Name: 通过活体显微镜观察肠系膜缺血再灌注损伤后肠系膜小静脉中中性粒细胞细胞外陷阱的可视化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: 了解活体显微镜技术用于观察肠系膜缺血再灌注损伤后中性粒细胞细胞外陷阱的形成过程。该方法结合小鼠模型揭示内皮PAR1在血栓形成中的调控作用。

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C.R. 感谢莱茵兰-普法尔茨州研究倡议（Forschungsinitiative Rheinland-Pfalz）和 ReALity（项目 MORE）、德国联邦教育与研究部（BMBF）未来集群 Cluster4Future CurATime（项目 MicrobAIome；编号 03ZU1202CA）、威廉·桑德基金会（Wilhelm Sander-Stiftung，编号 2022.131.1）以及德国健康研究中心（Deutsche Zentren der Gesundheitsforschung, DZG）创新基金&#34;Microbiome&#34;（编号 81X2210129）的资助。C.R. 是德国心血管研究中心（DZHK）的科学家，同时也是美因茨约翰内斯·古腾堡大学（Johannes Gutenberg-University Mainz）转化血管生物学中心（CTVB）、免疫治疗研究中心（FZI）以及 EXPOHEALTH 潜力领域成员。C.R. 是德国研究基金会（DFG）研究小组 5644 INFINITE（项目编号 RE 3450/15-1）的成员，并曾获得美因茨约翰内斯·古腾堡大学哥特堡研究学院（Gutenberg Research College）颁发的研究奖学金。K.K. 受 DZHK &#34;女性科学家促进&#34;卓越计划的支持，同时也是青年 DZHK（Young DZHK）成员。Z.G 和 O.D. 为美因茨转化生物医学研究生院（TransMed）的博士研究生。

所有涉及小鼠的操作均经当地动物实验法规委员会批准（Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz，Koblenz，德国；G21-1-041）。实验使用6至8周龄的雄性和雌性B6.FVB-F2rtm1a(EUCOMM) Tg/Cdh5-cre)7Mlia/Tarc小鼠。内皮细胞特异性调控的 F2r (PAR1) 发生 通过 VE-钙黏蛋白 Cre 启动子28. 在本研究中，flox-F2r x VE-钙粘蛋白 Cre+ (F2RΔEC)&#160;表现出减少 F2r 内皮细胞上的（PAR1）表达，&#160;和 flox-F2r x VE-钙粘蛋白 Cre- （野生型）表达正常内皮 F2r (PAR1) 水平。本研究中所用试剂和设备的详细信息列于下文 材料表.
1. 手术准备
<ol>
	<li>将必要的手术器械（超细直剪、镊子、血管夹等）进行灭菌处理。</li>
	<li>准备好基于氧气和异氟烷的麻醉系统，配备鼻罩和加热板。</li>
</ol>
2. 动物准备
<ol>
	<li>称量动物体重。</li>
	<li>实施麻醉：对小鼠进行麻醉 通过 按照机构批准的方案，腹腔（i.p.）注射含咪达唑仑（5 mg/kg）、美托咪定（0.5 mg/mL）和芬太尼（0.5 mg/kg）的溶液。</li>
	<li>使用小型动物专用电动剃毛器去除颈部和腹部手术区域的毛发。</li>
	<li>将小鼠置于加热垫上呈仰卧位，并连接至氧气系统 通过 鼻锥。固定小鼠的四肢&#160;用手术胶带将小鼠固定在加热垫上。确保乳胶鼻罩膜紧密贴合小鼠头部。使用专用于啮齿类动物的体温计经直肠监测动物体温。</li>
	<li>在颈部手术区域涂抹脱毛膏以去除残留毛发，并用70%乙醇擦拭手术区域皮肤。</li>
	<li>通过脚趾捏压测试（足底反射）确认动物已完全麻醉。</li>
</ol>
3. 手术步骤
<ol>
	<li>颈静脉导管植入
	<ol>
		<li>在气管上方做一横向切口（约0.5 cm），去除覆盖颈部的皮肤，并分离右侧颈静脉。</li>
		<li>使用约5 cm的丝线结扎静脉远端，并用手术镊固定。在静脉下方约2 cm处放置三条丝线：一条靠近颈静脉远端，两条靠近近端。打外科结，但不要闭合血管。</li>
		<li>准备一根充满0.9% NaCl并用1 mL注射器封堵的聚乙烯导管（内径0.28 mm，外径0.61 mm）。使用剪刀在第二和第三个结扎结之间剪开一个切口，将导管插入颈静脉。回抽注射器，确认导管内有血液进入。</li>
		<li>用丝线结扎固定静脉内的导管，确保牢固。使用医用胶带固定注射器。</li>
		<li>制备吖啶橙：将2 mg/mL的储备液用无菌生理盐水稀释4倍（终浓度为0.5 mg/mL），置于1 mL注射器中。避光保存，并向小鼠注射50 µL。</li>
		<li>制备核酸染料：将5 mM储存液用无菌生理盐水稀释1000倍（终浓度为5 µM），加入1 mL注射器中。将注射器避光保存，并向小鼠注射50 µL。</li>
		<li>体内注射吖啶橙（50 µg/µL，每只小鼠50 µL） 通过 通过颈静脉导管注入染色的白细胞和一种细胞外DNA荧光染料，以类似方法标记中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）（5 µM，每只小鼠50 µL）。NETs与白细胞同时成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肠系膜缺血-再灌注损伤模型
	<ol>
		<li>用70%乙醇对腹部皮肤进行消毒。</li>
		<li>沿腹部进行3-5厘米的剖腹手术 白线 使用手术剪。</li>
		<li>使用两个浸有生理盐水的棉签，轻轻移除肠道并找到脂肪覆盖较少的区域。将小肠分支置于黑色面团上，以降低背景信号。</li>
		<li>在缺血/再灌注（I/R）前获取视频（缺血前）。</li>
		<li>用氯化钠制备湿敷压缩物，并将肠管置于其中。确保&#160;在步骤5.6中，肠道应被敷料包裹并保持湿润。</li>
		<li>用小型血管夹夹闭肠系膜上动脉。</li>
		<li>使用浸有生理盐水的棉签轻轻将肠管推回腹腔，并用7-0缝线缝合腹壁，以防止水分和热量丢失。维持缺血状态60分钟，每20分钟至少检查一次麻醉深度。</li>
		<li>1小时后，通过移除夹子开始再灌注。 
		注意：正确执行缺血操作后会出现可见变化。最初，由于血流中断，受影响区域会呈现苍白或白色。移除血管夹后，血液将逐渐重新流入缺血区域，组织颜色随之恢复至正常，表明阻塞成功。在缺血阶段，必须持续密切观察小鼠状态。</li>
		<li>缺血期结束后，在夹闭区域滴加少量生理盐水，然后使用动脉夹施加器轻轻移除微血管夹。</li>
		<li>使用生理盐水湿润的棉签轻轻再次移除肠管，将静脉的小分支置于黑色琼脂上，再次注入50 µL吖啶橙，并在同一位置（缺血后）采集同一静脉的视频。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 活体高速视频落射荧光显微镜技术
<ol>
	<li>使用配备长距离聚光镜、单色器、10倍水浸物镜和电荷耦合器件相机的高速宽场荧光显微镜观察白细胞和中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。图像采集的曝光时间为30 ms，使用Alexa Fluor 488（495/519）和Rhodamine Red（570/590）滤光片。</li>
	<li>使用成像软件进行图像采集与分析。</li>
	<li>在0.06 mm²的兴趣区域内定量细胞募集情况。</li>
	<li>将黏附的白细胞定义为在20秒观察期间保持静止或附着于血管内皮表面的细胞，并对其进行定量。</li>
	<li>通过白细胞标记物与细胞外核酸荧光染料双重标记的细胞外结构来识别NETs。</li>
	<li>实验结束后，按照机构批准的方案，通过颈椎脱位法处死动物。</li>
</ol>
5. 肝脏内皮细胞（LEC）的分离与定量 RT-PCR
<ol>
	<li>分离 LEC 通过 磁性细胞分选（MACS）29.</li>
	<li>提取总RNA。</li>
	<li>进行互补DNA（cDNA）合成27 将 2 µg 总 RNA 与 2 µL RT 缓冲液、0.8 µL dNTP 混合物、2 µL RT 随机引物、1 µL 逆转录酶以及 4.2 µL 无菌蒸馏水混合2O.</li>
	<li>cDNA 转录按以下条件进行：25 °C 反应 10 分钟，37 °C 反应 120 分钟，85 °C 反应 5 分钟。</li>
	<li>使用20 ng cDNA进行qPCR。</li>
	<li>使用以下引物： F2r （正向）：TGAACCCCCGCTCATTCTTTC， F2r （反向）：CCAGCAGGACGCTTTCATTTTT， L32 （正向）：CCTCTGGTGAAGCCCAAGATC， L32 （反向引物）：TCTGGGTTTCCGCCAGTTT。使用以下条件：95 °C 预变性 30 秒，45 个循环（95 °C 变性 10 秒，60 °C 退火 25 秒），然后从 60 °C 升至 95 °C，每步 6 秒，温度增量（ΔΤ）为 1 °C。</li>
</ol>

Endothelial PAR1 Role in Leukocyte Adhesion and NET Formation During I/R Injury

作者声明不存在利益冲突。

肠系膜缺血-再灌注损伤联合活体显微镜技术应用于一种遗传性小鼠模型 F2r 内皮细胞中（PAR1）的缺乏 体内 缺血1小时后白细胞和中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的分析。肠系膜缺血/再灌注（I/R）损伤模型在啮齿类动物中常用，缺血和再灌注时间从数分钟至数小时不等23,31，影响炎症反应的结果32 和死亡率33该模型还依赖于多种因素，包括微生物群19,34，免疫受体10,35,36,37性别38,39和年龄35除了缺血/再灌注时间的不同之外，该模型的另一个变量是肠道不同部位对损伤的差异性反应，其中小肠的黏膜损伤较结肠更为严重40微血管夹的位置会影响缺血区域，这对方法的可重复性至关重要32,33重要的是，肠系膜上动脉闭塞联合侧支血流阻断所导致的死亡率与缺血持续时间呈稳定的相关性41.
在本研究中，小鼠经历了1小时的缺血， 体内 再灌注后立即观察白细胞黏附和中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的形成，以检测缺血状态下在缺乏内皮细胞的情况下所触发的早期炎症反应 F2r 表达。将这些方法应用于基因工程小鼠模型，可研究特定靶分子在缺血后及再灌注期间对细胞行为和炎症反应的影响。
该实验方案中有多个关键步骤，包括维持肠道完整性。操作肠道时必须轻柔，以避免组织损伤。为此，湿润的棉签是暂时将肠道从腹腔中分离的合适工具。在肠道重新放回腹腔之前，必须始终保持其湿润。轻微的操作损伤可能激活多种细胞类型（如血小板和内皮细胞），从而影响实验结果。
为了保持一致性，必须在缺血前后观察肠道节段的相同部位。由于缺血后肠道在腹腔内的位置可能发生改变，这一步骤具有挑战性。为解决此问题，可在缺血前观察过的肠段部位放置一小块湿润纱布作为标记。
可视化白细胞滚动、黏附及中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的形成 体内通过颈静脉向小鼠注射白细胞荧光染料和核酸荧光染料。白细胞染料（见材料表）是一种可穿透细胞的异色性荧光染料，能够结合白细胞而不会结合红细胞，已广泛用于白细胞染色。 体内17,42染料通过静脉注射应用，可在数秒内实现强烈的白细胞染色。然而，其特异性存在一定局限，因为也会对其他有核细胞（如内皮细胞）进行染色。尽管如此，由于洗脱效应，循环中的细胞能够更长时间地保留染色43. 核酸荧光染料（参见 材料表是一种不可穿透细胞的核酸染料，常用于观察中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的形成30,44,45也可通过静脉注射给药，具有高亲和力，使用快速简便。然而，其特异性仍是不足之处，因为该染料会与任何细胞膜不完整的细胞结合。理想情况下，应将其与中性粒细胞标记物（如 CD15、CD11b）或 NETosis 标记物（如抗 citH3 抗体）联合使用，以提高特异性。这些染料能够 体内 实验室动物肠系膜小静脉中白细胞的成像
该技术的主要局限在于内脏脂肪的存在，其会阻碍肠毛细血管的可视化，并显著影响图像采集。为避免这一问题，有必要使用内脏脂肪较少的年轻实验动物（6–8 周龄）。此外， 离体 组织学分析因使用 体内 染色。另一个局限性在于肠道微生物群和饮食对该模型的影响，这种影响在不同小鼠饲养环境中可能存在显著差异46为解决这一局限性，可考虑采用无菌小鼠模型进行研究10.
本研究探讨了缺血后细胞的即时反应，观察到白细胞在活化的肠系膜内皮上的沉积减少以及体内中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的形成减少。in vivo。缺血后1小时静脉注射DNase降解NET，可减轻早期促炎反应，并改善肠道屏障的破坏47。值得注意的是，使用血栓调节蛋白（thrombomodulin）——一种可抑制凝血酶活性的跨膜糖蛋白48——治疗，可提高严重肠缺血/再灌注（I/R）损伤小鼠的存活率，减轻内皮功能障碍引发的炎症反应，并减少远端器官中组蛋白的大量积聚49。本研究显示，内皮细胞上的凝血酶受体可影响I/R损伤的结局，突显了将肠I/R损伤模型与基因工程小鼠的活体显微技术相结合，以研究疾病病理过程中关键介质的重要性。

急性肠系膜缺血（AMI）是一种罕见的病理状态1，具有较高的死亡风险2，其特征是由于腹腔干、肠系膜上动脉或肠系膜下动脉内形成血栓，导致肠系膜血流减少。在60%–70%的病例中，肠系膜上动脉因血栓形成或栓塞引起的急性闭塞是导致急性肠缺血的主要原因3。相比之下，在5%–15%的病例中，肠系膜静脉血栓形成可导致肠系膜缺血，主要累及肠系膜上静脉，较少累及肠系膜下静脉4。缺血引起的缺氧和营养不良会导致细胞水平的能量代谢紊乱5。例如，线粒体功能受损会激活多种信号通路，启动细胞死亡机制6。尽管快速再灌注能够恢复有氧代谢，但血流恢复到缺血区域时常因活性氧（ROS）的产生7、钙超载8、内皮功能障碍9以及炎症反应10而导致广泛的组织损伤。
已建立多种采用暂时性肠系膜上动脉阻断的实验动物模型，以阐明缺血-再灌注（I/R）损伤过程中的分子机制11。将此类模型与活体显微技术（IVM）结合使用，对于深入了解细胞间相互作用及疾病进展至关重要11。肠道屏障功能障碍在缺血后很快出现12，表现为上皮完整性丧失13，导致细菌易位至肠外部位，如肠系膜淋巴结、脾脏、肝脏和肾脏12,14。再灌注会进一步加重黏膜损伤15。小动脉中的炎症反应表现为白细胞在内皮细胞层上的滚动和牢固黏附，这一过程依赖于L-选择素16、P-选择素（CD62P）17、血小板GPIIb/IIIa和纤维蛋白原等分子18。有趣的是，白细胞在肠系膜微静脉中的黏附受到肠道微生物群19和Toll样受体4信号通路10的影响。I/R损伤还可触发中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的形成10。靶向来源于活化中性粒细胞等白细胞的胞外DNA可改善肠道I/R损伤的预后20。在肝脏中，I/R损伤由定居的巨噬细胞引发21，而微小RNA的抑制可显著减轻细胞凋亡22。值得注意的是，肠系膜I/R损伤会导致肠道菌群失调，这种失调是可逆的，在血管再通后可恢复正常23。
内皮细胞也受到缺血/再灌注（I/R）损伤有害作用的影响，其中活性氧（ROS）在该过程中起关键作用24。可观察到白细胞黏附于内皮细胞层、内皮损伤以及一氧化氮（NO）代谢的改变9。然而，所涉及的分子通路尚未被充分研究。
蛋白酶激活受体1（PAR1，F2r）是一种由多种细胞（包括内皮细胞）表达的膜受体，在炎症条件下被激活25。当丝氨酸蛋白酶在受体的N端将其切割时，暴露出连接的配体，该配体继而通过与分子的第二个胞外环结合来激活受体26。内皮蛋白C受体（EPCR）-PAR1信号通路影响内皮一氧化氮（NO）的稳态，并促进外周缺血时血流的恢复27。
本研究将缺血/再灌注（I/R）损伤应用于内皮细胞特异性PAR1缺陷的遗传性小鼠模型，以观察白细胞滚动、黏附及中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的形成。结合遗传性小鼠模型与I/R显微手术后的活体显微成像技术，可深入揭示疾病进展中所涉及的特定细胞类型。将I/R损伤应用于遗传性小鼠模型，有助于识别潜在的治疗靶点，从而改善疾病的进程。此外，研究还证实了内皮细胞PAR1在NETosis过程中的重要作用。

<table><tbody><tr><td>吖啶橙</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;A-6014</td><td></td></tr><tr><td>96孔PCR板&amp;nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>721977202.00</td><td></td></tr><tr><td>啮齿类动物麻醉系统</td><td>GROPPLER medizintechnik</td><td>Uni Vet -Porta T-8</td><td></td></tr><tr><td>注射用水 IVM</td><td>B Braun Melsungen</td><td>53402101</td><td></td></tr><tr><td>黑色橡皮泥</td><td>Staedtler</td><td></td><td>油灰</td></tr><tr><td>CD146微珠，小鼠</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-007</td><td></td></tr><tr><td>cellSens</td><td>Olympus</td><td>Olympus cellSense Dimension Desktop 2.3</td><td>软件</td></tr><tr><td>电荷耦合器件相机</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>ORCA-R2</td><td>相机</td></tr><tr><td>棉签</td><td>B&amp;ouml;ttger</td><td>09-119-9100</td><td></td></tr><tr><td>弯止血钳 125mm/5&quot;</td><td>Indigo Instruments&amp;nbsp;</td><td>22466</td><td></td></tr><tr><td>脱毛膏</td><td>Balea</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>Dorbene Vet</td><td>zoetis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>乙醇 p.a. 99.5%</td><td>Roth</td><td>5504.20</td><td></td></tr><tr><td>超细剪刀 &amp;ndash; 直头/锐-锐/10.5</td><td>FST</td><td>14088-10</td><td></td></tr><tr><td>芬太尼</td><td>Janssen-Cilag GmBH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>镊子 &quot;Dumont #5&quot;（不锈钢，尖端0.1 mm，长度11 cm）</td><td>FST</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS C管</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism</td><td>Graphpad</td><td>Prism 10</td><td>软件</td></tr><tr><td>异氟烷&amp;nbsp;</td><td>Piramal</td><td>4150097146757.00</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix 10x5ml</td><td>BioRad</td><td>1725125.00</td><td></td></tr><tr><td>Leukofix医用胶带</td><td>BSNMedical</td><td>0213600</td><td></td></tr><tr><td>肝脏解离试剂盒，小鼠</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-105-807</td><td></td></tr><tr><td>LS分离柱 MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS Smart筛网 100 &amp;micro;m</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-463</td><td></td></tr><tr><td>Microseal B密封膜</td><td>Biorad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>咪达唑仑</td><td>hameln</td><td>5918501.00</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Braun</td><td>2350748</td><td></td></tr><tr><td>持针器</td><td>FST</td><td>12001-13</td><td></td></tr><tr><td>不可吸收编织丝线，规格：7/0，91米&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-70</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX51WI荧光显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td>显微镜</td></tr><tr><td>PCR管条</td><td>Sarstedt</td><td>72985002.00</td><td></td></tr><tr><td>PCR管盖</td><td>Sarstedt</td><td>65989002.00</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯导管</td><td>Smith Medical Deutschland GmbH</td><td>800/100/100</td><td></td></tr><tr><td>Prolene (8648G)，聚丙烯 6-0，缝合材料&amp;nbsp;</td><td>Johnson &amp;amp; Johnson Medical GmbH&amp;nbsp;</td><td>8695H</td><td></td></tr><tr><td>Relia Prep RNA微量提取系统</td><td>Promega</td><td>Z6112</td><td></td></tr><tr><td>逆转录试剂盒（高容量cDNA）</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368813.00</td><td></td></tr><tr><td>实验室天平&amp;nbsp;</td><td>KERN &amp;amp; SOHN GmbH</td><td>EMB 500-1</td><td></td></tr><tr><td>弹簧剪 - 侧向倾斜</td><td>FST</td><td>15006-09</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica</td><td>M50</td><td></td></tr><tr><td>直止血钳 135mm/5.5&quot;</td><td>Indigo Instruments&amp;nbsp;</td><td>22468</td><td></td></tr><tr><td>1 mL注射器</td><td>Braun</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Orange</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>温度控制器 TC-1000</td><td>FMI F&amp;ouml;hr Medical Instruments GmbH</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>组织镊 - 1x2齿</td><td>FST</td><td>18057-14</td><td></td></tr><tr><td>血管夹</td><td>Fine Science Tools</td><td>18055-02</td><td></td></tr><tr><td>Vetiva mini</td><td>WAHL</td><td>1584-0480</td><td></td></tr></tbody></table>

通过活体显微镜观察肠系膜缺血-再灌注损伤后肠系膜小静脉中中性粒细胞胞外诱捕网的形成

Visualization of Neutrophil Extracellular Traps in Mesenteric Venules After Mesenteric Ischemia-Reperfusion Injury via Intravital Microscopy

肠缺血-再灌注（I/R）损伤是一种急性病症，其特征是由于肠系膜血管血流受限导致组织损伤，进而引发局部和全身性病理改变，预后较差。缺血和再灌注两个阶段均可触发一系列细胞和分子反应，其中炎症细胞在病理过程中起关键调控作用。这些细胞与缺血内皮之间的相互作用由多种黏附受体介导。已有多种动物模型被建立用于模拟该病理过程，并研究其中涉及的分子通路。本研究结合了一种显微外科I/R损伤模型与活体显微技术，用于观察白细胞滚动、黏附以及中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的形成。该模型应用于内皮细胞PAR1缺陷型转基因小鼠（F2r），以评估PAR1在缺血后1小时及再灌注即刻对白细胞滚动和NET形成的影响。体内实验中采用吖啶橙对白细胞进行染色，并使用核酸染料对NETs进行可视化观察。有趣的是，在缺乏内皮PAR1受体的小鼠中，白细胞黏附和NET形成均有所减少。该模型可用于对I/R损伤中关键调控因子的体内分析。

为了研究内皮细胞依赖性对白细胞滚动和黏附以及中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成的影响，首先检测了在内皮细胞中诱导型 VE-Cadherin Cre 介导的 F2r 基因缺失的有效性。采用磁性细胞分选法分离肝脏内皮细胞，随后提取 RNA 并进行定量实时荧光 PCR（qRT-PCR）。在 Cre 重组酶受 VE-Cadherin 启动子调控而缺失的 F2rΔEC 小鼠中，F2r（PAR1）mRNA 水平较野生型（WT）对照组显著降低（约减少三分之一）（图 1）。
在确认小鼠品系的基因缺陷后，进行肠系膜缺血/再灌注（I/R）损伤实验，以检测血管内皮细胞表达的PAR1对白细胞滚动和黏附的影响，并通过活体显微镜进行观察（图2A，B）。在经历1小时缺血后，移除夹闭血管的夹子，使血管恢复灌注。随后观察并记录白细胞的滚动和黏附情况（染成绿色，由白色箭头指示）。尽管两组小鼠在I/R损伤后黏附的白细胞数量均有所增加，但内皮细胞F2r（PAR1）缺陷导致白细胞黏附至I/R激活的肠系膜内皮的程度明显降低，尽管差异未达到统计学显著性，提示内皮PAR1的激活在白细胞募集至缺血性肠系膜微静脉过程中发挥积极作用（图2C）。
下一个目标是检测内皮细胞 PAR1 表达是否调控缺血/再灌注损伤诱导的中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成。因此，使用细胞非渗透性染料对细胞外核酸进行染色30，并使用活体显微镜观察生成的NETs（以黑色箭头指示）(图2A，B）。在I/R损伤后，仅在内皮细胞表达正常水平PAR1的WT组中观察到NETs，表明PAR1在NETosis过程中具有调控作用（图2C，D）。值得注意的是，当内皮细胞 F2r 表达被抑制后，缺血/再灌注损伤的肠系膜小静脉中未见中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。
<img alt="F2r mRNA 表达图；WT 与 F2rΔEC，相对于 L32；已标注统计学显著性。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67264/67264fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：F2r（PAR1）mRNA 表达水平。野生型（WT，n = 6）和 F2rΔEC（n = 9）小鼠肝脏内皮细胞中 F2r 相对于管家基因 L32 的表达水平。数据以中位数及 95% 置信区间表示。采用 Mann-Whitney 检验比较两个独立组别，*p &lt; 0.05。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67264/67264fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="白细胞黏附、NETosis的显微镜图像及WT、F2rΔEC在暴露前后的柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67264/67264fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：内皮细胞PAR1影响肠系膜微静脉在缺血/再灌注（I/R）损伤后白细胞的黏附及中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的形成。 显示野生型（WT）和F2rΔEC小鼠在I/R损伤前（pre）和损伤后（post）黏附的白细胞（用吖啶橙染色，白色箭头所示）以及NETs（用Sytox Orange染色，黑色箭头所示）的代表性活体显微图像，(A) 10倍放大和(B) 20倍放大。比例尺：A，50 µm；B，20 µm。(C) WT（n = 7）和F2rΔEC（n = 4）小鼠在I/R损伤前后每mm2面积内的白细胞黏附数量，以及(D) NETs数量。所有数据均以中位数及95%置信区间表示。统计分析采用双因素方差分析（Two-way ANOVA）检验，*p&lt; 0.01，并使用Sídák多重比较检验对各时间点（缺血前和缺血后）不同基因型的均值进行比较。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67264/67264fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

本方案介绍了一种通过活体显微镜诱导肠系膜缺血-再灌注损伤并可视化观察肠系膜微静脉中中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的方法。通过阻断肠系膜上动脉血流1小时后进行再灌注，可直接定量分析白细胞黏附和NETosis过程。

肠缺血-再灌注（I/R）损伤是一种急性病症，其特征是由于肠系膜血流受限导致组织损伤……

特定基因在血栓形成起始和发展中的作用，本研究中，我们探讨内皮细胞PAR1表达在缺血-再灌注损伤中的作用。我们试图明确内皮细胞在缺血后及再灌注期间反应中的影响。迄今为止研究尚不充分的一个重要方面，是明确肠道共生微生物在肠系膜缺血-再灌注损伤中的作用。为了研究这一问题，我们课题组将活体显微技术与肠系膜缺血-再灌注损伤模型相结合，并进一步联合无菌小鼠模型开展研究。将血栓形成模型应用于转基因小鼠，并结合活体显微技术，此类技术可实现对疾病发生过程中细胞行为的活体动态观察。在活体生物上实施实验模型始终存在挑战，因为实验结果会受到多种因素影响，包括性别、年龄、麻醉处理以及动物福利法规的变化等。此外，血栓形成的研究始于上个世纪，许多影响因素至今仍未完全阐明。我的研究团队致力于探讨肠道微生物群在血栓形成、动脉粥样硬化、血小板功能及血管生成中的作用。首先，将已麻醉并剃毛的小鼠仰卧位放置在加热垫上。通过鼻罩将小鼠连接至氧气系统。用手术胶带将小鼠的四肢固定在加热垫上。进行颈静脉插管时，在气管上方做一横向切口。去除覆盖颈部的皮肤，分离右侧颈静脉。然后使用一根5厘米长的丝线结扎静脉的远端，并用手术镊固定。在颈静脉下方约两厘米处放置三条丝线，一条靠近远端，两条靠近近端。打外科结，但不要闭合血管。用0.9%氯化钠溶液填充聚乙烯导管。去除气泡，并将其插入1毫升注射器中。使用剪刀在第二和第三个结之间剪开一个孔，将导管植入颈静脉。抽吸注射器以确认导管中有血液存在。用丝线结扎以固定静脉中的导管。然后使用医用胶带固定注射器。用终浓度为每毫升0.5毫克的吖啶橙溶液和浓度为5微摩尔的核酸染料分别填充1毫升注射器。注射50微升SYTOX Orange以标记中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。使用碘伏和酒精交替擦拭消毒小鼠腹部皮肤。然后，用手术刀沿腹白线进行3至5厘米的剖腹切口。使用两个浸有生理盐水的棉签轻轻将肠管移出腹腔，并选择脂肪覆盖较少的区域。将肠管的小分支置于黑色橡皮泥上，以减少背景信号。通过颈静脉导管注射 50 µL 喹吖因橙，以观察染色的白细胞。在缺血再灌注前获取肠道的视频。用生理盐水浸湿的敷料包裹肠道并妥善放置。使用小型血管夹闭合肠系膜上动脉。使用浸有生理盐水的棉签轻轻将肠管推回腹腔内。用7-0缝线缝合腹壁，以防止水分和热量散失。一小时后，拆除缝线。缺血期结束后，在夹闭区域滴加数滴生理盐水。随后使用动脉夹施加器轻轻取下微血管夹。用生理盐水浸湿的棉签轻轻将肠管再次移出腹腔，并将静脉的小分支置于黑色琼脂上。注射50微升吖啶橙，并采集静脉缺血后的视频。开启配备长距离聚光镜、单色器、10倍水浸物镜和电荷耦合器件相机的高速宽场荧光显微镜。将曝光时间设置为30毫秒，并选择安装了Alexa Fluor 488和Rhodamine Red滤光片的5B通道，以观察白细胞和中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。在0.06平方毫米的兴趣区域内定量细胞募集情况。随后，在20秒的观察期内，通过计数保持静止或附着于内皮衬里的白细胞来定量黏附的白细胞。通过白细胞和核酸荧光染料双重标记来鉴定中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。在经历缺血-再灌注损伤后，野生型和F2r delta EC组的白细胞与缺血肠系膜内皮的黏附均增加，但F2r delta EC组的黏附程度明显较低，提示内皮细胞PAR1在白细胞募集过程中发挥作用。缺血-再灌注损伤后，仅在内皮细胞表达正常水平PAR1的野生型组中观察到中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），表明PAR1在NETosis过程中具有调控作用。

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通过活体显微镜观察肠系膜缺血再灌注损伤后肠系膜小静脉中中性粒细胞细胞外陷阱的可视化

中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）是一种重要的先天免疫机制，可抵御致病性细菌、真菌和寄生虫。本文描述了从人血液中分离中性粒细胞并激活其形成NETs的方法。我们还介绍了在光学显微镜和电子显微镜下观察NETs的制备技术。...

中性粒细胞胞外诱捕网：如何产生并可视化观察

我们描述了一种用于在中性粒细胞趋化因子刺激下，中性粒细胞募集过程中动态测量中性粒细胞与内皮细胞相互作用的明场活体显微镜技术方案。...

通过活体视频显微镜追踪中性粒细胞在组织内的管腔内爬行、跨内皮迁移及趋化运动

本视频展示了利用含有抗中性粒细胞胞质抗体的患者血清，在预标记的中性粒细胞中诱导并可视化中性粒细胞胞外陷阱（NETs）的方法。此外，通过使用不可穿透细胞膜的DNA染料结合荧光显微镜，可实现对NETs的可视化观察。...

预标记中性粒细胞中中性粒细胞胞外诱捕网的诱导与可视化

本文报道了一种荧光活体显微技术，用于在活体小鼠的血管炎症和血栓形成过程中，可视化活化内皮上血小板与中性粒细胞之间的异型相互作用。该显微技术将有助于研究血管疾病的分子机制，并可在病理生理条件下评估药理学试剂的作用。...

活体小鼠血管炎症和血栓形成过程中活化内皮上血小板-中性粒细胞异型相互作用的实时成像

这种简化的小鼠肠系膜静脉活体显微成像方法可用于多种炎症模型，以观察白细胞-内皮细胞以及血小板-白细胞之间的相互作用。...

小鼠肠系膜静脉中白细胞-内皮及血小板-白细胞相互作用的活体显微成像

我们详细介绍了一种利用活体共聚焦显微镜在麻醉小鼠的肠系膜静脉中监测中性粒细胞和单核细胞在稳态及炎症条件下行为的实验方案。...

通过活体显微镜实时成像麻醉小鼠肠系膜静脉中的中性粒细胞和单核细胞

本方案描述了利用磁夹钳在小鼠耳部皮肤上建立缺血-再灌注（IR）模型的方法。通过使用自行构建的活体成像模型，我们开展研究 体内...

在小鼠耳部皮肤诱导缺血-再灌注损伤以进行活体多光子成像观察免疫反应

单核细胞在周围动脉疾病背景下对动脉生成具有重要的介导作用。本方案利用基底膜样基质和活体显微技术，在股动脉结扎小鼠模型中研究单核细胞注射后的单核细胞归巢及肿瘤相关血管生成。...

小鼠外周动脉疾病模型中单核细胞归巢与肿瘤相关血管生成的活体显微成像

中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）是由活化的中性粒细胞释放的三维结构。近年来的研究已明确，NETs 参与多种疾病的病理过程。在组织中检测 NETs 可能具有诊断价值，因此需要标准化的标记 NET...

石蜡包埋组织中人和小鼠中性粒细胞胞外诱捕网的免疫荧光标记

我们描述了一种方法，利用热诱导抗原修复和双重免疫标记方案，在甲醛固定和石蜡包埋的猫心源性动脉血栓中鉴定中性粒细胞胞外陷阱（NETs）。...

利用免疫荧光显微镜鉴定石蜡包埋的猫动脉血栓中的中性粒细胞胞外诱捕网

中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）与多种疾病相关，通常使用免疫荧光法对其进行可视化观察。然而，目前存在多种染色方案，且多数情况下仅针对单一类型的组织进行检测。本文中，我们建立了一种适用于小鼠和人类组织中NETs染色的通用方案。...

人和小鼠组织中中性粒细胞胞外诱捕网的免疫荧光成像

了解活体显微镜技术用于观察肠系膜缺血再灌注损伤后中性粒细胞细胞外陷阱的形成过程。该方法结合小鼠模型揭示内皮PAR1在血栓形成中的调控作用。

通过活体显微镜观察肠系膜缺血-再灌注损伤后肠系膜小静脉中中性粒细胞胞外诱捕网的形成

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