通过活体显微镜观察肠系膜缺血-再灌注损伤后肠系膜小静脉中中性粒细胞胞外诱捕网的形成

特定基因在血栓形成起始和发展中的作用，本研究中，我们探讨内皮细胞PAR1表达在缺血-再灌注损伤中的作用。我们试图明确内皮细胞在缺血后及再灌注期间反应中的影响。迄今为止研究尚不充分的一个重要方面，是明确肠道共生微生物在肠系膜缺血-再灌注损伤中的作用。

为了研究这一问题，我们课题组将活体显微技术与肠系膜缺血-再灌注损伤模型相结合，并进一步联合无菌小鼠模型开展研究。将血栓形成模型应用于转基因小鼠，并结合活体显微技术，此类技术可实现对疾病发生过程中细胞行为的活体动态观察。在活体生物上实施实验模型始终存在挑战，因为实验结果会受到多种因素影响，包括性别、年龄、麻醉处理以及动物福利法规的变化等。

此外，血栓形成的研究始于上个世纪，许多影响因素至今仍未完全阐明。我的研究团队致力于探讨肠道微生物群在血栓形成、动脉粥样硬化、血小板功能及血管生成中的作用。

首先，将已麻醉并剃毛的小鼠仰卧位放置在加热垫上。通过鼻罩将小鼠连接至氧气系统。用手术胶带将小鼠的四肢固定在加热垫上。

进行颈静脉插管时，在气管上方做一横向切口。去除覆盖颈部的皮肤，分离右侧颈静脉。然后使用一根5厘米长的丝线结扎静脉的远端，并用手术镊固定。

在颈静脉下方约两厘米处放置三条丝线，一条靠近远端，两条靠近近端。打外科结，但不要闭合血管。用0.9%氯化钠溶液填充聚乙烯导管。

去除气泡，并将其插入1毫升注射器中。使用剪刀在第二和第三个结之间剪开一个孔，将导管植入颈静脉。抽吸注射器以确认导管中有血液存在。

用丝线结扎以固定静脉中的导管。然后使用医用胶带固定注射器。用终浓度为每毫升0.5毫克的吖啶橙溶液和浓度为5微摩尔的核酸染料分别填充1毫升注射器。

注射50微升SYTOX Orange以标记中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。使用碘伏和酒精交替擦拭消毒小鼠腹部皮肤。然后，用手术刀沿腹白线进行3至5厘米的剖腹切口。

使用两个浸有生理盐水的棉签轻轻将肠管移出腹腔，并选择脂肪覆盖较少的区域。将肠管的小分支置于黑色橡皮泥上，以减少背景信号。通过颈静脉导管注射 50 µL 喹吖因橙，以观察染色的白细胞。

在缺血再灌注前获取肠道的视频。用生理盐水浸湿的敷料包裹肠道并妥善放置。使用小型血管夹闭合肠系膜上动脉。

使用浸有生理盐水的棉签轻轻将肠管推回腹腔内。用7-0缝线缝合腹壁，以防止水分和热量散失。一小时后，拆除缝线。

缺血期结束后，在夹闭区域滴加数滴生理盐水。随后使用动脉夹施加器轻轻取下微血管夹。用生理盐水浸湿的棉签轻轻将肠管再次移出腹腔，并将静脉的小分支置于黑色琼脂上。

注射50微升吖啶橙，并采集静脉缺血后的视频。开启配备长距离聚光镜、单色器、10倍水浸物镜和电荷耦合器件相机的高速宽场荧光显微镜。将曝光时间设置为30毫秒，并选择安装了Alexa Fluor 488和Rhodamine Red滤光片的5B通道，以观察白细胞和中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。

在0.06平方毫米的兴趣区域内定量细胞募集情况。随后，在20秒的观察期内，通过计数保持静止或附着于内皮衬里的白细胞来定量黏附的白细胞。通过白细胞和核酸荧光染料双重标记来鉴定中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。

在经历缺血-再灌注损伤后，野生型和F2r delta EC组的白细胞与缺血肠系膜内皮的黏附均增加，但F2r delta EC组的黏附程度明显较低，提示内皮细胞PAR1在白细胞募集过程中发挥作用。缺血-再灌注损伤后，仅在内皮细胞表达正常水平PAR1的野生型组中观察到中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），表明PAR1在NETosis过程中具有调控作用。