IDH1突变型弥漫性低级别胶质瘤的组织块培养方案

在我们的实验室中，我们专注于一种罕见的脑肿瘤，即弥漫性低级别胶质瘤。这类胶质瘤常影响年轻成年人，其特征是存在 IDH-1 基因的突变。胶质瘤研究领域的主要进展包括：第一，使用三维模型（如肿瘤类器官或类器官）；第二，对移植了胶质瘤的小鼠脑部进行直接成像；第三，应用特殊的转录组学和单细胞 RNA 测序技术。

我们在研究 IDH-1 突变型胶质瘤时面临的主要挑战是这些细胞增殖能力低，且难以在体外培养中长期维持。为此，我们建立并定义了一种能够保持细胞存活的实验方案。对于部分样本，我们成功建立了细胞系，但并非所有患者样本均能建系。通过在体外以及体内对 IDH-1 突变型细胞的研究，我们发现这些细胞具有较强的可塑性，能够呈现两种不同的细胞命运：星形胶质细胞样或少突胶质细胞样。此外，我们还发现 Nudge 蛋白在调控这种可塑性过程中发挥着重要作用。借助这一新的组织块培养方案，我们已能够在体外将 IDH-1 突变型细胞维持数周，甚至数月之久，并且证实了肿瘤细胞存在多种不同类型，这与我们在患者体内观察到的结果一致。

我们还发现，某些肿瘤微环境中的细胞（如小胶质细胞）使得研究肿瘤细胞与其周围环境之间的相互作用成为可能，因此这些模型能够更准确地反映肿瘤中所存在的生物学多样性。首先，准备好实验工作区并摆放所有已灭菌的器械。将肿瘤切除组织转移至冰上，以保持组织活性，便于后续培养。

观察肿瘤切除组织的大小和异质性。选择呈现灰白色、质地柔软或呈胶冻样的区域，因为这些区域富含肿瘤细胞。将选定的肿瘤样本转移至1.5毫升离心管或冻存管中，并加入1毫升培养基。

使用无菌剪刀将样品切成大小为一至二立方毫米的小块。接着，用无菌剪刀剪去1,000微升移液器吸头的尖端，形成一个直径约三至四毫米的宽口。用剪切过的吸头吸取100至200微升的组织碎块，移入培养板的孔中。

轻轻重新混匀悬液以确保分布均匀，因为较小的组织碎片容易快速沉降。将培养板置于37摄氏度、含5%二氧化碳和100%湿度的培养箱中。如果肿瘤的代谢活性导致培养基迅速变黄，或因组织碎片密度较高而需要时，应每天更换培养基。

首先，获取切碎的肿瘤组织悬液。在配制冻存液时，将两毫升 DMSO 加入八毫升细胞培养基中。取一份体积的切碎肿瘤悬液，与等体积的已配制好的 20% DMSO 冻存液混合。

轻轻吹打混合液，确保充分混匀。迅速将冻存管转入低温容器中，以实现温度的逐步降低，随后在零下80摄氏度孵育过夜，再转移至液氮中进行长期保存。解冻时，从液氮中取出冻存管，立即放入37摄氏度水浴中。

待约80%的细胞融化后停止复温。为去除DMSO，迅速将悬液转移至含有5毫升预热的1×PBS的15毫升离心管中，于300 ×g离心5分钟。弃去上清液，重复PBS洗涤一次，随后再次离心。

吸去上清液，确保沉淀物不受扰动。用适量培养基重悬沉淀物，并将其转移至预先包被多聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白的24孔板中。在37摄氏度下孵育培养板。

在培养至少四周后，可观察到从贴附于孔板表面的肿瘤外植体中生长出具有细长、双极或多极形态的细胞。在三个病例中，新鲜肿瘤与冷冻保存肿瘤来源的细胞表现出相似的形态特征，均呈现细长和双极形态，并形成复杂的网络结构。可清晰观察到肿瘤来源细胞沿纤维的放射状迁移。

失败的外植体培养表现出非黏附的组织碎片和大量含有自发荧光和脂质成分的含格特细胞。