，然后在 Add Scans to Schedule 部分中选择一小时。

选择 Stop scanning at the five hours after the first scan。单击 Next，然后单击 Add 以计划何时扫描信息正确。获取中性粒细胞的相差和免疫荧光图像后，启动活细胞显微镜分析软件。

从视图中，选择要分析的活细胞显微镜实验。选择 Create New Analysis Definition，然后单击 Next。然后，从 Analysis Type 部分选择 basic analyzer 并单击 Next。

在 Image Channel 部分中，选择绿色，取消选择相位，然后单击 Next。打开图像图层窗口，选择绿色并取消选择相位。关闭绿色部分中的自动缩放，并手动设置 min 和 max。

然后打开容器扫描时间窗口并选择代表 NET 阳性对照孔的图像。打开分析定义设置窗口，为对象名称写入 NET。对于分段，请选择 Adaptive。

对于阈值 GCU，请选择 3 到 5 之间，并将 Edge Split On （边分割打开） 设置为负 10 到 0 之间。接下来，为了进行清理，选择 Hole Fill to 100 square micrometers（填充孔）并将大小调整为负 1 像素。从滤镜中，选择大于 200 平方微米的区域、小于 24.6 的平均强度和大于 7， 000 的积分强度。

然后点击 预览当前 or 全部预览 应用设置。将鼠标悬停在不同的 NET 结构上并调整分析设置以微调假阳性和假阴性 NET。当 NET 分析的设置正确时，单击 Next。

在 Scan times and well （扫描时间和井） 部分中选择要分析的时间点和井，然后单击 Next（下一步）。在 Save and Apply Analysis Definition 部分中插入定义名称，然后单击 Next。单击 Finish （完成） 当分析信息得到验证和正确后。

通过单击感兴趣容器中的分析来打开实验分析。然后，打开 Graph metrics （图表指标） 窗口。接下来，单击加号按钮以创建量度。

当以 NET 汇合百分比表示数据时，选择 Metric （指标） 部分中的 Area （面积），然后在 Value （值） 部分中选择 Confluence。将数据显示为 NETting 嗜中性粒细胞的百分比时，请选择 Object Count 在 Metric 部分，然后选择 Per image 在 Value 部分。配置 Metric 设置后，在用户定义的 Metrics 部分中，选择 NETs Area Confluence 或 NETs Object Count Per Image。

分别从 Select Scans 和 Select Well 部分中选择所有需要的时间点和孔进行分析。最后，单击 Export Data。与 PMA 相比，钙离子载体刺激诱导更快的 NETosis，这导致更高比例的中性粒细胞释放 NETs。

钙离子载体诱导的 NETs 在中性粒细胞质膜之外更分散，而 PMA 诱导的 NETs 仍然更靠近中性粒细胞质膜。当中性粒细胞被包被免疫复合物、 FMLP 和单钠尿酸盐晶体激活时，观察到 NET 水平升高的趋势。响应 23187 的 NET 释放被 CIT-013 在 4.6 纳摩尔的半数最大抑制浓度下完全抑制。