用于观察动力蛋白样 GTP 酶弹性蛋白构象动力学的单分子 FRET 成像

我们致力于研究细胞内膜的融合机制。在该方案中，我们旨在通过 smFRET 实现内质网膜融合蛋白弹性蛋白在其 GTP 水解循环中的构象动力学。Atlastin 可能以单体或二聚体的形式存在于 GTP 水解循环中。

在单分子实验中，找到合适的蛋白质标记和固定策略具有挑战性，下面介绍了弹性蛋白在整个 GTP 水解循环中的构象动力学。与体 FRET 相比，smFRET 可以准确监测不同核苷酸负载状态下的蛋白质构象，从而直接了解调节分子的行为。我们使用 smFRET 在不同位置策略下完全解析弹性蛋白的 GTP 水解循环。

我们相信，我们的发现将促进研究 GTP 水解蛋白的更多构象动力学，并为稀有生物过程提供新的解释。要清洁盖玻片的表面，请用镊子夹起八个盖玻片，并将它们放入染色罐中。加入 50 毫升丙酮以覆盖盖玻片，并将染色罐放入超声波清洗机中 30 分钟。

用双蒸水冲洗盖玻片 3 次，然后在超声波清洗机中用甲醇清洗。接下来，将食人鱼溶液加入染色罐中，在 95 摄氏度的水浴壶中加热 2 小时。将罐子冷却至室温后，用双蒸水冲洗盖玻片六次。

将甲醇钠溶液加入染色罐中，置超声波清洗机中放置 15 分钟。用水冲洗盖玻片后，将双蒸水加入染色罐中，放入超声波清洗机中 15 分钟。将盖玻片夹在染色罐中，并用氮气干燥。

将干燥的盖玻片转移到另一个染色瓶中，并在 120 摄氏度的干燥箱中烘烤 30 分钟。然后，在干燥器中将罐子冷却至室温。将 47.5 毫升甲醇、2.5 毫升乙酸和 0.5 毫升三乙氧基硅烷加入烧杯中，混合均匀。

将混合物转移到染色瓶中，孵育 10 分钟。在染色槽中用双蒸水冲洗盖玻片 3 次，然后超声处理 5 分钟。用水冲洗盖玻片并如图所示用氮气干燥后，将盖玻片放入直径为 10 厘米的培养皿中。

将 SVA-mPEG 和 SVA-mPEG-生物素以 1:100 的比例溶解在高盐溶液中。将准备好的混合物放在盖玻片上，并用另一个盖玻片盖住。将盖玻片与适当的湿度一起孵育 2 小时或过夜。

修改后，将盖玻片分开，用去离子水冲洗，然后用氮气吹干。小心地将修改后的盖玻片放入 50 毫升试管中。纯化 Rosetta E.coli 细胞中表达的动力蛋白样蛋白弹性蛋白或 ATL 的 GTP 酶结构域后，使用 10 道尔顿离心过滤器将蛋白质缓冲液更换为蛋白质生物素化缓冲液。

对于蛋白质生物素化，将 100 微升 100 毫摩尔 ATP、100 毫摩尔乙酸镁和 500 微摩尔 D-生物素、10 微升 100 微摩尔 BirA 生物素连接酶和 50 微摩尔蛋白质混合，最终体积为 1 毫升。将混合物在 4 摄氏度下孵育过夜。第二天，使用 10 道尔顿截留分子量离心过滤器去除游离 D-生物素。

将 20 μL 生物素化蛋白与 20 μL 15 μmol 链霉亲和素在冰上孵育 20 分钟。使用 SDS-PAGE 检测蛋白质生物素化的效率。将 LD555 和 LD655 荧光团溶解在二甲基亚砜中，至终浓度为 5 毫摩尔。

要制备标记缓冲液，请混合 25 毫摩尔 HEPES、150 毫摩尔氯化钾和 5 毫摩尔氯化镁。使用 10 道尔顿离心过滤器将蛋白质缓冲液更改为标记缓冲液。对于分子内 smFRET 测定，将 ATL1cyto-TK 与 LD555 和 LD655 以 1:1.2:1.2 的比例混合，最终体积为 100 μL。

将混合物在 4 摄氏度下孵育 5 小时。对于分子间 smFRET 检测，将 ATL1cyto-K 与 LD555 以及生物素化的 ATL1cyto-K 与 LD655 在 4 摄氏度下孵育 5 小时。为了准备蛋白质固定室，请小心地用定制的双面胶带粘贴修改后的盖玻片和显微镜载玻片。

安装软管和尖端以形成具有六个通道的微流体室。对于映射校正，将 10 微升 10% 聚苯乙烯颗粒添加到显微镜载玻片上，并用盖玻片覆盖。然后，在全内反射荧光显微镜下，选择包含聚苯乙烯颗粒的视场，并在明场模式下捕获视频。

使用自定义脚本对齐供体和受体通道中同一聚苯乙烯颗粒的中心位置。将地图文件另存为 TXT 文件。对于分子间 smFRET 实验，将 LD555 标记的 ATL1cyto-K 与 LD655 标记的 ATL1cyto-K-生物素以一比一的比例混合，终浓度为 1 毫摩尔的 GTP-γ-S。

将混合物在冰上孵育 1 小时，以使蛋白质二聚化。将 LD555 标记的 ATL1cyto-T 与 LD655 标记的 ATL1cyto-K-生物素以一比一的比例与一毫摩尔的 GTP-γ-S 混合，用于 ATL1cyto-T 和 ATL1cyto-K 分子间 smFRET 实验。将混合物在冰上孵育 1 小时以获得二聚化蛋白质。

然后，对于分子内 smFRET 测定，将 LD555 和 LD655 标记的 ATL1cyto-TK 与 1 毫摩尔 GDP 在冰上孵育 1 小时。对于分子间实验，将每毫升 10 μg 链霉亲和素孵育 10 分钟以固定蛋白质。对于分子内检测，每毫升添加 10 μg 生物素化抗 His 抗体，并孵育 10 分钟以固定蛋白质。

孵育后，将稀释的 ATL1 二聚体添加到通道中的蛋白质中，并使其固定 10 分钟。用孵育缓冲液冲洗通道两次。将苯甲酸和 PCD 以终浓度为 2.5 毫摩尔添加到通道中。

选择 532 纳米激光器作为激发光源。将 EMCCD 相机设置为以 30 毫秒的帧间隔记录数据。以 16 位 TIFF 格式保存录制的动画。

数据采集后，从录制的电影中提取 FRET 轨迹。选择并以 TXT 格式保存 FRET 轨道。从 TXT 文件中提取数据，并使用 MATLAB 中的自制脚本计算 FRET 值。

在 Origin 中通过 GaussAmp 拟合 smFRET 数据，得到分布直方图。