Name: 通过光遗传变构调控对蛋白质活性进行时空调控 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 了解光遗传变构调控技术，利用蓝光激活的LightR系统对Src激酶进行时空调控，实现蛋白质活性的可逆调节。该方法结合活细胞成像技术，为研究细胞信号传导和迁移机制提供新工具，助力疾病模型构建与治疗开发。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢 Mark Shaaya 博士在 LightR 酶及其相关实验方案开发中的贡献。pCAG-iCre 由 Wilson Wong 惠赠（Addgene 质粒 #89573），pcDNA3.1 Floxed-STOP mCherry 由 Mositoshi Sato 惠赠（Addgene 质粒 #122963），携带 V600E 突变的 bRaf-Venus 质粒由 John O'Bryan 博士（MUSC）惠赠；ERK2 基因来自 pCEFL-ERK2（由北卡罗来纳大学 Channing Der 实验室惠赠），将其克隆至 mCherry-C1 载体骨架中，获得 mCherry-ERK2 质粒。; pmiRFP670-N1由Vladislav Verkhusha惠赠（Addgene质粒# 79987）。本研究获得美国国立卫生研究院（NIH）基金R33CA258012、R35GM145318和P01HL151327（资助对象：AK）的支持。NL获得了T32 VBST培训基金T32HL144459的进一步资助。

Optogenetic Control of Enzyme Activity Using Light-Regulated Allosteric Switch

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究提出了一种用于研究多种信号通路的光遗传学方法，并展示了其在解决不同生物学问题中的广泛应用性。LightR 工具系统具备多项关键优势：（1）对蛋白质活性的变构调控；（2）对活性进行严密的时间控制，且可调节以实现不同的激活与失活动力学；（3）在亚细胞水平上实现活性的空间分辨；（4）信号调控和生物学效应的高度特异性；（5）适用于多种靶蛋白的广泛适用性。值得注意的是，LightR 独特地将所有这些优势整合于单一工具之中，从而实现了重要的技术进步。
将LightR设计为别构开关具有多项优势。LightR能够插入蛋白质中较小的柔性环内并调控其活性，这一特性使其在结构和功能多样的各类蛋白质中均具有广泛的应用灵活性。作为一种别构开关，LightR仅调控目标蛋白的特定结构域，而不影响蛋白的其他结构域。因此，该方法可在不损害蛋白质重要功能（例如与结合伴侣的相互作用或在细胞内的天然定位）的前提下，实现对蛋白活性的特异性调控。双组分光遗传学系统已成功用于调控蛋白质定位、相互作用或其他关键功能，其机制依赖于光控同源或异源二聚化29,30,31,32,33,34,35。然而，这些系统通常需要两种蛋白以优化的等摩尔比例表达，从而增加了实际应用的难度。而利用LightR系统实现的别构调控仅需单一蛋白即可完成，因此为细胞信号通路的研究提供了更为灵活和便捷的策略。
LightR开关在不同蛋白质类别中的广泛应用性，部分归功于对LightR结构域内不同模块的优化。连接LightR与目标蛋白的接头，以及LightR内部两个VVD结构域之间的接头（VVD间接头），均可能影响调控效率。选用的VVD间柔性接头(GGS)4G(GGS)3具有足够的灵活性和长度，可确保LightR结构域内VVD单体的有效结合与解离。该接头迄今已成功实现了对所有目标蛋白的调控。然而，当LightR结构域在黑暗条件下无法充分抑制目标蛋白活性时，可引入更刚性的接头，使VVD结构域彼此间距更大，从而增强LightR夹子的打开程度，以维持酶的失活状态。但该接头仍需保留足够的灵活性，以支持VVD的二聚化及目标蛋白的激活。为连接LightR与目标蛋白，我们在LightR结构域的N端和C端分别使用短柔性接头GPGGSGG和GSGGPG。这些接头提供了足够的连接灵活性，从而防止目标蛋白发生不可逆的结构破坏；同时其长度较短，可在黑暗条件下诱导目标蛋白构象扭曲，而在光照条件下促进蛋白功能的恢复。这些接头已支持LightR在多种蛋白应用中的有效调控。然而，在某些情况下，若这些接头在黑暗中无法实现充分的蛋白失活，则缩短接头长度可能更有利。接头缩短可降低灵活性，增强黑暗状态下开放型LightR夹子所引起的构象扭曲，从而减少任何渗漏活性。但这种调整可能因光照状态下潜在的结构畸变而影响酶的最大活性。此外，在构象稳定性并非主要问题的情况下，也可通过替换插入环中的多个氨基酸，达到类似的灵活性平衡效果。
许多关键的信号传导过程以瞬时方式被激活，或以振荡方式进行调控36,37,38,39,40,41,42,43。LightR 工具的可调性使我们能够模拟复杂的信号模式，从而为研究时间上受控的生物学过程提供了一种强大的方法。我们通过在两个 VVD 结构域中引入 I85V 突变来调节 LightR 的关闭动力学，实现这一目标。该突变将 VVD 二聚体在暗态下的半衰期从 18,000 秒缩短至 780 秒19，从而促进 FastLightR-酶的快速失活。
快速失活动力学特性还能够实现对蛋白质活性的亚细胞分辨率调控。由于LightR酶具有较慢的关闭动力学特性，激活后的构建物在细胞内扩散可能导致难以观察到亚细胞激活的效果。而具备快速关闭动力学特性的FastLightR-酶，一旦扩散出局部照明区域，将迅速失活。通过选择性地激活特定的亚细胞区域，研究人员可以深入了解蛋白质的局部功能，从而更好地理解其在复杂细胞通路和信号网络中的作用。
尽管FastLightRs在细胞内对蛋白质活性进行时空受限的光学控制方面具有重要价值，但在某些应用中，缓慢的关闭动力学可能更受青睐。具有缓慢关闭动力学的LightR可用于需要持续且增强的蓝光诱导活性的研究中。这类应用仅需不频繁的光照脉冲即可维持连续的光遗传学活性，从而也能最大限度地减少光毒性等问题。针对不同实验场景，可单独或组合实施多种动力学改造10,18，为调节LightR性能以优化其在特定实验中的应用提供了一种有前景的解决方案。
LightR-酶的适用性取决于其模拟内源性对应蛋白生物学功能的能力。因此，评估其底物特异性、下游信号传导以及亚细胞定位至关重要。LightR-Src活性的特异性可通过其对Src底物（包括paxillin和p130Cas22,23）的磷酸化作用加以验证。在循环光照条件下，FastLightR-Src在核周区域与黏着斑之间穿梭，导致细胞铺展。这一现象成功重现了先前使用天然Src激酶所观察到的结果，进一步证实了该工具在研究Src生物学功能方面的有效性11,12,44,45,46,47。LightR-bRaf也表现出对MEK和ERK激酶等信号复合物靶向作用的特异性24,25。此外，FastLightR-bRaf在蓝光刺激下可引发ERK核转运蛋白的周期性振荡，这是bRaf激活的已知后果之一28。LightR-酶能够高度模拟内源性蛋白功能，为深入探究其生物学功能提供了极为宝贵的工具。
上述讨论描述了LightR激酶在特定细胞区室中复制精确细胞信号通路的能力。与激酶的成功应用相一致，LightR-Cre提供了一个典型范例，展示了源自P1噬菌体的原始Cre重组酶的功能特性。Cre重组酶属于位点特异性重组酶中的整合酶家族，其作用机制是介导靶DNA上两个称为loxP的识别位点之间的重组反应。此类重组通过交换事件导致DNA重排。根据loxP位点在靶DNA上的方向性排列，该交换事件可引起染色体元件的缺失、重复或易位48。Cre重组酶已被广泛用于构建可诱导基因调控的体内模型49,50。然而，其他自发性、化学诱导性或光遗传学诱导性Cre重组酶系统在动物模型中对DNA重组发生的时间和空间控制能力有限。LightR-Cre通过实现对DNA重组时间与空间的高度精确控制，克服了这些局限性。此外，LightR的可调节性使我们能够消除不必要的渗漏活性，确保Cre活性的高精度调控。这些能力为疾病病理建模以及新疗法的开发开辟了新的机遇。
对激酶和DNA重组酶中LightR的精确调控进一步证明，该工具可采用相同策略应用于多种蛋白质。除了激活各类酶之外，LightR还有望连接到其他类型的蛋白质上，通过变构调节实现蛋白质在特定亚细胞区域的定位、诱导蛋白质-蛋白质相互作用、构建蓝光诱导型生物传感器等。由于特异性结构域靶向具有变构调控的优势，LightR还可与同一蛋白质中的其他化学遗传学和光遗传学方法联用，从而实现更高程度的可调控性，以研究复杂的生物学过程。
我们已成功将LightR应用于多种其他蛋白质（相关论文正在撰写中）。尽管取得了这些成功，功能性LightR蛋白的开发仍可能面临一些潜在挑战，尤其是在选择合适的插入位点以及准确模拟目标蛋白生物学功能方面。当缺乏晶体结构时，研究人员必须依赖预测的结构或氨基酸序列信息，这需要进行更多的排查工作，以构建具有多个插入位点或氨基酸替换的工程化蛋白。此外，工程化蛋白的活性必须经过精细调控，以准确再现其在细胞内的生物学功能。这些实验的成功取决于工程化蛋白对其内源同源蛋白功能的精确模拟，而这通常需要严格的优化过程，并可能因细胞类型、目标蛋白类别与种类，以及蓝光激活的强度和持续时间不同而有所差异。
综上所述，LightR 系统是一种实现对蛋白质功能进行精确时空调控的强大工具。其稳定性、可调节性和多功能性使其在研究复杂细胞过程、解析信号通路以及阐明基因调控机制方面具有重要价值。通过为研究人员提供前所未有的蛋白质活性控制能力，LightR 系统有望推动我们对基本生物学过程的理解，并为创新性治疗干预开辟新途径。

细胞在生理或病理条件下解读外部信号并将其转化为特定反应的能力，由特定的蛋白质群组所调控。任何蛋白质在这些复杂反应中的作用，通常由其亚细胞定位、表达水平以及瞬时、持续或振荡性激活的时间动态所决定。要解析这些独立参数在信号转导调控中的作用，需要能够模拟亚细胞水平上蛋白质活性复杂时空控制的方法。传统的技术手段，如基因操作和小分子抑制剂，在这方面存在局限性。相比之下，光遗传学技术有望通过操控或模拟生理与病理过程，实现对生物过程的精细解析。然而，现有的工具往往缺乏广泛的适用性或亚细胞水平的精确控制。一些已有策略能够实现对蛋白质定位和相互作用的严密调控，但无法直接控制酶活性1,2,3,4；另一些方法虽可调控酶活性，但可能缺乏亚细胞特异性，或在不同酶类之间适用性有限5,6,7,8,9。在本实验方案中，我们介绍一种新型的蛋白质工程技术，将光遗传学的优势集于一身：实现严密的时间调控、可调的动力学特性、亚细胞水平的控制以及广泛的酶类适用性10。我们设计了一种光调控（LightR）结构域，当其插入目标蛋白内部时，可作为别构开关发挥作用。该策略能够在活细胞中实现对目标蛋白激活与失活的严密时空控制。
本文讨论了光遗传学工具LightR在多种酶类中的设计与应用策略。本研究提供了光调控酪氨酸激酶Src（LightR-Src）的构建、表征及应用的逐步实验方案。研究进一步展示了LightR开关失活动力学的可调节性。具有慢失活特性的LightR开关可在减少光照频率的情况下维持酶活性，而快速循环版本FastLightR则需要更频繁的光照以维持激活状态，但在光照关闭后可迅速失活。在活细胞中对FastLightR-Src进行激活/失活可诱导细胞铺展与回缩的周期性变化。FastLightR-Src诱导的细胞铺展符合Src激酶的生理功能11,12。由于其快速失活的动力学特性，FastLightR-Src还可实现亚细胞水平的调控，从而诱导局部突起形成和细胞极化。为展示LightR工具在其他类型酶中的适用性，本文简要介绍了在工程化光调控激酶bRaf（LightR-bRaf、FastLightR-bRaf）以及位点特异性DNA重组酶Cre（LightR-Cre）中取得的类似成功。总体而言，该方法有望推动我们对调控多种疾病病理生理过程的复杂信号通路的理解。

<table><tbody><tr><td>#1.5 玻璃盖玻片 25 mm 圆形</td><td>Warner Instruments&amp;nbsp;</td><td>64-0715&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管&amp;nbsp;</td><td>USA Scientific&amp;nbsp;</td><td>cc7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli缓冲液</td><td></td><td></td><td>500 mL：5.18 g&amp;nbsp; Tris-HCl，131.5 mL 甘油，52.5 mL 20% SDS，0.5 g 溴酚蓝，终末 pH 6.8</td></tr><tr><td>4-20% Mini-PROTEAN TGX 预制胶</td><td>伯乐（Biorad）</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>5x Phusion Plus 缓冲液&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>F538L</td><td></td></tr><tr><td>60 LED 显微镜环形灯</td><td>Boli Optics</td><td>ML46241324</td><td>蓝色LED，60 mm直径，5 W</td></tr><tr><td>琼脂糖&amp;nbsp;</td><td>GoldBiotech</td><td>A-201</td><td></td></tr><tr><td>抗 Erk 1/2 抗体</td><td>细胞信号传导</td><td>9102</td><td></td></tr><tr><td>抗GAPDH抗体</td><td>invitrogen</td><td>AM4300</td><td></td></tr><tr><td>抗GFP</td><td>Clontech</td><td>632380</td><td></td></tr><tr><td>抗mCherry抗体</td><td>invitrogen</td><td>M11217</td><td></td></tr><tr><td>抗MEK</td><td>细胞信号传导</td><td>9122</td><td></td></tr><tr><td>抗p130Cas</td><td>BD 生物科学</td><td>610271</td><td></td></tr><tr><td>抗paxillin</td><td>细胞信号传导</td><td>2542</td><td></td></tr><tr><td>抗磷酸化 Erk 1/2 T202/Y204 抗体</td><td>细胞信号传导</td><td>9101</td><td></td></tr><tr><td>抗磷酸化-pY249 p130Cas</td><td>细胞信号传导</td><td>4014</td><td></td></tr><tr><td>抗磷酸化-Y118 脱节蛋白</td><td>细胞信号转导</td><td>2541</td><td></td></tr><tr><td>抗磷酸化S217/221 MEK</td><td>细胞信号传导</td><td>9121</td><td></td></tr><tr><td>Arduino 兼容电源</td><td>企业计算机</td><td>LJH -186</td><td></td></tr><tr><td>Arduino Uno Rev3</td><td>Arduino</td><td>&amp;lrm;A000066</td><td></td></tr><tr><td>Attofluor 细胞培养皿</td><td>invitrogen</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>标准胎牛血清（FBS）&amp;nbsp;</td><td>健美生物制品</td><td>100-106</td><td>热灭活三重 0.1 &amp;micro;m 经无菌过滤&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>bRaf-V600E-Venus</td><td></td><td></td><td>约翰·奥布莱恩博士（Dr. John O'Bryan）惠赠，南卡罗来纳医科大学（MUSC）</td></tr><tr><td>BSA&amp;nbsp;</td><td>GoldBiotech</td><td>A-420&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>羧苄青霉素（二钠）</td><td>Gold Biotechnology</td><td>C-103-25</td><td></td></tr><tr><td>CellMask 深红色细胞膜染料</td><td>invitrogen</td><td>c10046</td><td></td></tr><tr><td>菌落筛选主混合液&amp;nbsp;</td><td>杰内西</td><td>42-138</td><td></td></tr><tr><td>DH5α 感受态细胞&amp;nbsp;</td><td>NEB&amp;nbsp;</td><td>C2987H</td><td></td></tr><tr><td>DMEM&amp;nbsp;</td><td>康宁&amp;nbsp;</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>DNA Ladder&amp;nbsp;</td><td>GoldBio&amp;nbsp;</td><td>D010-500</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>N04475</td><td></td></tr><tr><td>DpnI 酶&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>R01765</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>GoldBio</td><td>DTT10</td><td>DL-二硫苏糖醇，克莱兰德试剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>阿克罗斯&amp;nbsp;</td><td>409910250</td><td></td></tr><tr><td>FastLightR-bRaf-mVenus</td><td>Addgene</td><td>#162155</td><td></td></tr><tr><td>牛血浆来源的纤连蛋白&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE(R) 6 转染试剂&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>Gel Green 核酸染料&amp;nbsp;</td><td>GoldBio</td><td>G-740-500</td><td></td></tr><tr><td>6× 紫色上样缓冲液&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>B7024A</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET 胶回收试剂盒&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>K0692</td><td>凝胶回收试剂盒&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>GeneJET 质粒小提试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>K0502</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>GlutaMAX-l（100倍浓度）100 mL&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HEK 293T细胞&amp;nbsp;</td><td>ATCC&amp;nbsp;</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>HeLa 细胞&amp;nbsp;</td><td>ATCC&amp;nbsp;</td><td>CRM-CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fischer&amp;nbsp;</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Iot 继电器</td><td>数字记录仪</td><td>DLI 705020645490</td><td>用于照明的交直流控制继电器</td></tr><tr><td>卡那霉素单硫酸盐</td><td>Gold Biotechnology</td><td>K-120-25</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>L-15 1x</td><td>康宁&amp;nbsp;</td><td>10-045-CV&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>LB 琼脂&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP1425-2</td><td></td></tr><tr><td>LED植物生长灯系统</td><td>HQRP</td><td>884667106091218</td><td>LED面板灯系统&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LightR-bRaf-mVenus</td><td>Addgene</td><td>#162154</td><td></td></tr><tr><td>LightR-iCre-miRFP670</td><td>Addgene</td><td>#162158</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2024a</td><td>运行 CellGEO 脚本的软件</td></tr><tr><td>美塔莫夫</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>成像分析软件</td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Fisher Chemical</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>M5310</td><td></td></tr><tr><td>MiniPrep 试剂盒&amp;nbsp;</td><td>基因选择&amp;nbsp;</td><td>96-308</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX 预制胶，12 孔</td><td>Bio-Rad</td><td>4561085</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学级水&amp;nbsp;</td><td>康宁&amp;nbsp;</td><td>46-000-CV&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>多波段多色镜</td><td>89903BS</td><td>Chroma</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&amp;nbsp;</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-3&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>不含钙和镁的 PBS&amp;nbsp;</td><td>康宁&amp;nbsp;</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-iCre</td><td>Addgene</td><td>#89573</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherry</td><td>Addgene</td><td>#122963</td><td></td></tr><tr><td>pCEFL-ERK2</td><td></td><td></td><td>来自北卡罗来纳大学Channing Der博士实验室的馈赠</td></tr><tr><td>PCR管&amp;nbsp;</td><td>labForce</td><td>1149Z65</td><td>0.2 mL 8联管及盖子，刚性条带，单独连接的圆顶盖&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Phusion Plus DNA聚合酶</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>F630S</td><td></td></tr><tr><td>pmiRFP670-N1</td><td>Addgene</td><td>#79987</td><td></td></tr><tr><td>Polygon 400 图案化照明器</td><td>Mightex</td><td>DSI-G-00C</td><td></td></tr><tr><td>引物&amp;nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PVDF 膜</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>1620219</td><td>免疫印迹 PVDF 膜/滤纸夹心结构&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶，2.21 mM EDTA，1x，无钠</td><td>康宁&amp;nbsp;</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tris-乙酸盐-EDTA (TAE) 50倍浓缩液&amp;nbsp;</td><td>Fischer&amp;nbsp;</td><td>BP1332-1&amp;nbsp;</td><td>用于电泳&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>UPlanSApo 40倍物镜</td><td>Olympus</td><td>1-U2B828</td><td></td></tr><tr><td>USB TTL 盒</td><td>国家仪器公司</td><td>6501</td><td>用于TTL接口</td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Fisher Chemical&amp;nbsp;</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr></tbody></table>

通过光遗传变构调控实现蛋白质活性的时空控制

Spatiotemporal Control of Protein Activity through Optogenetic Allosteric Regulation

光遗传学技术有望实现对酶活性的复杂时空控制，其精度可达亚细胞水平。然而，大多数光遗传学方法在将多种功能整合到一种适用于多种靶蛋白的单一工具中时，常面临重大挑战。如何实现对“开启/关闭”动力学的精确控制、确保在黑暗条件下最小的渗漏活性，并在哺乳动物细胞中以亚细胞精度高效发挥作用，是该领域常见的难题。一个有前景的解决方案是利用理性设计的光敏结构域，通过别构效应来调控蛋白质活性。基于这一策略，我们开发出一种具备所有理想特性的光遗传学方法。该方法通过将光调控别构开关模块（LightR）插入靶蛋白中，利用蓝光（465 nm）调控酶活性。LightR结构域由两个Vivid（VVD）光感受结构域连接而成，形成一种光敏感夹子，可插入酶催化结构域内的一个小而灵活的环区。在黑暗状态下，LightR夹子处于开放状态，导致酶催化结构域构象畸变而失活；当暴露于蓝光时，LightR结构域闭合，恢复催化结构域的正常构象，从而恢复酶活性。本文中，我们讨论了构建光调控蛋白激酶的设计策略&#160;，并展示了其在蓝光控制下的可逆性、动力学特性以及在亚细胞水平上的精确调控能力，实现了高度精确的时空控制。以Src酪氨酸激酶为模型，我们展示了一种有效调控LightR-Src激酶活性的实验方案。此外，我们还证明了LightR系统适用于不同类型的酶，拓展了该工具在研究多种疾病相关信号通路机制问题中的应用价值。

LightR-Src 的设计与构建遵循 图 1A、B 中所述策略。生化分析表明，在持续蓝光照射 60 分钟后，LightR-Src 可激活已知的内源性 Src 底物 p130Cas (Y249)22 和 paxillin (Y118)23 的磷酸化（图 2B）。值得注意的是，当 LightR-Src 仅在转染后 16–18 小时的黑暗条件下表达时，未观察到 Src 激酶的背景激活。此外，催化失活突变体 LightR-Src（D388R 突变）不能诱导 Src 底物的磷酸化，表明磷酸化由有活性的 LightR-Src 所介导，而非蓝光照射的非特异性效应所致（图 2B）。鉴于已有文献报道 Src27 激酶在活细胞中存在振荡性活性，我们进一步探究了 LightR-Src 是否可被调控以实现周期性激活。原始的 LightR-Src 表现出较慢的去激活动力学（图 2C），因此我们构建了一个新的变体 Fast-LightR-Src，其两个 VVD 结构域均携带 I85V 突变。如 图 2D 所示，Fast-LightR-Src 的去激活动力学显著加快，在关闭光照后 10 分钟内完全失活，而原始 LightR-Src 的去激活则需超过一小时。利用 Fast-LightR-Src，我们还实现了多次重复的激活/失活循环（图 2E）。综上结果表明，LightR 工具能够在活细胞中实现对 Src 活性的特异性且精确调控。
FastLightR-Src 的应用还可用于评估短暂性 Src 激活对细胞形态动力学的影响。在 HeLa 细胞中激活 FastLightR-Src 可诱导细胞铺展，而一旦 FastLightR-Src 被失活，该过程即停止。激活后，我们观察到 FastLightR-Src 从核周区转位至黏着斑和细胞膜，这一行为与野生型 Src 激酶的表现一致11,12. 表达无催化活性突变体 D388RLightR-Src 的细胞在光照下未表现出此类铺展效应（图3B,C）。这进一步证实了FastLightR-Src的功能与其野生型类似。对细胞某一区域进行局部光照，可导致FastLightR-Src在该区域被局部激活，表现为LightR Src在黏着斑中的局部聚集，并伴随局部细胞膜突起的形成。图4B （i），（ii）以及细胞中心点位移（图4C (i)、(ii)，导致细胞向光移动。在确立了LightR工具对Src激酶的调控应用后，我们进一步展示了LightR在调控bRaf激酶和DNA重组酶Cre方面的广泛适用性。对LightR-bRaf的分析显示，其可诱导内源性底物MEK1的光依赖性磷酸化，并进一步引起下游ERK1/2激酶的磷酸化24,25 与组成型激活的bRaf突变体（V600E）水平相当（图5A）。相反，催化失活的 D575RLightR-bRaf 未引起 MEK1 和 ERK1/2 的磷酸化，其结果与未受光照的 LightR-bRaf 样本相当，从而证实了 LightR-bRaf 调控的特异性。活细胞成像显示，反复进行 FastLightR-bRaf 的激活与失活循环可诱导 ERK2 多次在细胞核内外的转运，这与已知的 bRaf 激活效应一致。28 (图 5B). LightR-Cre 的激活成功实现了报告基因 mCherry 的重组，表明 LightR 可适用于不同类别的酶图 5C).
<img alt="光激活DNA定点突变中蛋白质相互作用示意图与大引物合成方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：LightR方法的开发策略。（A）Vivid蛋白在暗态下的两个单体晶体结构（PDB: 2PD7）以及光照状态下二聚体的晶体结构（PDB: 3RH8）。（B）LightR设计的示意图。两个串联连接的VVD光感受器插入到催化结构域中，在黑暗条件下破坏蛋白的催化活性；蓝光诱导VVD发生二聚化，从而恢复蛋白活性。（C）（i）Src（PDB 1Y57）和（ii）bRaf（PDB 4MNF）催化结构域的晶体结构；（ii）Cre重组酶（PDB 1MA7）的结构。黄色箭头指示LightR插入位点及被替换的氨基酸残基。（D）将LightR结构域插入目标酶序列的克隆策略示意图19。第一步，使用特异性设计的引物通过PCR扩增获得两端含有与目标基因插入位点上下游互补序列的LightR片段；第二步，将上述方法获得的LightR片段作为“大引物”，用于通过快速定点突变法将LightR插入目标酶基因中。图A–C经Shaaya等10许可改编并修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="光遗传学Src激活与分析；示意图、Western blot结果；蛋白质磷酸化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：工程化LightR-蛋白质的生化表征。（A）LightR Src生化表征实验方案的示意图。（B）瞬时表达C末端带有mCherry和myc标签的LightR Src构建体的LinXE细胞，使用465 nm LED装置持续蓝光照射60分钟。细胞裂解物用于检测Src底物paxillin和p130Cas的磷酸化水平。Western blot结果显示，在活细胞中激活LightR-Src后，内源性paxillin和p130Cas发生磷酸化。（C、D）瞬时表达C末端带有串联mCherry-myc标签的指定LightR-Src构建体的LinXE细胞，分别持续暴露于蓝光下指定时间（0分钟和30分钟），随后置于黑暗中指定时间段。收集细胞裂解物并检测Src底物的磷酸化水平，以比较（C）LightR-Src与（D）FastLightR-Src的激活与失活动力学。（E）瞬时表达C末端带有串联mCherry-myc标签的指定LightR-Src构建体的LinXE细胞，先持续蓝光照射20分钟，随后反复进行黑暗孵育10分钟和光照20分钟的循环。收集细胞裂解物并检测Src底物的磷酸化水平，以评估Src激酶在激活与失活状态之间循环的效率。所有实验均至少重复三次，结果相似。Western blot图B-E中每个条带旁标注的数字代表蛋白质的分子量，单位为千道尔顿（kDa）。图B-E经Shaaya等10许可并修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="蓝光下的细胞行为；显微镜图像与统计图；光激活分析装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig03v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：全局与时间控制的光照及其对 FastLightR-Src 活性的影响。 （A）全局与时间循环光照实验方案及后续数据分析的示意图。（B、C）通过宽场荧光显微镜获取的 HeLa 细胞延时成像代表性图像，展示了蓝光对细胞形态和 FastLightR-Src 定位的调控作用。这些细胞瞬时共表达 FastLightR-Src-mCherry-myc（N = 10 个细胞）或催化失活型 D388RLightR-Src-mCherry-myc（N = 9 个细胞），以及 Stargazin-iRFP670（质膜标记物）。在全局蓝光照射期间（蓝色轮廓），每分钟进行一次活细胞成像。（B）黄色箭头突出显示 FastLightR-Src 在类似黏着斑结构上的定位。图像来自使用宽场荧光显微镜拍摄的 HeLa 细胞延时序列。（C）各图中显示了 FastLightR-Src 与 D388RLightR-Src 激活所诱导的细胞面积变化的量化结果。光照时间段以蓝色矩形表示。图表表示均值 ± 90% 置信区间。图 B 和图 C 经 Shaaya 等人10许可改编并修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用蓝光进行细胞迁移的亚细胞照明方法；含分析结果的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：局部亚细胞照明控制及其对 FastLightR-Src 活性的影响。（A）局部亚细胞照明控制实验方案的示意图。（B）（i）时间序列图像，展示表达 FastLightR-Src-mCherry 的 HeLa 细胞在蓝光局部照射下的情况（以蓝色圆圈表示）。使用全内反射荧光显微镜（60 倍物镜）每分钟采集一次图像。图像以指定时间间隔获取的反差图像形式呈现。（ii）细胞投影图像，显示在指定时间间隔内形成的细胞突起。通过对实验时间轴上的细胞形态进行阈值化和掩膜处理，构建用于分析细胞铺展和细胞边缘动态的平台。细胞中指定的照射区域由蓝色圆圈标出。（C）（i）细胞极坐标图，表示细胞质心迁移距离（d）及相对于局部蓝光照射方向的偏转角度（θ）。黑点代表表达催化失活型 D388RLightR-Src 的单个 HeLa 细胞（N = 6 个细胞）或表达 FastLightR-Src 的细胞（N = 10 个细胞）。（ii）示意图，展示细胞质心从局部蓝光刺激开始（1）到结束（2）所移动的质心位移距离（d）。偏转角度（θ）表示细胞质心移动方向偏离蓝光照射位置的程度。浅灰色阴影区域表示细胞在局部 FastLightR-Src 刺激下突出的范围。细胞中指定的照射区域由实线蓝色圆圈标出。图 B 和图 C 已根据 Shaaya 等人10 的研究进行改编和修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="蓝光诱导的mCherry-ERK2激活；Western blot、显微镜观察及随时间变化的细胞反应。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5：LightR方法的广泛适用性。（A）LightR-bRaf的调控。瞬时表达LightR-bRaf-Venus、催化失活型D575R LightR-bRaf-Venus或组成型活性bRaf（V600E）-Venus的LinXE细胞接受指定时长的持续蓝光照射。使用细胞裂解物检测所示蛋白的磷酸化水平。（B）通过宽场荧光显微镜进行活细胞延时成像所获得的代表性图像，展示了瞬时共表达FastLightR-bRaf-Venus和mCherry-ERK2的LinXE细胞中全局蓝光反应的调控情况。这些细胞接受全局蓝光照射（每秒一次50毫秒脉冲，每分钟50次脉冲），照射时长如蓝色标注所示。每分钟对mCherry-ERK2进行一次活细胞成像。黄色箭头标示了工程化bRaf经蓝光激活后诱导的ERK2核内定位阶段。（C）LinXE细胞被瞬时共转染Flox-stop-mCherry报告基因和LightR-Cre-iRFP670。细胞分别处于黑暗条件或接受脉冲式蓝光照射（开2秒，关10秒），最长持续8小时。使用宽场荧光显微镜（10倍物镜）在相同设置下采集各时间点每个通道的图像，并调整至一致的亮度和对比度水平，以便比较不同样本间的蛋白表达水平。该实验至少重复三次，结果一致。本图改编自Shaaya等人的研究10。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
补充表 1：LightR 序列。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表2：LightR插入位点的描述及LightR-蛋白设计的检查清单。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%202.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表 3：用于 LightR 克隆的引物。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%203.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表4：LightR-蛋白活性生化分析的转染条件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%204.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表 5：基于成像分析 LightR-蛋白活性的转染条件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%205.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件1：使用集成开发环境（IDE）进行脉冲光照。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 2：显微镜照明设置。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20File%202_Updated.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案描述了一种工程化的蓝光激活变构开关（LightR）结构域，可用于可逆地进行时空控制蛋白质活性。以Src酪氨酸激酶为模型，本研究提供了开发和表征光调控Src（LightR-Src）的详细方案，并展示了该方法在不同酶类中的广泛适用性。

光遗传学有望实现对酶活性的复杂时空控制，其精度可达亚细胞水平。然而，大多数……

我们的整体研究致力于开发光遗传学方法，通过光实现对蛋白质活性的精确时空控制。我们设计了可被光调控的结构域，称为lightR，用于变构调控，从而研究时空可控的蛋白质活性如何影响细胞信号传导和功能，助力临床前疾病建模与治疗开发。光遗传学面临多项挑战，包括实现对目标蛋白质活性的精确且可逆的控制，以及准确模拟内源性信号传导的动力学特征。关键问题包括防止非预期激活、实现靶向性的亚细胞激活，以及控制光毒性以维持细胞活性。此外，开发具有广泛兼容性和高稳定性的工具对于提升应用中的多功能性和可重复性至关重要。我们的光遗传工具（lightR工具）构建方案独具特色，将多种先进功能整合于单一系统中，包括变构调控、高灵敏度、高空间分辨率、严格的时序控制以及精确的信号特异性。这种整合使得针对多种不同的靶蛋白具有可调节性，弥补了其他方法在这些关键能力上可能缺失一项或多项的不足。我们致力于阐明调控细胞迁移的关键信号传导和结构过程。我们的目标是利用光遗传学技术解析内皮细胞迁移及其相互作用的调控机制。了解内皮细胞如何介导细胞外基质的重塑，并确定这些过程的失调如何促进疾病的发生。为了对lightR激酶进行生化分析，每个实验组在3.5厘米的细胞培养皿中接种1×10⁶个lin XE细胞，在37°C和5% CO₂条件下培养16至18小时。次日，使用适当的转染试剂将选定的DNA构建体转染至细胞中。用铝箔覆盖培养皿，并放回培养箱中。转染后16至18小时，将一个465纳米的LED面板灯系统放入组织培养孵育箱内。在灯上方10厘米处放置一块带孔的有机玻璃板，以实现每平方厘米3毫瓦的光照强度。在表达 LightR-Src 和 D388 R-LightR-Src 的细胞中使用持续光照。通过手动开关 LED 面板来控制光照。在实验时间点结束时，在安全红光条件下收集细胞，吸除培养基，并用冷 PBS 洗涤细胞。对表达工程化 LightR-Src 的 lin XE 细胞进行 60 分钟全局光照，可观察到 Src 底物、内源性 paxillin 和 p130Cas 的磷酸化；而表达催化失活突变体 D388A LightR-Src 的细胞在全局光照下未显示 Src 底物的磷酸化。实验开始时，将每 35 毫米组织培养皿中接种 2 × 10⁵ 个 HeLa 细胞于细胞培养基中。于 37°C 和 5% CO₂ 条件下孵育细胞 2 小时。待细胞贴壁并达到60%至70%融合度后，用所提供的混合物对hella细胞进行共转染。用铝箔包裹培养皿，以防止细胞意外暴露于光照。然后将细胞在37°C和5%二氧化碳条件下孵育16至18小时。接下来，将直径为25毫米、厚度为0.17毫米的盖玻片放入六孔板中。用含5毫克/升纤连蛋白的PBS溶液包被三片圆形玻璃盖玻片，于37°C孵育过夜。转染后16至18小时，用PBS冲洗盖玻片。在安全的红光条件下收集转染的 HeLa 细胞，然后在安全的红光条件下将约 1 × 10⁵ 个转染的 HeLa 细胞接种到每个盖玻片上。用铝箔包裹培养板，在 37 °C、5% CO₂ 条件下的细胞培养基中孵育 2 小时。接着，将预先配制的成像培养基和矿物油预热至 37 °C。然后用 PBS 清洗载玻片上的细胞两次。染色并清洗细胞后，小心地将载玻片放入活细胞成像室中。向成像室中加入 1 毫升 L15 成像培养基。加入一毫升预热的矿物油至培养基中，以防止成像过程中液体蒸发。将培养腔置于避光条件下，并在 37 摄氏度环境中孵育，直至准备成像。将培养腔放置于预热至 37 摄氏度的显微镜载物台上。选择一个同时表达快速 LightR-Src 樱桃荧光蛋白和 Src 与 IRFP 的单细胞。选择细胞内特定的兴趣区域进行照射。在本研究中，选择所选细胞边缘的一个小区域。在光照前，以基础状态对选定细胞每分钟成像一次，持续20分钟。随后在局部照射条件下继续成像50分钟，激活后再成像20分钟，总计90分钟。成像结束后，将视频以tif堆栈文件格式保存用于分析。对HeLa细胞进行全局照射后，快速LightR-Src定位于黏着斑，当蓝光关闭后，该定位现象即被逆转。此光照还引起细胞铺展显著增加，而蓝光关闭后铺展停止。催化失活的D388 R-LightR-Src突变体未引起细胞铺展。表达快速 LightR-Src 的 HeLa 细胞在局部光照后，该蛋白在黏着斑中聚集，导致在 50 分钟光照后出现局部膜突起。光照后 20 分钟黑暗期间未观察到进一步的面积增加。在黑暗阶段，快速 LightR-Src 逐渐从黏着斑中消失。细胞的中心向光照区域移动。在快速激活 LightR-Src 后，表明细胞出现定向移动。

spatiotemporal-control-protein-activity-through-optogenetic

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

通过光遗传变构调控对蛋白质活性进行时空调控

本文描述了一种利用光控小GTP酶活性的时空调控方法。该方法基于雷帕霉素诱导的FKBP-FRB异源二聚化及光敏保护基团系统。通过优化光照条件，可实现亚细胞水平上小GTP酶活性的时空精确控制。...

活细胞中亚细胞水平及秒级时间尺度下小GTP酶活性的时空操控

此处介绍一种通过基因编码将光反应性非天然氨基酸定点插入培养神经元中表达的靶向神经元蛋白，从而利用短时闪光选择性激活该神经元蛋白的方法。 体内...

利用基因编码的非天然氨基酸在神经元中光学控制神经元蛋白

本方案描述了一种光遗传学策略，用于在细胞分化及Xenopus胚胎发育过程中调控丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的活性。该方法可在哺乳动物细胞培养以及多细胞活体生物（如Xenopus胚胎）中以高时空分辨率可逆地激活MAPK信号通路。...

光介导的细胞分化及Xenopus胚胎发育过程中丝裂原活化蛋白激酶通路的可逆调控

本方案描述了一种基于成像的T淋巴细胞激活方法，该方法利用光激活型肽-MHC实现对T细胞激活的精确时空控制。...

利用光激活型激动剂实现T细胞活化的时空控制

本文介绍了一种通过光遗传学控制和活细胞监测基因表达来分析细胞间振荡信息传递的实验方案。该方法为在多细胞系统中检验动态基因表达程序的功能意义提供了独特的研究平台。...

一种控制和分析细胞间相互作用中基因表达模式的光遗传学方法

本方案介绍了如何利用红光和远红光通过PhyB和PIF3控制基因表达来进行光遗传学实验。内容包括构建一个简单且灵活的照明系统的分步说明，该系统可实现通过计算机控制基因表达或其他光遗传学实验。...

构建用于光遗传学实验的简易多功能照明系统

可靠地控制光响应性哺乳动物细胞需要对光遗传学方法进行标准化。为实现这一目标，本研究以负反馈光遗传学基因回路为案例，提出了一套标准化研究光诱导基因表达的流程，包括基因回路构建、细胞工程、光遗传学设备操作以及验证性检测方法。...

在哺乳动物细胞中可靠地构建与调控稳定的光遗传学基因回路

光遗传学对微生物代谢的控制为发酵过程提供了灵活的动态调控手段。本方案展示了如何在不同体积规模下建立蓝光调控的发酵系统，用于化学品和蛋白质的生产。...

光控发酵用于微生物化学品与蛋白质生产

本方案概述了利用自动化平台Lustro在酵母中进行光遗传系统高通量表征的步骤。...

使用自动化平台Lustro在酵母中进行高通量光遗传学实验

本视频展示了胎儿胸腺的解剖与摘除，以及经2-dGuo处理的胸腺体外培养的制备过程。...

2-dGuo处理胸腺器官培养物的制备

了解光遗传变构调控技术，利用蓝光激活的LightR系统对Src激酶进行时空调控，实现蛋白质活性的可逆调节。该方法结合活细胞成像技术，为研究细胞信号传导和迁移机制提供新工具，助力疾病模型构建与治疗开发。

通过光遗传变构调控实现蛋白质活性的时空控制

探索更多视频