Name: 用于观察动力蛋白样 GTP 酶弹性蛋白构象动力学的单分子 FRET 成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: 了解单分子FRET成像技术如何用于研究动力蛋白样GTP酶弹性蛋白在GTP水解循环中的构象动态变化，揭示膜融合机制的关键分子过程。

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X.B. 受国家自然科学基金（32371287）、中央高校基本科研业务费专项资金（63223043 和 63233053）以及南开大学人才培育计划（035-BB042112）资助。Y.L. 受国家自然科学基金（12022409 和 T2221001）以及中国科学院前沿科学重点研究计划（ZDBS-LY-SLH015）资助。L.M. 受国家自然科学基金（32271274 和 31770812）资助。

本研究中所用试剂与设备的详细信息见材料表。
1. 蛋白质固定化反应室用修饰载玻片的制备
<ol>
	<li>准备
	<ol>
		<li>准备 50 mL 的piranha溶液（由浓硫酸和过氧化氢按3:1的比例组成），将过氧化氢缓慢加入浓硫酸中，以防止温度过高。将其小心放置于通风橱中。</li>
		<li>制备乙醇钠溶液。将 2 g NaOH 溶解于 15 mL ddH₂O 中。2加入35 mL无水乙醇，充分混匀，室温放置。</li>
		<li>制备高盐溶液（0.1 M NaHCO₃）3 和 0.6 M 的 K2SO4）。完全溶解后，分装为每管500 µL，于-20 °C保存。</li>
		<li>将SVA-mPEG和SVA-mPEG-biotin分别分装为每管约30 mg和每管3 mg，于-20 °C保存。</li>
		<li>定制显微镜载玻片（75 mm × 26 mm × 1 mm），每片打6对直径为1.2 mm的孔。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>清洁盖玻片表面
	<ol>
		<li>使用镊子夹取八片盖玻片并放入染色缸中。加入丙酮（约 50 mL）浸没盖玻片，将染色缸置于超声波清洗器中处理 30 分钟，然后用 ddH₂O 将盖玻片冲洗三次。2O.</li>
		<li>用甲醇清洗盖玻片，步骤同1.2.1。</li>
		<li>将piranha溶液（步骤1.1.1）加入染色缸中，置于95 °C水浴锅中加热2 h。待染色缸冷却至室温后，用ddH₂O至少冲洗盖玻片六次。2O.</li>
		<li>将乙醇钠溶液加入染色缸中，置于超声波清洗器中处理15分钟，然后用ddH₂O冲洗三次。2O.</li>
		<li>加入ddH₂O2将染色缸中的盖玻片用 ddH₂O 浸没，置于超声波清洗器中处理 15 分钟，随后用 ddH₂O 漂洗 3 次。2O.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>盖玻片表面的氨基硅烷化修饰
	<ol>
		<li>在洁净台中将盖玻片夹在染色缸内，用氮气吹干，然后放入另一已预先干燥的染色缸中。</li>
		<li>将染色缸置于干燥烘箱中，在120 °C下烘烤30分钟，然后在干燥器中冷却至室温。</li>
		<li>向已预先干燥的烧杯中加入47.5 mL甲醇、2.5 mL乙酸和0.5 mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES），混匀后转移至染色缸中，孵育10分钟。</li>
		<li>用 ddH₂O 清洗染色缸中的盖玻片2至少重复三次，并超声处理5分钟。</li>
		<li>逐一取出盖玻片，用ddH₂O冲洗2用氮气吹干，然后放入直径10 cm的培养皿中，以备进行PEG修饰。 
		注意：APTES 修饰必须在干燥环境中进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 SVA-mPEG-Biotin 和 SVA-mPEG 对盖玻片表面进行修饰 
	注意：盖玻片表面的生物素修饰有助于保留生物素标记的蛋白质（或结合生物素-抗His的蛋白质） 通过 链霉亲和素
	<ol>
		<li>将包装的 SVA-mPEG 和 SVA-mPEG-Biotin 完全溶解于高盐溶液中（1 mg 对应 10 µL 高盐溶液）。按 1:100 的比例将 SVA-mPEG-Biotin 溶液加入 SVA-mPEG 溶液中。 
		注意：使用涡旋振荡器震荡溶液，以确保 SVA-mPEG 或 SVA-mPEG-Biotin 完全溶解。SVA-mPEG 或 SVA-mPEG-Biotin 水溶液应在使用前配制。</li>
		<li>将制备好的混合溶液滴加到盖玻片上，并用另一张盖玻片覆盖，此操作应避免气泡产生。将盖玻片置于适宜湿度环境中孵育超过2小时或过夜。</li>
		<li>修饰完成后分离盖玻片，用ddH₂O冲洗2O，并用氮气吹干。标记未用SVA-mPEG和SVA-mPEG-biotin修饰的盖玻片表面。</li>
		<li>将修饰后的盖玻片小心放入50 mL离心管中。抽真空后于-20 °C保存。 
		注意：修饰后的盖玻片可在真空条件下保存1个月。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 蛋白质固定化反应室载玻片的制备
<ol>
	<li>按照步骤 1.2 中所述方法清洗载玻片。</li>
	<li>用氮气吹干载玻片，并将其放入 50 mL 微量离心管中。</li>
	<li>按照步骤 1.4.4 中所述方法储存载玻片。</li>
</ol>
3. 蛋白质表达与纯化
<ol>
	<li>准备
	<ol>
		<li>质粒：将感兴趣的 atlastin 家族成员或感兴趣的致病突变克隆至细菌表达载体（例如 pET-28a）中，并添加 Avitag27。通过定点诱变在相应位置引入半胱氨酸（例如 T51C 和 K400C27）。</li>
		<li>配制以下缓冲液。
		<ol>
			<li>LB（Luria-Bertani）培养基：将 10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提取物和 10 g 氯化钠溶于 1 L 去离子水（ddH2O）中，121°C 高压灭菌 20 分钟。</li>
			<li>裂解缓冲液：配制含 25 mM HEPES（pH 7.4）、150 mM KCl、5 mM MgCl2、1× 完整无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物、10 mM 咪唑和 0.5 mM TCEP 的溶液，4 °C 保存。</li>
			<li>洗涤缓冲液：配制含 25 mM HEPES（pH 7.4）、150 mM KCl、5 mM MgCl2、30 mM 咪唑和 0.5 mM 三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）的溶液，4 °C 保存。</li>
			<li>洗脱缓冲液：配制含 25 mM HEPES（pH 7.4）、150 mM KCl、5 mM MgCl2、150 mM 咪唑和 0.5 mM TCEP 的溶液，4 °C 保存。</li>
			<li>纯化缓冲液：25 mM HEPES（pH 7.4）、150 mM KCl、5 mM MgCl2、0.5 mM TCEP，4 °C 保存。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白纯化
	<ol>
		<li>采用细菌转化热激法将质粒27转入 Rosetta (DE3) (Biomed) E. coli 细胞中。将转化后的细胞悬浮于 LB 培养基中，并加入终浓度为 50 µg/µL 的卡那霉素。
		<ol>
			<li>37 °C 培养，直至培养基在 600 nm 处的吸光度达到 0.6–0.8。加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），终浓度为 50 µM，于 16 °C 诱导蛋白表达 20–24 小时。 
			注：可通过测定细胞培养物在 600 nm 处的光密度（吸光度）来监测细菌或其他微生物培养物的生长速率。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>室温下以 4000 × g 离心 20 分钟收集细胞，弃去上清液。</li>
		<li>用 30 mL 裂解缓冲液重悬细胞沉淀，使用高压细胞破碎仪破碎细胞三次。</li>
		<li>使用超速离心转子在 4 °C 下以 200,000 × g 离心 1 小时，澄清裂解液。</li>
		<li>使用 Ni-NTA 柱分离蛋白。用洗涤缓冲液洗涤 Ni-NTA 柱 5 个柱体积，再用洗脱缓冲液洗脱蛋白 1 个柱体积。收集洗脱液，并使用离心过滤器浓缩至约 500 µL。</li>
		<li>进一步通过尺寸排阻色谱法27纯化蛋白。每管收集 500 µL 洗脱液。</li>
		<li>通过 SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）测定分子量以确认目标蛋白27。收集目标蛋白用于后续修饰。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 蛋白质生物素标记
<ol>
	<li>准备
	<ol>
		<li>配制以下储存液。
		<ol>
			<li>将四水合乙酸镁（MgOAc·4H2O）溶解于25 mM HEPES缓冲液（pH 7.7）中，配制成100 mM（10×）溶液。每管分装100 µL，于-20 °C保存。</li>
			<li>将腺苷5-三磷酸二钠盐（ATP）溶解于ddH2O中，配制成100 mM（10×）溶液。用NaOH调节pH至7.4。每管分装100 µL，于-80 °C保存。</li>
			<li>将D-生物素（d-biotin）溶解于ddH2O中，配制成500 µM溶液。每管分装100 µL，于-20 °C保存。</li>
			<li>将链霉亲和素（streptavidin）溶解于ddH2O中，配制成1 mg/mL溶液。每管分装20 µL，于-20 °C保存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>蛋白生物素化缓冲液：加入25 mM HEPES（pH 7.7）、200 mM L-谷氨酸钾和0.5 mM TCEP。4 °C保存。</li>
		<li>纯化BirA生物素连接酶，并于-80 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白生物素化
	<ol>
		<li>将蛋白缓冲液置换为蛋白生物素化缓冲液。进行生物素化反应时，混合以下组分至终体积1 mL：100 µL 100 mM ATP、100 µL 100 mM MgOAc、100 µL 500 µM d-biotin、10 µL 100 µM BirA生物素连接酶和50 µM蛋白，于4 °C孵育过夜。</li>
		<li>使用10 K MWCO离心过滤器去除游离的d-biotin。</li>
		<li>将20 µL生物素化蛋白与20 µL 15 µM链霉亲和素在冰上孵育20分钟。通过SDS-PAGE27检测蛋白生物素化效率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 蛋白质荧光标记
<ol>
	<li>准备
	<ol>
		<li>将荧光染料 LD555（供体）和 LD655（受体）溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，配制成终浓度为 5 mM 的溶液。储存于 -20 °C。</li>
		<li>配制标记缓冲液：将 25 mM HEPES（pH 7.4）、150 mM KCl 和 5 mM MgCl2 混合。储存于 4 °C。</li>
		<li>将蛋白缓冲液置换为标记缓冲液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>荧光染料标记
	<ol>
		<li>进行分子内单分子 FRET 实验时，按 1:1.2:1.2 的比例将 ATL1cyto-TK 与 LD555 和 LD655 混合，总体积为 100 µL（荧光染料总体积不得超过 1 µL），在 4 °C 下孵育 5 小时。</li>
		<li>进行分子间单分子 FRET 实验时，将 ATL1cyto-K 或 ATL1cyto-T 与 LD555 按 1:1.2 的比例混合孵育，同时将生物素化的 ATL1cyto-K 与 LD655 按 1:1.2 的比例混合孵育，均在 4 °C 下孵育 5 小时（孵育体积与步骤 5.2.1 相同）。 
		注意：蛋白与染料共孵育可灵活选择 LD555（供体）和 LD655（受体）的标记位点。LD555 标记在 T51C 或 K400C 位点并不影响 FRET 实验结果。供体标记在 T51C 位点的示意图见（图 1C、D）。</li>
		<li>使用 7 K MWCO 离心脱盐柱去除未结合的游离荧光染料27。</li>
		<li>向荧光染料标记的蛋白中加入 TCEP，使其终浓度为 0.5 mM。</li>
		<li>使用分光光度计检测蛋白的标记效率。分别测定蛋白在 280 nm 处的吸光度、LD555 在 555 nm 处的吸光度以及 LD655 在 655 nm 处的吸光度，并根据各自的摩尔消光系数计算摩尔浓度。蛋白标记效率 =（荧光染料摩尔浓度 / 蛋白摩尔浓度）× 100%。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 单分子FRET成像
<ol>
	<li>准备
	<ol>
		<li>配制孵育缓冲液：将 25 mM HEPES（pH 7.4）、150 mM KCl 和 5 mM MgCl2 混合。4 °C 保存。</li>
		<li>配制 1 mg/mL 链霉亲和素（溶于 ddH2O）和 1 mg/mL 生物素化抗-His 抗体，用于蛋白固定。</li>
		<li>配制 25 mM 苯甲酸（pH 7.4；溶于 7.1.1 中所述缓冲液）和 100 mM 原儿茶酸 3,4-双加氧酶（PCD）（溶于 40% 甘油溶液），以减少单分子 FRET 实验中的光漂白。</li>
		<li>配制 100 mM 鸟苷-5'-二磷酸钠盐（GDP）、鸟苷-5'-O-[γ-硫代]三磷酸（GTPγS）和 AlCl3 储存液（均溶于 ddH2O）。配制 1 M NaF 储存液（溶于 ddH2O）。</li>
		<li>取出真空保存的盖玻片和载玻片，在洁净台中用定制双面胶将两者小心粘合。安装管路和接头，构建具有六个通道的微流控腔室27。 
		注意：避免修饰后的盖玻片长时间暴露于空气中。在开始单分子 FRET 实验前，应先完成微流控腔室的制备27。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成像位置校正 
	注意：实验过程中需分别从供体和受体通道采集荧光信号。由于显微镜的使用，供体与受体通道的监测视野可能存在轻微偏差。为减小该偏差，实验开始前必须进行成像位置校准。
	<ol>
		<li>充分混匀 10% 聚苯乙烯微球（直径 3 µm），取 10 µL 加入未修饰的载玻片上，并用未修饰的盖玻片封片。</li>
		<li>选择包含尽可能多聚苯乙烯微球的视野，使用全内反射荧光（TIRF）显微镜在明场下采集视频。 
		注意：本实验采用高数值孔径油浸物镜（100×）进行高分辨率成像。单分子 FRET 实验中，使用 EMCCD 相机以 30 ms 帧间隔采集信号。</li>
		<li>使用自定义脚本对同一聚苯乙烯微球在供体通道和受体通道中的中心位置进行对齐，并将校准图文件保存为 txt 文件。本研究使用的自定义 MATLAB 代码可在&#160;https://github.com/yangchenguang-1994/HMM-FRET 获取。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在腔室内固定蛋白
	<ol>
		<li>进行分子间单分子 FRET 实验时，将 LD555 标记的 ATL1cyto-K 或 ATL1cyto-T 与 LD655 标记的 ATL1cyto-K-生物素按 1:1 比例混合，终浓度为 1 mM GTPγS 或 GDP/AlF4-，冰上孵育 1 小时以形成蛋白二聚体。</li>
		<li>进行 ATL1cyto-T 与 ATL1cyto-K 分子间单分子 FRET 实验时，将 LD555 标记的 ATL1cyto-T 与 LD655 标记的 ATL1cyto-K-生物素按 1:1 比例混合，终浓度为 1 mM GTPγS 或 GDP/AlF4-，冰上孵育 1 小时以获得二聚化蛋白。</li>
		<li>进行分子内单分子 FRET 实验时，在 GDP 条件下进行实验前，将 LD555 和 LD655 标记的 ATL1cyto-TK 与 1 mM GDP 在冰上孵育 1 小时。</li>
		<li>进行分子间单分子 FRET 实验时，加入 10 µg/mL 链霉亲和素（用 200 µL 孵育缓冲液稀释），孵育 10 分钟以固定蛋白。进行分子内单分子 FRET 实验时，加入 10 µg/mL 生物素化抗-His 抗体（用 200 µL 孵育缓冲液稀释），孵育 10 分钟以固定蛋白。每次加入溶液前，用孵育缓冲液冲洗通道一次。</li>
		<li>将 ATL1 二聚体稀释至约 0.3 nM 或单体稀释至约 1 nM（溶于 200 µL 孵育缓冲液），孵育 10 分钟以在通道内固定蛋白。用孵育缓冲液冲洗通道两次。向通道中加入苯甲酸和 PCD，终浓度为 2.5 mM（用 200 µL 缓冲液稀释）。 
		注意：为模拟 ATL1cyto 分子在 GTP 水解过程中的不同阶段，在蛋白固定于通道后，每一步缓冲液中均加入核苷酸（GDP、GTPγS 和 GDP/AlF4-），终浓度为 1 mM。加入 GTPγS 模拟 GTP 结合，加入 GDP/AlF4- 模拟 GTP 水解，加入 GDP 模拟 Pi 释放，无核苷酸状态代表 GDP 释放。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单分子 FRET 成像
	<ol>
		<li>调节焦平面。使用粗调和细调焦旋钮，调整焦平面使样品清晰对焦。本实验采用自动对焦系统实现最佳聚焦。</li>
		<li>设置激发光源。使用 532 nm 激光作为激发光源。将激光功率调节至适当水平以激发荧光团。本实验中使用 20–40 mW 的激光功率。</li>
		<li>将 EMCCD 相机连接至显微镜。设置相机以 30 ms 帧间隔进行记录。确保相机设置为 16 位模式以获取高分辨率数据。</li>
		<li>记录视频，确保采集过程中焦点保持稳定。在记录荧光信号时，尽可能延长 532 nm 激光照射时间，直至大多数荧光分子被淬灭。</li>
		<li>将记录的视频以 16 位 TIFF 格式保存，用于后续分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 数据采集与分析
<ol>
	<li>在从录制的视频中提取FRET轨迹之前，先加载用于校正的map txt文件。选择FRET轨迹，并将每条FRET轨迹数据保存为txt格式，以供进一步分析。</li>
	<li>从txt文件中提取数据，并使用Matlab2022a中的自编脚本计算FRET值。自定义的MATLAB代码可在&#160;https://github.com/yangchenguang-1994/HMM-FRET 获取。 
	注意：FRET值通过公式 ILD655/(γILD555+ILD655) 计算。ILD555 和 ILD655 分别代表LD555和LD655的荧光强度。γ 是通过公式 γ = FA/FD 获得的参数。FA 表示受体荧光强度的减少量，FD 表示供体荧光强度的增加量。</li>
	<li>在Origin 2022中使用GaussAmp对单分子FRET（smFRET）数据进行拟合，以获得分布直方图。 
	注意：对于具有多个FRET状态的数据（分子间smFRET中GTPγS条件下的数据，或分子内smFRET在GDP或Apo条件下的数据），可采用多峰拟合。</li>
</ol>

Monitoring GTPase Atlastin in Different Nucleotide Loading States

<ol><li>Jimah, J. R., Hinshaw, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+mechanism+of+dynamin+superfamily+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the mechanism of dynamin superfamily proteins.</a> Trends Cell Biol. 29 (3), 257-273 (2019).</li>
<li>Kalia, R., Frost, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+and+cut%3A+Allosteric+motion+and+membrane+fission+by+dynamin+superfamily+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Open and cut: Allosteric motion and membrane fission by dynamin superfamily proteins.</a> Mol Biol Cell. 30 (17), 2097-2104 (2019).</li>
<li>Ramachandran, R., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamin+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The dynamin superfamily.</a> Curr Biol. 28 (8), R411-R416 (2018).</li>
<li>Bryce, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+atlastin-3+is+a+constitutive+ER+membrane+fusion+catalyst%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Human atlastin-3 is a constitutive ER membrane fusion catalyst.</a> J Cell Biol. 222 (7), e202211021(2023).</li>
<li>Crosby, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+human+atlastin+fusion+activity+reveals+autoinhibition+by+the+C+terminus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of human atlastin fusion activity reveals autoinhibition by the C terminus.</a> J Cell Biol. 221 (2), e202107070(2022).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+class+of+dynamin-like+GTPases+involved+in+the+generation+of+the+tubular+er+network%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A class of dynamin-like GTPases involved in the generation of the tubular er network.</a> Cell. 138 (3), 549-561 (2009).</li>
<li>Jang, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+atlastins+are+sufficient+to+drive+the+fusion+of+liposomes+with+a+physiological+lipid+composition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Human atlastins are sufficient to drive the fusion of liposomes with a physiological lipid composition.</a> J Cell Biol. 222 (4), e202109090(2023).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atlastin-1+regulates+morphology+and+function+of+endoplasmic+reticulum+in+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Atlastin-1 regulates morphology and function of endoplasmic reticulum in dendrites.</a> Nat Commun. 10 (1), 568(2019).</li>
<li>Orso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homotypic+fusion+of+ER+membranes+requires+the+dynamin-like+gtpase+atlastin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like gtpase atlastin.</a> Nature. 460 (7258), 978-983 (2009).</li>
<li>Rismanchi, N., Soderblom, C., Stadler, J., Zhu, P. P., Blackstone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atlastin+GTPases+are+required+for+Golgi+apparatus+and+er+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Atlastin GTPases are required for Golgi apparatus and er morphogenesis.</a> Hum Mol Genet. 17 (11), 1591-1604 (2008).</li>
<li>Faust, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+atlastin+C-terminal+tail+is+an+amphipathic+helix+that+perturbs+the+bilayer+structure+during+endoplasmic+reticulum+homotypic+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The atlastin C-terminal tail is an amphipathic helix that perturbs the bilayer structure during endoplasmic reticulum homotypic fusion.</a> J Biol Chem. 290 (8), 4772-4783 (2015).</li>
<li>Liu, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+interaction+of+the+c+terminus+and+association+of+the+transmembrane+segments+facilitate+atlastin-mediated+homotypic+endoplasmic+reticulum+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Lipid interaction of the c terminus and association of the transmembrane segments facilitate atlastin-mediated homotypic endoplasmic reticulum fusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), E2146-E2154 (2012).</li>
<li>Moss, T. J., Andreazza, C., Verma, A., Daga, A., Mcnew, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+fusion+by+the+GTPase+atlastin+requires+a+conserved+c-terminal+cytoplasmic+tail+and+dimerization+through+the+middle+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Membrane fusion by the GTPase atlastin requires a conserved c-terminal cytoplasmic tail and dimerization through the middle domain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (27), 11133-11138 (2011).</li>
<li>Bian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+atlastin+GTpase+provide+insight+into+homotypic+fusion+of+endoplasmic+reticulum+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Structures of the atlastin GTpase provide insight into homotypic fusion of endoplasmic reticulum membranes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (10), 3976-3981 (2011).</li>
<li>Byrnes, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+conformational+switching+and+GTP+loading+of+the+large+g+protein+atlastin%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Structural basis for conformational switching and GTP loading of the large g protein atlastin.</a> EMBO J. 32 (3), 369-384 (2013).</li>
<li>Byrnes, L. J., Sondermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+nucleotide-dependent+dimerization+of+the+large+g+protein+atlastin-1%2Fspg3a%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the nucleotide-dependent dimerization of the large g protein atlastin-1/spg3a.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (6), 2216-2221 (2011).</li>
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<li>Pendin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTP-dependent+packing+of+a+three-helix+bundle+is+required+for+atlastin-mediated+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">GTP-dependent packing of a three-helix bundle is required for atlastin-mediated fusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (39), 16283-16288 (2011).</li>
<li>Winsor, J., Hackney, D. D., Lee, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crossover+conformational+shift+of+the+GTPase+atlastin+provides+the+energy+driving+ER+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The crossover conformational shift of the GTPase atlastin provides the energy driving ER fusion.</a> J Cell Biol. 216 (5), 1321-1335 (2017).</li>
<li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+yeast+dynamin-like+GTPase+sey1p+provide+insight+into+homotypic+er+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Structures of the yeast dynamin-like GTPase sey1p provide insight into homotypic er fusion.</a> J Cell Biol. 210 (6), 961-972 (2015).</li>
<li>Rizo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+underlying+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms underlying neurotransmitter release.</a> Annu Rev Biophys. 51, 377-408 (2022).</li>
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<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+DNA+translocation+underlying+chromatin+remodelling+by+snf2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of DNA translocation underlying chromatin remodelling by snf2.</a> Nature. 567 (7748), 409-413 (2019).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+dynamics+of+dynamin-like+MXA+revealed+by+single-molecule+fret%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Conformational dynamics of dynamin-like MXA revealed by single-molecule fret.</a> Nat Commun. 8, 15744(2017).</li>
<li>Shi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+mechanism+of+atlastin-mediated+homotypic+membrane+fusion+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Dissecting the mechanism of atlastin-mediated homotypic membrane fusion at the single-molecule level.</a> Nat Commun. 15 (1), 2488(2024).</li>
<li>Guelly, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+high-throughput+sequencing+identifies+mutations+in+atlastin-1+as+a+cause+of+hereditary+sensory+neuropathy+type+i%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Targeted high-throughput sequencing identifies mutations in atlastin-1 as a cause of hereditary sensory neuropathy type i.</a> Am J Hum Genet. 88 (1), 99-105 (2011).</li>
<li>Montagna, A., Vajente, N., Pendin, D., Daga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+CRISPR%2FCas9+induced+atlastin+pathological+mutations+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of CRISPR/Cas9 induced atlastin pathological mutations in drosophila.</a> Front Neurosci. 14, 547746(2020).</li>
<li>Ulengin, I., Park, J. J., Lee, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+network+formation+and+membrane+fusion+by+atlastin1%2Fspg3a+disease+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">ER network formation and membrane fusion by atlastin1/spg3a disease variants.</a> Mol Biol Cell. 26 (9), 1616-1628 (2015).</li>
<li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+a+newly+identified+GTPase+gene+cause+autosomal+dominant+hereditary+spastic+paraplegia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in a newly identified GTPase gene cause autosomal dominant hereditary spastic paraplegia.</a> Nat Genet. 29 (3), 326-331 (2001).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

FRET 技术基于两种荧光染料（供体和受体）之间的能量转移。当这两种染料彼此靠近时（通常为 1-10 nm），被激发的供体会将其能量转移给受体，导致供体荧光强度降低，同时受体荧光强度增加。
在单分子FRET实验中，分子被稀释至极低浓度并固定在载玻片上，通过全内反射荧光显微镜（TIRF）检测单个分子的FRET信号。供体和受体荧光染料共价连接至分子的特定位置，当蛋白质发生构象变化或与其他分子相互作用时，FRET效率与荧光团之间的距离呈负相关。因此，通过测量受体与供体荧光强度的比值，可获得有关单个生物大分子构象动态、折叠动力学以及聚合物形成与解离的重要信息。
在当前的实验中，利用蛋白质中的半胱氨酸通过马来酰亚胺残基标记荧光团。然而，使用该方法标记蛋白质需要将蛋白质中的半胱氨酸残基突变为其他氨基酸（例如丙氨酸），并将需要标记的氨基酸突变为半胱氨酸。引入多个突变可能导致蛋白质结构和功能的改变。因此，在进行单分子实验之前，有必要分析多个突变对蛋白质的影响。除了马来酰亚胺与半胱氨酸的反应外，还可以通过将非天然氨基酸引入目标蛋白质，并利用点击...

在真核细胞中，动力蛋白超家族蛋白介导生物膜的重塑过程，包括膜管形成、断裂和融合1,2,3。这些蛋白的突变可导致多种人类疾病，例如神经退行性疾病。动力蛋白超家族成员通常包含一个GTP酶结构域、一个由螺旋束组成的中间结构域、一个膜结合基序以及一个GTP酶效应结构域（GED）。其中一种类似动力蛋白的GTP酶是atlastin（ATL），它可催化内质网（ER）的同型膜融合，从而形成网状结构4,5,6,7,8,9,10。哺乳动物中有三种ATL蛋白（ATL1-3）。ATL分子包含一个N端胞质区（ATLcyto），其中包括一个GTP酶结构域和一个三螺旋中间结构域（3HB），其后为两个跨膜区域，但缺乏典型的GED结构域。此外，ATL含有一个C端尾部，该区域在膜融合过程中发挥关键作用11,12,13。
已有研究报道，高效的膜融合依赖于ATLcyto中由GTP水解驱动的结构域重排14,15,16,17,18,19,20。然而，与利用构象变化产生的折叠能来驱动异型膜融合的SNARE复合物相比21，由ATL及其他融合特异性的类动力蛋白dynamin-like蛋白所介导的同型膜融合过程仍不明确22。目前已解析出三种在不同核苷酸结合状态下的人源ATL1cyto晶体结构14,15,16,23。在这些结构中，二聚体内的两个3HB结构域指向不同方向，但目前仍缺乏一个完整的模型来阐明ATLcyto的构象动力学与其GTP酶活性之间的偶联机制。
在先前的模型中，单体ATL分子以GTP依赖的方式跨不同膜形成二聚体，从而驱动膜融合。本文描述了三种策略，应用单分子Förster共振能量转移（smFRET）技术直接观察并准确检测单个ATL1cyto分子的行为。smFRET是一种强大的技术，广泛用于实时研究单个生物大分子的构象动态和相互作用，例如GPCR介导的β-arrestin激活24、Snf2介导的染色质重塑25，以及与GTP水解循环偶联的dynamin样蛋白MxA的结构域重排26。由于smFRET仅能有效检测约3 nm至约8 nm范围内的距离变化，因此需要同时进行分子间和分子内smFRET实验，以全面分析每种核苷酸结合状态下ATL1cyto的构象。我们构建了三种ATL1cyto突变体，其中所有天然半胱氨酸均被丙氨酸取代，并将K400（ATL1cyto-K）或T51/K400位点（ATL1cyto-TK）突变为半胱氨酸以用于荧光标记。将ATL1cyto二聚体或单体固定于链霉亲和素包被的微流控腔室中以进行分子间或分子内smFRET实验的策略如图1A所示，具体方法见图1B-D。该方法可更详细地揭示dynamin样蛋白在GTP水解各个步骤中的构象动态27。

<table><tbody><tr><td>10 K 离心过滤器</td><td>Amicon</td><td>UFC901096</td><td></td></tr><tr><td>3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>45 Ti 转子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>532 nm 激光器</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>640 nm 激光器</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7 K 分子量截留值旋转脱盐柱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>89882</td><td></td></tr><tr><td>三磷酸腺苷二钠盐（ATP）</td><td>罗氏</td><td>11140965001</td><td></td></tr><tr><td>苯甲酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242381</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG-SVA-5000</td><td>莱桑生物</td><td>170-124</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的抗His抗体</td><td>Bioss 抗体</td><td>bs-0287R-bio</td><td></td></tr><tr><td>d-生物素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>无EDTA蛋白酶抑制剂混合物</td><td>罗氏</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD相机</td><td>安道尔</td><td>IX897</td><td></td></tr><tr><td>鸟苷-5′-三磷酸&amp;prime;二磷酸鸟苷钠盐（GDP）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;G7127</td><td></td></tr><tr><td>鸟苷5'-O-[γ-硫代]三磷酸（GTP&amp;gamma;S</td><td>罗氏</td><td>10220647001</td><td></td></tr><tr><td>高数值孔径油浸物镜</td><td>尼康</td><td></td><td>尼康，100倍，数值孔径1.49，油浸</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院</td><td></td><td>https://imagej.net/ij/</td></tr><tr><td>异丙基-&amp;Beta;-D-硫代半乳糖苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5502</td><td></td></tr><tr><td>LD555-MAL</td><td>Lumidyne</td><td>4</td><td></td></tr><tr><td>LD655-MAL</td><td>Lumidyne</td><td>10</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酸钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>四水合乙酸镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0631</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>The MathWorks，美国马萨诸塞州纳蒂克</td><td></td><td>https://www.mathworks.com/</td></tr><tr><td>显微镜盖玻片</td><td>Fisherbrand</td><td>18834</td><td>&amp;nbsp;(24 mm &amp;times; 60 mm</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td></td><td></td><td>定制，（75 mm &amp;times; 26 mm &amp;times; 1 毫米）带6对直径为1.2 毫米的通孔</td></tr><tr><td>mPEG-SVA-5000</td><td>莱桑生物</td><td>170-106</td><td></td></tr><tr><td>Ni Sepharose 6 Fast Flow</td><td>Cytiva</td><td>17531802</td><td></td></tr><tr><td>起源</td><td>Origin 软件</td><td></td><td>https://www.originlab.com/</td></tr><tr><td>聚苯乙烯颗粒</td><td>QDSphere</td><td>AG1265</td><td></td></tr><tr><td>原儿茶酸3,4-双加氧酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8279</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610492</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 Increase (10/300 GL)</td><td>Cytiva</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>全内反射荧光显微镜</td><td>尼康</td><td>Ti2</td><td></td></tr><tr><td>盐酸三(2-羧乙基)膦 (TCEP)</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>75259</td><td></td></tr></tbody></table>

单分子fret成像观察动力蛋白样gtp酶atlastin的构象动力学

Single-Molecule FRET Imaging for Observing the Conformational Dynamics of Dynamin-Like GTPase Atlastin

在内质网（ER）内的同型膜融合过程中，动力蛋白样蛋白 atlastin（ATL）的三螺旋中间结构域（3HB）相对于GTP酶结构域的刚体旋转是一个关键驱动因素。该过程的异常与遗传性痉挛性截瘫（HSP）——一种神经退行性疾病——密切相关。结构与生化研究表明，ATL的构象变化与GTP水解相关，但在GTP水解循环过程中实时观察这些构象动态仍具挑战性。为了更深入理解ATL功能背后的机械机制，研究采用了单分子Förster共振能量转移（smFRET）技术。通过三种特定策略，将人源ATL1的N端胞质区（ATL1cyto）固定于链霉亲和素包被的微流控腔室中，从而实现分子内和分子间smFRET成像。该方法可精确监测蛋白质在不同核苷酸加载状态下的构象变化，直接揭示单个分子的行为特征。此方法亦可用于研究其他力化学蛋白。

单分子FRET实验在全内反射荧光显微镜（TIRF）上进行，每30 ms采集一次荧光染料的荧光强度。图2A-C展示了在无或含有不同核苷酸条件下，LD555（供体）和/或LD655（受体）标记的ATL1cyto分子的代表性图像。记录了单个颗粒上两种荧光染料的荧光强度，并提取出数百条表现出典型单分子特征的FRET轨迹。代表性轨迹如图2D-F所示。在无核苷酸或存在GDP的条件下，ATL1cyto单体表现出具有四个FRET态的动态FRET轨迹（图2D），表明ATL1的GTP酶结构域与3HB区域在这些状态下具有柔性；但GDP结合的ATL1cyto倾向于闭合构象，而GDP释放会改变ATL1cyto的构象偏好，使其转向开放构象（<strong class=...

动力蛋白超家族蛋白的功能依赖于与GTP水解相偶联的构象变化。本文描述了一种利用单分子FRET（smFRET）技术监测类动力蛋白GTP酶atlastin在不同核苷酸负载状态下构象动态变化的系统。

单分子FRET成像观察动力蛋白样GTP酶Atlastin的构象动力学

三螺旋中间结构域（3HB）相对于动力蛋白样蛋白 atlastin（ATL）的GTPase结构域的刚体旋转是一个关键驱动因素……

我们致力于研究细胞内膜的融合机制。在本方案中，我们旨在通过单分子FRET技术揭示内质网膜融合蛋白atlastin在其GTP水解循环过程中的构象动态。atlastin在GTP水解循环中可能以单体或二聚体形式存在。在单分子实验中，寻找合适的蛋白质标记和固定策略具有挑战性，以下展示了 atlastin 在 GTP 水解循环过程中的构象动态。与整体 FRET 相比，smFRET 能够精确监测蛋白质在不同核苷酸结合状态下的构象变化，从而直接揭示调节分子的行为特征。我们利用 smFRET 全面解析了 atlastin 在不同固定策略下的 GTP 水解循环过程。我们相信，我们的研究结果将推动对GTP水解蛋白构象动力学的更深入研究，并为罕见生物学过程提供新的解读。为清洁盖玻片表面，使用镊子夹取八片盖玻片并放入染色缸中。加入50毫升丙酮以浸没盖玻片，并将染色缸置于超声波清洗仪中处理30分钟。用双蒸水将盖玻片冲洗三次，然后在超声波清洗器中用甲醇洗涤。接着，将piranha溶液加入染色缸中，在95摄氏度的水浴锅中加热两小时。待染色缸冷却至室温后，用双蒸水将盖玻片冲洗六次。将甲醇钠溶液加入染色缸中，置于超声波清洗器中处理15分钟。用清水冲洗盖玻片后，向染色缸中加入重蒸水，再置于超声波清洗器中处理15分钟。用夹子将盖玻片固定于染色缸中，并用氮气吹干。将干燥的盖玻片转移至另一个染色缸中，将染色缸置于烘箱中于120摄氏度下烘烤30分钟。随后，在干燥器中冷却至室温。向烧杯中加入47.5毫升甲醇、2.5毫升乙酸和0.5毫升三乙氧基硅烷，并混合均匀。将混合物转移至染色缸中，孵育10分钟。在染色缸中用双蒸水冲洗盖玻片三次，并超声处理5分钟。如图所示，用清水冲洗盖玻片并用氮气吹干后，将盖玻片放入直径为10厘米的培养皿中。将 SVA-mPEG 和 SVA-mPEG-Biotin 按照 1:100 的比例溶解于高盐溶液中。将制备好的混合液滴加到盖玻片上，并用另一张盖玻片覆盖。在适当湿度条件下孵育两小时或过夜。修饰后，将盖玻片分开，用去离子水冲洗，并用氮气吹干。小心地将修饰后的盖玻片放入一个50毫升离心管中。在纯化于Rosetta大肠杆菌细胞中表达的发动蛋白样蛋白atlastin（ATL）的GTP酶结构域后，使用10千道尔顿的离心滤膜将蛋白质缓冲液置换为蛋白质生物素化缓冲液。进行蛋白质生物素化时，将各100微升的100毫摩尔ATP、100毫摩尔乙酸镁和500微摩尔D-生物素，10微升100微摩尔BirA生物素连接酶，以及50微摩尔目标蛋白质混合，定容至1毫升。在4摄氏度下孵育过夜。次日，使用截留分子量为10千道尔顿的离心过滤装置去除游离的D-生物素。将20微升生物素标记的蛋白与20微升15微摩尔的链霉亲和素在冰上孵育20分钟。使用SDS-PAGE检测蛋白生物素标记效率。将LD555和LD655荧光染料溶于二甲基亚砜，配制成终浓度为5毫摩尔的溶液。配制标记缓冲液时，混合25毫摩尔的HEPES、150毫摩尔的氯化钾和5毫摩尔的氯化镁。使用10千道尔顿的离心滤膜将蛋白质缓冲液置换为标记缓冲液。进行分子内单分子FRET实验时，按1:1.2:1.2的比例混合ATL1cyto-TK、LD555和LD655，最终体积为100微升。将混合物在 4°C 条件下孵育 5 小时。进行分子间 smFRET 实验时，将 ATL1cyto-K 与 LD555 以及生物素标记的 ATL1cyto-K 与 LD655 在 4°C 条件下共同孵育 5 小时。为制备蛋白质固定化反应室，请使用定制的双面胶带小心地将修饰后的盖玻片和显微镜载玻片粘合。安装管路和接头，构建一个具有六个通道的微流控腔室。为进行映射校正，取10微升10%的聚苯乙烯微粒滴加到显微镜载玻片上，并盖上盖玻片。然后，在全内反射荧光显微镜下选择一个含有聚苯乙烯微粒的视野，以明场模式采集一段视频。使用自定义脚本对齐供体和受体通道中同一聚苯乙烯颗粒的中心位置。将地图文件保存为 TXT 文件。对于分子间单分子荧光共振能量转移（smFRET）实验，将 LD555 标记的 ATL1cyto-K 与 LD655 标记的 ATL1cyto-K-生物素按 1:1 的比例混合，GTP-γ-S 的终浓度为 1 毫摩尔。将混合物置于冰上孵育一小时，以使蛋白质二聚化。在ATL1cyto-T与ATL1cyto-K的分子间单分子FRET实验中，将LD555标记的ATL1cyto-T与LD655标记的ATL1cyto-K-biotin按1:1比例混合，并加入1毫摩尔的GTP-γ-S。将混合物置于冰上孵育一小时，以获得二聚化的蛋白质。然后，对于分子内单分子FRET实验，将标记有LD555和LD655的ATL1cyto-TK与1毫摩尔的GDP在冰上孵育1小时。对于分子间实验，加入10微克/毫升的链霉亲和素，孵育10分钟以固定蛋白质。对于分子内实验，加入10微克/毫升的生物素化抗His抗体，孵育10分钟以固定蛋白质。孵育后，将稀释的ATL1二聚体加入通道中的蛋白质，使其固定10分钟。用孵育缓冲液冲洗通道两次。向通道中加入苯甲酸和PCD，终浓度为2.5毫摩尔。选择532纳米激光作为激发光源。将EMCCD相机设置为以30毫秒的帧间隔记录数据。以16位TIFF格式保存录制的视频。数据采集完成后，从录制的视频中提取FRET轨迹。选择并以TXT格式保存FRET轨迹。从TXT文件中提取数据，并使用MATLAB编写的自定义脚本计算FRET值。使用 Origin 中的 GaussAmp 拟合 smFRET 数据，以获得分布直方图。

single-molecule-fret-imaging-for-observing-conformational-dynamics

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生物化学

用于观察动力蛋白样 GTP 酶弹性蛋白构象动力学的单分子 FRET 成像

本视频介绍了TIRF技术，这是一种基于全内反射显微镜的方法，用于观察肌动蛋白和微管聚合的动态过程。该方法能够实现对肌动蛋白与微管偶联动态的高分辨率实时成像，对于理解细胞间相互作用至关重要。...

利用TIRF显微镜观察肌动蛋白与微管耦联动力学

利用FIONA技术可实现单个荧光分子的纳米级精确定位。本文介绍了FIONA技术的基本原理，并详细描述了如何开展FIONA实验。...

单纳米荧光成像（FIONA）

本文展示了如何在活体运动神经末梢上进行单分子光激活定位显微镜成像 黑腹果蝇...

体内 果蝇运动神经突触前末梢的单分子示踪

我们介绍了如何利用微操作和光操控技术（如荧光漂白恢复技术FRAP和光激活技术），来测定迁移细胞内蛋白质的运动参数及其时空动态。实验读出结果包括运动调控因子或其下方肌动蛋白细胞骨架的亚细胞动态行为与更新速率。...

允许分析细胞骨架调节因子形态发生动力学与周转的显微操作技术

本文介绍了一种实验方案，可同时利用基于荧光共振能量转移的张力传感器测量蛋白质所受载荷，并结合光漂白后荧光恢复技术测量蛋白质动态，从而实现对活细胞内受力敏感的蛋白质动态进行定量分析。...

利用荧光技术组合测量活细胞中力敏感蛋白的动力学

我们介绍了简单的肌动蛋白丝微流控实验方案，结合荧光显微镜技术，可实时准确监测单个肌动蛋白丝，并依次将其暴露于不同的蛋白质溶液中。...

利用微流控技术与荧光显微镜研究单根肌动蛋白丝及其束状结构的组装动力学

本方案描述了支撑脂双层的形成，以及细胞骨架丝和马达蛋白的添加，用于通过荧光显微镜研究重建的膜锚定细胞骨架网络的动力学。...

在支撑脂双层上重建膜锚定的最小肌动蛋白皮层

本方案旨在通过可视化动态微丝和微管提供操作指南 体外 全内反射荧光（TIRF）显微镜检测...

可视化肌动蛋白与微管耦合动力学 体外 通过全内反射荧光（TIRF）显微镜技术

本方案描述了如何使用全内反射荧光显微镜（TIRF）追踪支撑脂质膜中的单个离子通道并测定其活性，从而阐明侧向膜运动与通道功能之间的相互作用。方案详细介绍了如何制备膜样品、记录数据以及分析结果。...

使用全内反射荧光显微技术对脂双层中单分子侧向迁移及离子通道活性进行成像

我们报道了一种混合的群体与单分子检测方法，可直接成像并定量荧光标记的、完全重建的Cdc45/Mcm2-7/GINS（CMG）解旋酶在由光镊固定的线性DNA分子上的运动。...

杂合组装与单分子检测技术用于成像完全重建的CMG的运动

本文介绍了利用纯化蛋白制备准二维（2D）缠结、交联及液晶状肌动蛋白组装体的方法。...

调控基于肌动蛋白的活性组装体的收缩性与变形模式 体外从二维活性网络到液晶液滴

了解单分子FRET成像技术如何用于研究动力蛋白样GTP酶弹性蛋白在GTP水解循环中的构象动态变化，揭示膜融合机制的关键分子过程。

单分子FRET成像观察动力蛋白样GTP酶Atlastin的构象动力学

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