Name: IDH1 突变弥漫性低级别胶质瘤的外植体培养方案 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-09T12:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: 学习非酶解外植体培养技术，用于IDH1突变弥漫性低级别胶质瘤的长期体外培养。该方法可维持肿瘤细胞特性并支持细胞可塑性研究，为神经肿瘤学研究提供可靠平台。

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本研究所用的肿瘤组织碎片来自蒙彼利埃大学医院生物资源中心（CRB@chu-montpellier.fr）保存的神经学类新鲜组织样本库（NEUROLOGY 收集样本）。本研究在名为“&#34;Gliomacult：低级别胶质瘤的表征与原代培养&#34;”的项目下开展，项目负责人为 J. P. Hugnot 教授（项目编号：RECH/P722/1-5）。本工作获得法国抗癌联盟（La ligue contre le cancer）、癌症研究协会（ARC）、ARTC、ARTC SUD、Les Etoiles dans la mer、EMBALL'ISO、奥克西塔尼大区（Région Occitanie）以及法国国家癌症研究所（INCA）的支持。K.A.C 受墨西哥国家人文科学与技术委员会（CONAHCYT）和法国脑肿瘤研究协会（ARTC）资助。

本方案所使用的肿瘤组织片段来源于一个经过充分表征且获得伦理批准的样本库，并已取得患者的知情同意。本研究在题为Gliomacult: Characterization and Primary Cultures of Low-Grade Gliomas（项目编号：RECH/P722/1-5）的项目下开展，并已于2023年8月28日获得肿瘤生物样本库科学委员会的批准。
1. 培养平板的制备
注意：这些步骤需在无菌组织培养超净工作台内进行。
<ol>
	<li>培养前至少1小时，准备多聚-D-赖氨酸（PDL）和层粘连蛋白（laminin）包被的24孔板。
	<ol>
		<li>将10 mg PDL粉末溶于100 mL硼酸盐缓冲液（pH 8.4）中，终浓度为100 µg/mL。溶解后，用0.22 µm滤器过滤以保证无菌。PDL可直接使用；分装成每份3 mL，于-20 °C保存。</li>
		<li>在4 °C条件下解冻1–2 mg/mL的层粘连蛋白管，以避免凝胶形成。分装成每份50 µL，于-20 °C保存。 
		注意：应避免反复冻融。</li>
		<li>包被操作
		<ol>
			<li>可选步骤：将适用于细胞培养皿的无菌盖玻片（直径13 mm）放入24孔板中，每孔一片。 
			注意：此步骤用于后续胶质瘤组织块的免疫染色。</li>
			<li>进行孔板包被时，将3 mL PDL溶液加入9 mL 1×PBS中混匀，再加入50 µL层粘连蛋白。每孔加入500 µL该混合溶液，使包被浓度达到1–2 µg/cm²。将包被后的板在室温下孵育，最好以15 RPM缓慢摇动，至少1小时。</li>
			<li>在接种培养前，立即吸去各孔中的PDL-层粘连蛋白溶液，并用无菌1×PBS冲洗两次。 
			注意：切勿让孔板干燥。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 培养基
<ol>
	<li>在含有L-谷氨酰胺的DMEM/F12培养基中培养IDH1突变型组织块，并添加N2和不含维生素A的B27组成的无血清替代物。使用抗生素（包括环丙沙星、庆大霉素和制霉菌素）以防止细菌和真菌污染。此外，在培养基中加入肝素、EGF和FGF2等生长因子，经0.2 µm滤器过滤后，置于4 °C保存不超过2周。 
	注意：有关培养基成分及制备的详细信息，请参见表1和材料表。</li>
</ol>
3. 组织块制备
<ol>
	<li>在样品处理前，按照图示准备实验区域和无菌工具 图1A用70%乙醇喷洒冰袋进行消毒。将剪刀和镊子浸入70%乙醇中消毒，再用PBS冲洗。</li>
	<li>立即将切除的肿瘤组织置于冰上并尽快送至培养处， ideally within 2 h post surgical extraction (图1B). 
	注意：肿瘤样本的直径应至少为9-10 mm，以确保获得更佳的结果。组织样本无需使用培养基运输，此方法更适用于组织学目的。运输过程中不使用液体可防止快速冷冻时形成冰晶，从而在必要时保持组织完整性，以便后续进行组织学检查。</li>
	<li>将含有肿瘤样本的培养皿置于冰袋上，用1×PBS轻轻冲洗以去除多余的血液。</li>
	<li>切除的肿瘤通常表现出显著的体积和异质性，包含肿瘤组织、浸润性组织以及非肿瘤性成分图1C）。选择呈现灰色、质地柔软或呈胶冻样的区域进行肿瘤细胞分离，因为这些区域通常含有较多的肿瘤细胞。相反，应避免选择坚硬且呈白色的区域，因为这些区域可能含有较少适合培养的肿瘤细胞（图1D），以及发黑区域，因为这些区域可能是电灼造成的，可能无法提供可靠的分析结果。</li>
	<li>将所选样本转移至1.5 mL微量离心管或冻存管中用于剪切。向1.5 mL微量离心管或冻存管中加入1 mL无菌培养基，用无菌剪刀将样本剪切成小块（1–2 mm）3获得。 
	注意：通常需要切碎约1-2分钟，以获得1-2 mm的微小组织片段3 大小（图1E).</li>
	<li>用无菌剪刀小心修剪蓝色导管的末端 1,000 µL 移液枪头以形成一个直径约3-4 mm的宽口。使用此改造后的枪头，移取50-200 µL 将切碎的组织碎片加入各孔中，并均匀分布。由于较小的碎片容易快速沉降，需轻轻重悬各孔中的混合液，以确保分布均匀。 
	注意：避免过度密集，每个孔中加入的组织块数量不宜过多，以保持适当平衡（图1F).</li>
	<li>将肿瘤组织碎片孵育于 37°C 在5% CO₂、100%湿度的培养箱中孵育。若肿瘤代谢活性较强（表现为培养基迅速变黄）或每孔中组织碎片数量较多，需每日更换培养基。换液时应小心操作，使用配有 200 µL 尖端，注意避免扰动任何附着的肿瘤碎片。</li>
</ol>
<img alt="肿瘤组织制备流程；设备设置；组织样本；离心结果；分析图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67260/67260fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：肿瘤外植体培养流程。 本研究获取了一名44岁患者经手术切除的弥漫性低级别胶质瘤组织，根据WHO 2021分类标准诊断为II级星形细胞瘤。该肿瘤携带IDH1突变（第4外显子c.395 G&gt;A，p.Arg132His）和TP53突变（第8外显子c.843_844delinsGT，p.Asp281_Arg282delinsGluHis），同时ATRX染色缺失。TERT基因的Ets/TCF结合位点（C250T和C228T）未检测到突变。（A）操作台面配备冰袋，以提供低温环境，最大限度减少样本降解并维持生物组分的活性。这些措施对保持组织的质量和完整性至关重要。（B）样本应置于冰上，从医院运输至实验室。（C）肿瘤切除组织片段。箭头指示最适合用于培养的区域。（D）对肿瘤组织进行解剖，以挑选最适宜切碎的部分。根据我们的经验，白质区域通常较难成功形成外植体。（E）使用剪刀机械剪碎后，直径约为1–2 mm³的肿瘤组织碎片置于15 mL离心管中。（F）显示在24孔板中每孔接种所需的肿瘤组织块数量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67260/67260fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
4. 肿瘤组织切碎与冷冻保存及解冻
注意：冷冻保存可确保在发生污染或外植体培养物丢失时有备份，或用于后续处理肿瘤样本。
<ol>
	<li>冷冻保存：通过将 2 mL DMSO 加入 8 mL 细胞培养基中，制备冷冻保存液（20% v/v DMSO 溶液）。</li>
	<li>将 1 体积的剪碎肿瘤悬液与等体积的 20% DMSO 冷冻保存液混合，使 DMSO 的终浓度为 10%。轻轻吹打混匀，确保充分混合，然后将约 1 mL 混悬液分装至冻存管中。</li>
	<li>迅速将冻存管转移至程序降温盒中，进行逐步降温，随后在 -80 °C 条件下过夜孵育，之后转入液氮中长期保存。 
	注意：此步骤必须在细胞加入冷冻保存液后立即进行，因为某些冷冻保护剂（如 DMSO）若在室温下暴露时间过长，可能对细胞产生毒性。</li>
	<li>复苏：从液氮中取出冻存管，立即放入 37 °C 水浴中，直至约 80% 的细胞悬液融化。</li>
	<li>为去除 DMSO，迅速将细胞悬液转移至含有 5 mL 预热的 1× PBS 的 15 mL 离心管中，以 300 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>吸除上清液，用 1× PBS 重复洗涤一次，再次离心（步骤 4.5）。小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀，然后加入适量培养基，将细胞悬液转移至预先包被多聚赖氨酸-层粘连蛋白（PDL-Laminin）的 24 孔板中，放入培养箱中培养。</li>
	<li>24 小时后，确认细胞已贴壁。数天后，通过更换培养基去除未贴壁的细胞碎片。</li>
</ol>
5. 培养物传代
注意：一旦建立，外植体可用于活细胞显微成像或免疫染色。或者，如果肿瘤细胞已从外植体迁移出来且形态健康，可通过酶解离方法将外植体传代，并重新接种至培养孔中以进行后续实验。然而，需要注意的是，本方案并不适用于多次传代。通常情况下，在肿瘤细胞出现衰老或死亡之前，仅能进行一次传代。并非所有外植体培养均能成功实现传代。
<ol>
	<li>传代时，移除旧培养基，用 1× PBS 洗涤，每孔加入 (125 µL) 0.05% 胰蛋白酶-EDTA，于 37 °C 孵育 3–4 分钟，随后加入 6.5 µL 胰蛋白酶抑制剂、12 µL 20 mM CaCl2（终浓度稀释至 2 mM）和 1 µL DNase I。 
	注意：解离所需的孵育时间可能因培养物而异。重要的是在至少 3 分钟后检查细胞是否已脱落。通常，组织块可能不会完全解离成单细胞悬液，常会保留小的细胞团簇，这些团簇可用于建立新的组织块培养。</li>
	<li>使用设置为 500–600 µL 的 p1000 移液器轻柔吹打以分散组织块。避免产生气泡。</li>
	<li>加入 5 mL 1× PBS，以 300 × g 离心 5 分钟。吸除上清液，将沉淀重悬于新鲜预温培养基中，并进行细胞计数以用于接种。</li>
	<li>通过相差显微镜观察分裂细胞，识别具有生成细胞系潜力的培养物。这些分裂中的细胞通常呈圆形，且可见染色体，如 图 2A 所示。</li>
</ol>

<ol><li>Dasgupta, P., Balasubramanyian, V., De Groot, J. F., Majd, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+models+of+low-grade+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Preclinical models of low-grade gliomas.</a> Cancers (Basel). 15 (3), 596(2023).</li>
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<li>Kloosterman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+microglia+across+contexts+of+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Morphology of microglia across contexts of health and disease.</a> Cell. 187, 5336-5356.e30 (2024).</li>
<li>Thomas, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2021+updates+to+the+World+Health+Organization+classification+of+adult-type+and+pediatric-type+diffuse+gliomas%3A+A+clinical+practice+review%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">2021 updates to the World Health Organization classification of adult-type and pediatric-type diffuse gliomas: A clinical practice review.</a> Chin Clin Oncol. 12 (1), 7(2023).</li>
<li>Azar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+characterization+of+IDH1-mutated+diffuse+low+grade+gliomas+reveals+tumor+heterogeneity+and+absence+of+EGFR%2FPDGFRalpha+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular characterization of IDH1-mutated diffuse low grade gliomas reveals tumor heterogeneity and absence of EGFR/PDGFRalpha activation.</a> Glia. 66 (2), 239-255 (2018).</li>
<li>Bhaduri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+radial+glia-like+cancer+stem+cells+contribute+to+heterogeneity+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Outer radial glia-like cancer stem cells contribute to heterogeneity of glioblastoma.</a> Cell Stem Cell. 26 (1), 48-63.e6 (2020).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

建立 IDH1 突变型低级别胶质瘤的体外和临床前模型尤为困难，原因在于这类肿瘤生长缓慢，且 IDH 突变引起的广泛基因组和表观基因组改变难以在实验中重现。此外，这些浸润性肿瘤细胞会与周围的免疫细胞、内皮细胞、胶质细胞以及神经元细胞发生主动相互作用，甚至可能依赖这些细胞存活。这种复杂的相互作用在实验室环境中难以模拟。
为了揭示 IDH1 突变型低级别胶质瘤的新生物学机制，并推动创新疗法的开发，建立能够真实再现人类疾病复杂性的模型至关重要。与胶质母细胞瘤等高级别胶质瘤相比，目前针对低级别胶质瘤的 体外 可用于IDH突变型胶质瘤研究的模型较为有限。大多数IDH1突变型细胞系来源于高级别胶质瘤，例如间变性少突胶质细胞瘤（如BT260和BT237），这些细胞系携带额外的突变，仅能部分模拟伴有IDH1突变的弥漫性低级别胶质瘤的特征。
该方法有一些关键步骤需要考虑。首先，切除的肿瘤通常体积较大且具有显著异质性，包含肿瘤组织、浸润组织以及非肿瘤成分。区分这些不同部分可能存在困难，从而增加培养取材时的选择难度（<strong ...

弥漫性胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤。尽管接受高强度治疗（手术、放疗和化疗），这些肿瘤目前仍无法治愈1。越来越多的证据支持胶质瘤的发生起源于大脑中固有的成体干细胞或胶质前体细胞2。尽管胶质母细胞瘤是最具侵袭性的类型，但弥漫性低级别胶质瘤（DLGG，2级肿瘤）&#160;也较为常见（占弥漫性胶质瘤的15%）1,3。DLGG生长缓慢，并沿白质纤维束迁移，这是此类“弥漫性”肿瘤的典型特征4。这些DLGG即使经过治疗也常常复发，最终进展为高级别恶性肿瘤（3级和4级）5。
弥漫性低级别胶质瘤（DLGG）的特征是异柠檬酸脱氢酶1或2基因（IDH1或IDH2）发生错义突变，导致致癌代谢物2-羟基戊二酸（2HG）异常生成。这会通过表观遗传失调干扰细胞分化6。IDH1突变型胶质瘤可进一步分为不同亚型：星形细胞瘤通常伴有ATRX和P53基因突变，而少突胶质细胞瘤则以1p/19q共缺失为特征7。这些肿瘤具有肿瘤细胞的异质性。单细胞RNA测序和免疫表型分析表明，此类肿瘤内存在多种类型的肿瘤细胞，表现出类似干细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞的表型8,9。
与胶质母细胞瘤不同，后者可受益于大量现成的长期培养物和细胞系，目前尚缺乏专门用于研究IDH1突变型肿瘤的细胞工具1。这严重阻碍了针对IDH1突变型胶质瘤发生机制、疾病进展以及治疗开发的深入研究。传统的血清培养细胞系虽然已被长期使用，但其转录谱已发生改变，无法充分模拟原始肿瘤特征。相比之下，无血清培养条件——无论是二维还是三维肿瘤类器官模型——能够更有效地维持肿瘤细胞的转录谱及其体内表型特征，例如向正常脑组织的侵袭能力10,11。
此外，源自患者手术标本的短期细胞培养物可保留肿瘤的分子特征和细胞异质性，因而相较于细胞系更能真实反映肿瘤的生物学特性12在此，我们介绍一种简单的非酶法培养源自新鲜或冷冻患者切除组织的IDH1突变型弥漫性低级别胶质瘤类器官的方法，旨在满足对改进模型的迫切需求 体外 用于胶质瘤研究和治疗开发的模型。它们还具有获得IDH1突变细胞系的潜力。

<table><tbody><tr><td>抗ASCL1</td><td>BD Pharmingen&amp;trade;</td><td>556604</td><td>稀释比例 1:500</td></tr><tr><td>抗ATRX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA001906</td><td>稀释比例 1:100</td></tr><tr><td>抗CD68</td><td>Agilent</td><td>M081401-2</td><td>稀释比例 1:500</td></tr><tr><td>抗GFAP</td><td>Aves Labs</td><td>AB_2313547</td><td>稀释比例 1:500</td></tr><tr><td>抗IBA1</td><td>Fujifilm Wako Antibodies</td><td>019-19741</td><td>稀释比例 1:1000</td></tr><tr><td>抗IDH1 (R132H) 小鼠单克隆抗体</td><td>Dianova</td><td>DIA-H09</td><td></td></tr><tr><td>抗Ki67</td><td>BD Pharmingen&amp;trade;</td><td>556003</td><td>稀释比例 1:1000</td></tr><tr><td>抗OLIG1</td><td>R&amp;D Systems&amp;reg;</td><td>AF2417</td><td>稀释比例 1:300</td></tr><tr><td>抗OLIG2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MABN50</td><td>稀释比例 1:250</td></tr><tr><td>抗SOX9</td><td>Abcam&amp;reg;</td><td>EPR14335-78</td><td>稀释比例 1:100</td></tr><tr><td>B-27添加剂（50倍浓度），不含维生素A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>CiteAb</td><td>A-421-100</td><td></td></tr><tr><td>盐酸环丙沙星</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1044-1G</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell</td><td>Corning&amp;reg;</td><td>432000</td><td>细胞冷冻容器，适用于12个1 mL或2 mL冻存管</td></tr><tr><td>盖玻片 &amp;Oslash;，13 mm</td><td>Karl Hecht&amp;trade; Assistent&amp;trade;</td><td>328017</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12，不含谷氨酰胺</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21331020</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶I（DNAse I）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;prime;s磷酸盐缓冲液（PBS）1x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 mm TC处理细胞培养皿</td><td>Corning&amp;reg;</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24孔透明平底板</td><td>Corning&amp;reg;</td><td>353047</td><td>TC处理多孔细胞培养板，带盖，无菌&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>真菌抑制剂（Fungin）</td><td>InvivoGen</td><td>ant-fn-1</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15750-037</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-100KU</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-3375</td><td></td></tr><tr><td>人EGF</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15-1MG</td><td></td></tr><tr><td>人碱性FGF</td><td>PeproTech</td><td>100-18B-1MG</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>N-2添加剂（100倍浓度）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>多聚赖氨酸（PDL）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7886</td><td></td></tr><tr><td>带GF/0.2 &amp;micro;m Supor膜的37 mm血清级针头滤器</td><td>PALL Corporation</td><td>4525</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶抑制剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Z1 Apotome 3显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td>直立式宽场落射荧光显微镜</td></tr></tbody></table>

idh1突变型弥漫性低级别胶质瘤的组织块培养方案

A Protocol for Explant Cultures of IDH1-mutant Diffuse Low-grade Gliomas

弥散性胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤，根据组织病理学标准和基因突变分为低级别和高级别。弥散性低级别胶质瘤是其中的一个亚型，主要影响年轻成人，并易进展为高级别胶质瘤。弥散性低级别胶质瘤主要有两种类型：星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤，每种类型均具有独特的遗传和组织学特征。这类肿瘤通常表现出代谢酶IDH1的突变形式，从而干扰细胞分化。肿瘤具有异质性，包含增殖性干细胞以及更成熟的静止态胶质细胞。
患者特异性的 体外 肿瘤模型在揭示致癌机制和为个体化治疗定制药物选择方面具有重要意义。然而，目前缺乏可靠的 体外 针对IDH1突变型低级别胶质瘤的模型匮乏，阻碍了基础与转化研究。本文介绍一种简单的方法，可在无需酶解离的情况下，于特定培养基中培养IDH1突变型肿瘤组织外植体。这些外植体可长期维持，保留IDH1突变蛋白的表达，以及少突胶质前体细胞标志物（如ASCL1（MASH1）、OLIG1和OLIG2）和星形胶质细胞标志物（GFAP、SOX9）。此外，这些外植体亦可由DMSO冷冻保存的肿瘤组织建立。此类培养体系可作为药物筛选、活细胞显微成像和基因研究的宝贵平台，有助于推动对这类难治性肿瘤的理解与治疗进展，并具备获得IDH1突变型细胞系的潜力。

几天后，部分肿瘤碎片会附着在培养板孔的表面，从而启动细胞从组织块中外移生长。初始接种至出现肿瘤细胞生长所需的时间因样本而异。初期培养物中常含有大量细胞碎片，使得难以判断活细胞的存在。因此，培养至少应维持4周。一旦细胞开始生长，便可观察到呈双极或多重突起形态的长形细胞（图2B、C）。
解冻冷冻保存的肿瘤组织碎片时，外植体培养的成功率可能会略有下降。尽管我们尚未准确量化冷冻保存的影响，但成功率的降低似乎较为轻微。如图2D所示的三个案例中，我们未观察到源自新鲜肿瘤与冷冻保存肿瘤的细胞在形态学上存在显著差异。对于冷冻保存的样本，通常也能观察到细胞从肿瘤外植体中明显且广泛地迁移。如图2E所示，即使在外植体仅传代一次后，仍可观察到具有双极形态的肿瘤来源细胞形成复杂而广泛的网络结构。这些外植体培养物可用于活细胞显微录像，从而详细观察细胞从外植体迁移的过程。例如，我们提供了一段视频，显示...

携带IDH1突变的弥漫性低级别胶质瘤是一种罕见肿瘤，难以进行培养。我们介绍一种简单的非酶解组织块培养法，可维持IDH1突变蛋白的表达，并使培养物持续存活数月。重要的是，该技术适用于冻存肿瘤组织，为胶质瘤研究提供了宝贵的资源。

IDH1突变型弥漫性低级别胶质瘤的组织块培养方案

弥漫性胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤，根据组织病理学标准和遗传学特征分为低级别和高级别……

在我们的实验室中，我们专注于一种罕见的脑肿瘤，即弥漫性低级别胶质瘤。这类胶质瘤常影响年轻成年人，其特征是存在 IDH-1 基因的突变。胶质瘤研究领域的主要进展包括：第一，使用三维模型（如肿瘤类器官或类器官）；第二，对移植了胶质瘤的小鼠脑部进行直接成像；第三，应用特殊的转录组学和单细胞 RNA 测序技术。我们在研究 IDH-1 突变型胶质瘤时面临的主要挑战是这些细胞增殖能力低，且难以在体外培养中长期维持。为此，我们建立并定义了一种能够保持细胞存活的实验方案。对于部分样本，我们成功建立了细胞系，但并非所有患者样本均能建系。通过在体外以及体内对 IDH-1 突变型细胞的研究，我们发现这些细胞具有较强的可塑性，能够呈现两种不同的细胞命运：星形胶质细胞样或少突胶质细胞样。此外，我们还发现 Nudge 蛋白在调控这种可塑性过程中发挥着重要作用。借助这一新的组织块培养方案，我们已能够在体外将 IDH-1 突变型细胞维持数周，甚至数月之久，并且证实了肿瘤细胞存在多种不同类型，这与我们在患者体内观察到的结果一致。我们还发现，某些肿瘤微环境中的细胞（如小胶质细胞）使得研究肿瘤细胞与其周围环境之间的相互作用成为可能，因此这些模型能够更准确地反映肿瘤中所存在的生物学多样性。首先，准备好实验工作区并摆放所有已灭菌的器械。将肿瘤切除组织转移至冰上，以保持组织活性，便于后续培养。观察肿瘤切除组织的大小和异质性。选择呈现灰白色、质地柔软或呈胶冻样的区域，因为这些区域富含肿瘤细胞。将选定的肿瘤样本转移至1.5毫升离心管或冻存管中，并加入1毫升培养基。使用无菌剪刀将样品切成大小为一至二立方毫米的小块。接着，用无菌剪刀剪去1,000微升移液器吸头的尖端，形成一个直径约三至四毫米的宽口。用剪切过的吸头吸取100至200微升的组织碎块，移入培养板的孔中。轻轻重新混匀悬液以确保分布均匀，因为较小的组织碎片容易快速沉降。将培养板置于37摄氏度、含5%二氧化碳和100%湿度的培养箱中。如果肿瘤的代谢活性导致培养基迅速变黄，或因组织碎片密度较高而需要时，应每天更换培养基。首先，获取切碎的肿瘤组织悬液。在配制冻存液时，将两毫升 DMSO 加入八毫升细胞培养基中。取一份体积的切碎肿瘤悬液，与等体积的已配制好的 20% DMSO 冻存液混合。轻轻吹打混合液，确保充分混匀。迅速将冻存管转入低温容器中，以实现温度的逐步降低，随后在零下80摄氏度孵育过夜，再转移至液氮中进行长期保存。解冻时，从液氮中取出冻存管，立即放入37摄氏度水浴中。待约80%的细胞融化后停止复温。为去除DMSO，迅速将悬液转移至含有5毫升预热的1×PBS的15毫升离心管中，于300 ×g离心5分钟。弃去上清液，重复PBS洗涤一次，随后再次离心。吸去上清液，确保沉淀物不受扰动。用适量培养基重悬沉淀物，并将其转移至预先包被多聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白的24孔板中。在37摄氏度下孵育培养板。在培养至少四周后，可观察到从贴附于孔板表面的肿瘤外植体中生长出具有细长、双极或多极形态的细胞。在三个病例中，新鲜肿瘤与冷冻保存肿瘤来源的细胞表现出相似的形态特征，均呈现细长和双极形态，并形成复杂的网络结构。可清晰观察到肿瘤来源细胞沿纤维的放射状迁移。失败的外植体培养表现出非黏附的组织碎片和大量含有自发荧光和脂质成分的含格特细胞。

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IDH1 突变弥漫性低级别胶质瘤的外植体培养方案

本视频展示了从弥散性内生型桥脑胶质瘤（DIPG）患者脑干组织中分离和培养胶质前体细胞的过程。从肿瘤组织中分离的胶质细胞 通过...

分离与培养弥散性内生性脑桥胶质瘤细胞

恶性胶质瘤是一类具有显著临床和分子特征的高度侵袭性胶质肿瘤，其构成具有异质性。在临床前动物模型中，原位移植的原代异种移植瘤能够重现恶性胶质瘤亚型的组织病理学和分子特征。...

原位胶质瘤原代异种移植模型重现浸润性生长及异柠檬酸脱氢酶I突变

采用无血清神经球培养基对分离的高级别胶质瘤手术标本进行传代培养，以富集具有肿瘤干细胞表型的细胞。对于无法形成神经球的标本，提供了一种替代性实验方案。同时介绍了保持神经球三维结构的石蜡包埋技术，用于免疫细胞化学分析。...

优化高级别胶质瘤手术标本的细胞培养，用于临床相关动物模型及三维免疫化学分析

本文介绍了一种简单的方法，用于分离和流式细胞术分析胶质瘤浸润的外周血单个核细胞，该方法可获得随时间变化的定量数据，反映进入早期脑肿瘤微环境的免疫细胞数量及其活化状态。...

胶质瘤浸润性外周血单个核细胞的分离与流式细胞术分析

本方案描述了一种快速处理死后弥散性内生型桥脑胶质瘤样本的方法，用于建立患者来源的细胞培养模型，或直接对肿瘤细胞及微环境细胞进行表征。...

一种快速进行弥漫性内生型桥脑胶质瘤（DIPG）死后细胞培养的方案

本研究介绍并描述了两种特定人源神经类器官的培养方案 ，作为研究以下两个方面的相关且精确的模型：1）仅在人源神经类器官内研究人脑胶质母细胞瘤的发展；2）生成三维类器官以诱导多巴胺能神经元分化。...

人脑类器官在脑癌与神经退行性疾病研究中的应用

本文介绍了一种用于实时研究人胶质瘤细胞（hGC）迁移的离体混合单层培养系统。该模型能够在分隔式培养腔内观察hGCs与有髓鞘及无髓鞘轴突之间的相互作用。...

在背根神经节轴突-少突胶质细胞共培养体系中实时监测人胶质瘤细胞迁移

本研究介绍了一种应用于儿童弥漫性中线胶质瘤细胞系的活细胞三维免疫细胞化学技术方案，可用于实时研究动态过程（如三维细胞侵袭和迁移）中细胞质膜上蛋白质的表达情况。...

儿童弥漫性中线胶质瘤的活体三维细胞免疫细胞化学检测

蛋白质组失调在弥漫性浸润性胶质瘤的扩散过程中起着重要作用，但仍有多种相关蛋白质尚未被鉴定。数字空间分析技术（DSP）为高效、高通量地表征可能参与浸润性胶质瘤侵袭与迁移的候选蛋白质的差异表达提供了一种有效方法。...

用于表征成人型弥漫性浸润性胶质瘤微环境的数字空间分析

在此，我们描述了一种从原代患者样本或患者来源的细胞培养物中生成胶质母细胞瘤（GBM）类器官并将其培养至成熟的方法。这些GBM类器官包含表型多样化的细胞群体，并可重建肿瘤微环境 离体.

维持人胶质母细胞瘤的细胞多样性 离体 使用三维类器官培养

学习非酶解外植体培养技术，用于IDH1突变弥漫性低级别胶质瘤的长期体外培养。该方法可维持肿瘤细胞特性并支持细胞可塑性研究，为神经肿瘤学研究提供可靠平台。

IDH1突变型弥漫性低级别胶质瘤的组织块培养方案

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