通过光遗传变构调控对蛋白质活性进行时空调控
2024年10月4日
该协议描述了工程蓝光激活变构开关 （LightR） 结构域的应用，用于蛋白质活性的可逆时空控制。利用 Src 酪氨酸激酶作为模型，本研究为开发和表征光调节 Src （LightR-Src） 提供了一种详细的方案。它证明了这种方法跨酶类别的多功能性。
我们的总体研究重点是开发通过光实现蛋白质活性的精确时空控制的光遗传学方法。我们设计了称为 lightR 的光调节结构域，用于变构调节，使我们能够研究时空控制的蛋白质活性如何影响细胞信号传导和功能，从而有助于临床前疾病建模和治疗开发。光遗传学面临多项挑战，包括实现靶蛋白活性的精确和可逆控制以及准确模拟内源性信号动力学。
关键问题是防止不必要的激活、实现靶向亚细胞激活以及管理光毒性以保持细胞活力。此外，开发普遍兼容且耐用的工具对于提高应用的多功能性和可重复性至关重要。我们的 lightR 工具工程方案独特地将多种高级功能结合到一个系统中，包括变构调节、高灵敏度、空间分辨率、严格的时间控制和精确的信号特异性。
这种整合允许跨不同靶蛋白的可调性，解决了其他方法中可能缺乏这些关键功能中的一种或多种的差距。我们对定义调节细胞迁移的关键信号传导和结构过程感兴趣。我们的目标是利用我们的光遗传学技术来剖析内皮细胞迁移和相互作用的调节。
了解内皮细胞如何介导细胞外基质的重塑，并确定这些过程的失调如何导致疾病发展。对于每个实验组，将 3.5 厘米细胞培养皿中 6 个 lin XE 细胞的 1 次方 1 倍进行生化分析，将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 16 至 18 小时。第二天，使用合适的转染试剂用选定的 DNA 构建体转染细胞。
用铝箔盖住培养皿，然后将其放回培养箱中。转染 16 至 18 小时后，将 465 纳米 LED 面板灯系统置于组织培养箱内。将穿孔有机玻璃面板放置在灯上方 10 厘米处，以实现每平方厘米 3 毫瓦的照明。
在表达 LightR-Src 和 D388 R-LightR-Src 的细胞中使用连续照明。手动打开和关闭 LED 面板以控制照明。在实验时间点结束时，在安全的红光下收获细胞，吸出培养基并用冷 PBS 洗涤细胞。
使用工程化 LightR-Src 对 lin XE 细胞进行全局照射 60 分钟，显示 Src 底物、内源性桩蛋白的磷酸化，表达催化失活 D388 RLightR-Src 突变体的 p130Cas 细胞在全局照射下显示 Src 底物没有磷酸化。首先，在细胞培养基中，以每 35 毫米组织培养皿 5 个 hela 细胞的幂 2 乘以 10 进行铺板。将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 2 小时。
一旦细胞贴壁并达到 60% 至 70% 的汇合度，用给定的混合物共转染 hella 细胞。用铝箔盖住培养皿，以防止细胞意外照射。然后将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 16 至 18 小时。
接下来，将直径为 25 毫米、厚度为 0.17 毫米的有盖玻璃放入六孔板室中。在 PBS 中涂上每升 5 毫克纤连蛋白，并在 37 摄氏度下孵育过夜。然后在转染后 16 至 18 小时用 PBS 冲洗盖玻片。
在安全的红光下收集转染的 hela 细胞，然后在安全的红光下将 5 个转染的 hela 细胞的幂播放大约 1 乘以 10 次，放到每个盖玻片上。用铝箔盖住板，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的细胞培养基中孵育 2 小时。接下来，将准备好的成像介质和矿物油加热至 37 摄氏度。
然后用 PBS 洗涤含有细胞的盖玻片两次。染色和洗涤细胞后，小心地将盖玻片放入活细胞成像室中。向腔室中加入 1 毫升 L15 成像介质。
向介质中加入 1 毫升预热的矿物油，以防止成像过程中蒸发。保持腔室在 37 摄氏度下避光，直到准备好成像。将腔室放在预热至 37 摄氏度的显微镜载物台上。
选择同时表达快速 LightR-Src cherry 和 Src IRFP 的单个单元格。选择细胞内感兴趣的特定区域进行照明。对于这项研究，在所选单元格的外围选择一个小区域。
在照明前，在基础状态下每分钟对所选细胞进行成像 20 分钟。继续成像 50 分钟，同时局部照射，然后在激活后 20 分钟，总共 90 分钟。成像后，将电影保存为 tif 堆栈文件格式以供分析。
Hela 细胞的全局照明导致快速 LightR-Src 定位于黏着斑，一旦蓝光关闭，这种粘附就会逆转。这种照明还导致细胞扩散显着增加，一旦蓝光关闭，细胞扩散就会停止。催化失活的 D388 R-LightR-Src 突变体未显示细胞扩散。
表达快速 LightR-Src 的 hela 细胞的局部照明导致构建体在黏着斑中积累，导致 50 分钟照明下局部膜突起。在照明后 20 分钟的黑暗中未观察到进一步的面积增加。Fast LightR-Src 在暗相逐渐从黏着斑中消失。
单元质心向发光区域移动。快速 LightR-Src 激活后，表明细胞定向运动。
概述
本研究集中于开发一个工程化的蓝光激活的变构开关（LightR），用于精确的蛋白质活性的时空控制，以Src酪氨酸激酶作为模型。该协议使研究人员能够实现对蛋白质功能的可逆、光调控，这有助于深入了解细胞信号传导动态。
关键研究组成部分
研究领域
- 光遗传学
- 蛋白质工程
- 细胞信号传导和迁移
背景
- 光遗传学的挑战包括实现对蛋白质活性的精确控制和模拟内源性信号。
- 解决光毒性和不必要的激活对于保持细胞活力至关重要。
- 该研究引入了一种新的LightR工具，该工具集成了高灵敏度、空间分辨率和特定信号传导能力。
所用方法
- Src激酶的LightR域的工程化和表征
- 使用HeLa和lin XE细胞进行实验
- 生化分析和活细胞成像技术
主要结果
- LightR-Src能够在蓝光照射下对Src底物进行受控的磷酸化。
- 局部照明诱导HeLa细胞的扩展和定向移动。
- LightR-Src的激活和失活展示了细胞功能的可逆性和特异性。
结论
- 本研究展示了一种用于光遗传控制蛋白质活性的创新方法，为细胞行为提供了宝贵的见解。
- 研究结果对疾病研究和治疗开发中的临床前模型具有重要意义。
常见问题
Executive Industry Relevance
Precise spatiotemporal control of protein activity is a critical challenge in early discovery and mechanistic de-risking for biopharma R&D. The LightR optogenetic system enables reversible, light-regulated allosteric modulation of target proteins, supporting high-confidence interrogation of signaling pathways and cellular behaviors. This capability enhances predictive confidence and translational continuity from discovery through preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct testing of therapeutic hypotheses by temporally controlling protein function in live cells.
- Supports mechanistic de-risking by isolating the effects of specific protein activation or inactivation.
- Facilitates functional target validation through reversible ON/OFF modulation and minimal background activity.
- Improves predictive confidence in pathway analysis and target prioritization.
Screening & Assay Development
- Provides validated, light-responsive biological systems for quantitative readouts in cell-based assays.
- Enables reproducible and scalable screening of compounds affecting light-regulated protein activity.
- Supports assay standardization by minimizing leakiness and ensuring tight temporal control.
- Allows for platform reuse across diverse enzyme classes and target proteins.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by enabling subcellular and tissue-level control of signaling events.
- Facilitates continuity from discovery to preclinical validation by modeling dynamic cellular responses.
- Supports risk-adjusted advancement decisions through robust, reversible modulation of disease pathways.
- Enables mechanistic studies of cell migration and extracellular matrix remodeling relevant to disease progression.
Pipeline & Workflow Integration
The LightR optogenetic system integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven modulation of protein activity and quantitative analysis of downstream effects.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing and pathway clarification by isolating protein function with light.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in light-regulated assays.
- Analytics: Provides phosphorylation and cell migration readouts for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical models by enabling disease-relevant, reversible protein control.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, adaptable platform for diverse target classes and mechanistic studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of optogenetic assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust functional studies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, optogenetics, and live-cell imaging.
- Needs access to blue-light illumination systems and quantitative imaging platforms.
- Demands cross-team standardization for reproducible light delivery and data analysis.
- Adaptable to various cell types and enzyme classes with appropriate construct design.
- Phototoxicity and off-target effects must be managed to preserve cell viability and data integrity.
