Name: 机械稳定的自组装肽水凝胶的制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 24 s
Description: 学习利用环境响应条件制备机械稳定的自组装肽水凝胶的方法。本方案展示ECF-5肽的pH响应、金属离子诱导及溶剂交换等成胶技术，适用于生物医学工程与生物材料领域的功能化应用研究。

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本研究由国家自然科学基金（编号：11674344 和 22201026）以及中国科学院前沿科学重点研究计划（项目编号：QYZDJ-SSW-SLH019）资助。

本研究中使用的质粒、试剂和设备的详细信息列在材料表中。
1. pH 响应法
<ol>
	<li>将5 mg ECF-5肽加入400 µL去离子水中。在40 kHz条件下超声处理30分钟，并充分混匀。</li>
	<li>向肽溶液中加入40 µL氢氧化钠溶液（1 M，经0.22 µm滤膜过滤）。涡旋振荡并充分混匀。继续超声处理15分钟，直至溶液完全澄清。</li>
	<li>加入60 µL盐酸。迅速涡旋并确保充分混匀。将混合物在室温下静置超过30分钟，以促进水凝胶形成。 
	注意：如需使用，可用所需缓冲液替代去离子水。若固体颗粒较大，应预先研磨粉碎。通过超声处理使液体中的颗粒混合均匀。若肽对碱性条件敏感，可先加入1 M盐酸溶液，并重复上述步骤。根据需要调整酸和碱的用量，使pH接近等电点或目标pH值，同时确保保留其凝胶形成特性。</li>
</ol>
2. 金属离子添加法
<ol>
	<li>材料的制备
	<ol>
		<li>配制 pH 7.4 的 0.15 M Tris 和 0.1 M NaCl 缓冲液。经 0.22 µm 滤膜过滤后，4 °C 下保存，可保存一周。</li>
		<li>使用步骤 1.1.1 中配制的缓冲液配制浓度为 10 mg/mL 的 ECF-5 自组装多肽溶液。通过超声处理使其溶解，并在 4 °C 下保存。</li>
		<li>使用去离子水配制 50 mg/mL 的氯化钙溶液。在 4 °C 下保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>金属离子诱导多肽水凝胶的形成
	<ol>
		<li>将 40 µL 氯化钙溶液加入 460 µL ECF-5 多肽溶液中。涡旋振荡并充分混匀。室温下静置超过 2 小时。 
		注意：避免使用磷酸盐缓冲液，因其可能导致钙离子沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 溶剂交换法
<ol>
	<li>材料准备
	<ol>
		<li>称取10 mg ECF-5肽冻干粉，加入100 µL DMSO中，通过超声充分混匀，于4 °C保存。</li>
		<li>配制10 mM PBS缓冲液，过滤除菌，于4 °C保存，并在1周内使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>溶剂诱导肽水凝胶形成
	<ol>
		<li>将1 mL PBS迅速加入DMSO溶解的肽溶液中，涡旋并充分混匀，室温静置5分钟。</li>
		<li>加入500 µL PBS，静置15分钟，弃去上清液，保留底部凝胶。重复此步骤三次以去除DMSO。 
		注意：若DMSO影响后续实验，可考虑将肽溶解于更高浓度的DMSO中，以减少其影响。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 水凝胶的流变力学表征
<ol>
	<li>流变学分析
	<ol>
		<li>将水凝胶舀取至25 mm铝制平行板上。使用流变仪对多肽水凝胶进行动态时间扫描流变学分析18。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>频率扫描与应变扫描分析
	<ol>
		<li>采用0.3%的控制应变和10 rad/s的频率，系统地进行频率扫描和应变扫描分析18。确保温度控制在25 °C。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 纤维形貌的原子力显微镜（AFM）表征
<ol>
	<li>材料准备
	<ol>
		<li>配制95%乙醇溶液，并加入5% APTES。于-20 °C保存，一个月内使用完毕。</li>
		<li>使用双面胶剥离云母片层。用APTES溶液将云母表面粘附固定，静置5分钟。使用前用纯水充分冲洗。</li>
		<li>将水凝胶稀释并充分混匀，滴加至修饰后的云母表面，静置吸附5分钟。用纯水冲洗表面后干燥，备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检测方法
	<ol>
		<li>采用配备扫描器的多模式原子力显微镜（AFM）观察肽纤维或水凝胶的形貌。使用标称弹性常数为48 N/m的硅悬臂梁探针。</li>
		<li>启动仪器并定位探针。选择轻敲模式对样品进行扫描以获取图像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

 Peptide Hydrogels: Methods for Environmentally Responsive Gelation of ECF-5

<ol><li>Whitesides, G. M., Mathias, J. P., Seto, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+self-assembly+and+nanochemistry%3A+a+chemical+strategy+for+the+synthesis+of+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular self-assembly and nanochemistry: a chemical strategy for the synthesis of nanostructures.</a> Science. 254 (5036), 1312-1319 (1991).</li>
<li>Matson, J. B., Zha, R. H., Stupp, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+self-assembly+for+crafting+functional+biological+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Solid+State+Mater+Sci%22%5BJournal%5D)">Peptide self-assembly for crafting functional biological materials.</a> Curr Opin Solid State Mater Sci. 15 (6), 225-235 (2011).</li>
<li>Itzha, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+self-assembly+as+a+strategy+for+facile+immobilization+of+redox+enzymes+on+carbon+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Carbon+Energy%22%5BJournal%5D)">Peptide self-assembly as a strategy for facile immobilization of redox enzymes on carbon electrodes.</a> Carbon Energy. 5 (11), e411(2023).</li>
<li>Rosa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+PEG+diacrylates+%28PEGDA%29+generates+hybrid+Fmoc-FF+hydrogel+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Gels%22%5BJournal%5D)">Incorporation of PEG diacrylates (PEGDA) generates hybrid Fmoc-FF hydrogel matrices.</a> Gels. 8 (12), 831(2022).</li>
<li>Balasco, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+materials+based+on+fully+aromatic+peptides%3A+The+impact+of+tryptophan%2C+tyrosine%2C+and+dopa+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Self-assembled materials based on fully aromatic peptides: The impact of tryptophan, tyrosine, and dopa residues.</a> Langmuir. 40 (2), 1470-1486 (2024).</li>
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<li>Tsutsumi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblastic+differentiation+on+hydrogels+fabricated+from+Ca2%2B+responsive+self-assembling+peptides+functionalized+with+bioactive+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Osteoblastic differentiation on hydrogels fabricated from Ca2+ responsive self-assembling peptides functionalized with bioactive peptides.</a> Bioorg Med Chem. 26 (12), 3126-3132 (2018).</li>
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<li>Guan, T., Li, J., Chen, C., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+peptide-based+hydrogels+for+wound+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci%22%5BJournal%5D)">Self-assembling peptide-based hydrogels for wound tissue repair.</a> Adv Sci. 9 (10), e2104165(2022).</li>
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<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+self-assembled+peptides+as+drug+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Advances in self-assembled peptides as drug carriers.</a> Pharmaceutics. 15 (2), 482(2023).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+and+pH-responsive+self-assembled+peptide+hydrogel+for+promoted+tumor+cell+uptake+and+enhanced+cancer+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">Injectable and pH-responsive self-assembled peptide hydrogel for promoted tumor cell uptake and enhanced cancer chemotherapy.</a> Biomater Sci. 10 (3), 854-862 (2022).</li>
<li>Shen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomembrane+induced+in+situ+self-assembly+of+peptide+with+enhanced+antimicrobial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">Biomembrane induced in situ self-assembly of peptide with enhanced antimicrobial activity.</a> Biomater Sci. 8 (7), 2031-2039 (2020).</li>
<li>Shao, T., Falcone, N., Kraatz, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+peptide+gels%3A+Influencing+properties+by+metal+ion+coordination+and+their+wide-ranging+applications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">Supramolecular peptide gels: Influencing properties by metal ion coordination and their wide-ranging applications.</a> ACS Omega. 5 (3), 1312-1317 (2020).</li>
<li>Abul-Haija, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative%2C+ion-sensitive+co-assembly+of+tripeptide+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">Cooperative, ion-sensitive co-assembly of tripeptide hydrogels.</a> Chem Commun. 53 (69), 9562-9565 (2017).</li>
<li>Tao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc-ion-mediated+self-assembly+of+forky+peptides+for+prostate+cancer-specific+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">Zinc-ion-mediated self-assembly of forky peptides for prostate cancer-specific drug delivery.</a> Chem Commun. 54 (37), 4673-4676 (2018).</li>
<li>Apostolopoulos, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Global+review+on+short+peptides%3A+Frontiers+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">A Global review on short peptides: Frontiers and perspectives.</a> Molecules. 26 (2), 430(2021).</li>
<li>Zhang, R. S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheological+characterization+and+mechanical+properties+of+self-assembled+peptide+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Rheological characterization and mechanical properties of self-assembled peptide hydrogels.</a> Soft Matter. 15 (11), 2370-2380 (2019).</li>
<li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-based+nanomaterials%3A+Self-assembly%2C+properties+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Bioact+Mater%22%5BJournal%5D)">Peptide-based nanomaterials: Self-assembly, properties and applications.</a> Bioact Mater. 11, 268-282 (2021).</li>
<li>Sedighi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+self-assembled+peptide+hydrogels+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Multifunctional self-assembled peptide hydrogels for biomedical applications.</a> Polymers (Basel). 15 (5), 1160(2023).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

在过去几十年中，随着从淀粉样蛋白衍生的自组装肽序列被发现，研究人员基于这些序列的特性设计出了大量自组装肽，在生物医学和材料科学领域展现出巨大的应用潜力19。肽类水凝胶在组织培养、药物递送和肿瘤治疗中表现出独特的生物功能化能力20。
本文介绍了三种肽类水凝胶的简单快速制备方法：pH响应型、金属离子添加型和溶剂交换型。自组装肽根据其序列特征产生不同的非共价相互作用，其中以疏水相互作用为主导，其次是静电相互作用。这些相互作用导致各异的自组装特性，并促进肽从可溶状态向不溶状态转变。例如，氨基酸和肽均具有特定的等电点，在等电点时其溶解度最低；当溶液pH显著偏离等电点时，其溶解度增加，从而促进自组装的发生。因此，调节溶液pH可触发某些肽的自组装过程13。然而，具有高度极性等电点的肽可能结构不稳定，易发生脱酰胺或水解反应。
在金属离子诱导的多肽水凝胶形成过程中，多肽通常含有带负电荷的氨基酸，如谷氨酸和天冬氨酸。这些多肽可在二价金属离子的作用下，以金属离子作为桥梁相互连接，从而触发自组装。或者，含有组氨酸残基的多肽可与某些二价金属阳离子形成配位键，诱导自组装。金属离子通过降低多肽之间的静电排斥并增强其相互吸引，促进多肽自组装，进而形成多肽水凝胶14。尽管该方法适用于需要特定金属离子的应用场景，但在大多数生理条件下可能并不必要，且金属离子难以被轻易去除。
一些高度疏水的多肽首先溶解在水溶性有机溶剂中，然后加入原本不溶于水的水相中，以快速形成多肽水凝胶。然而，许多有机溶剂在生物应用中可能产生不利影响，尤其是在较高浓度时。本文所述方法专门适用于自组装多肽。多肽的设计基于上述触发机制，旨在实现所需的生物学功能，同时将不良影响降至最低。

通过设计肽序列，肽之间的非共价相互作用可诱导其自组装，从而形成有序的微米和纳米结构，包括纳米管、纳米带、纳米纤维以及球形结构1。当这些结构自组装为微米或纳米级纤维/带时，宏观上表现出水凝胶特性。肽自组装水凝胶与聚合物水凝胶不同，其通过非共价相互作用实现自组装，凝胶状态具有可逆性，并能对外界特定条件迅速响应，实现在溶液与凝胶相之间的转换2。例如，芳香族氨基酸肽可通过溶剂切换诱导凝胶化3,4,5，RADA16肽通过阳离子与阴离子之间的静电相互作用形成凝胶6，E1Y9肽则可在Ca2+离子诱导下形成水凝胶7。天然氨基酸可被人体代谢，具有优异的生物相容性，这是聚合物水凝胶难以实现的特性8。蛋白质是执行生物学功能的分子，而肽序列的差异决定了其特定的生物学功能。因此，将特定的生物功能肽序列嵌入其中，并赋予其自组装能力，可设计出具有独特生物学功能和形态结构的肽自组装水凝胶9,10,11。本文介绍了三种通过环境响应触发凝胶过程的肽水凝胶制备方法，并简要讨论了表征肽水凝胶机械性能和形态结构的方法。
pH 值调控氨基酸的电荷状态，从而触发某些肽的凝胶化过程。例如，带正电荷的氨基酸（如精氨酸、赖氨酸、组氨酸）受 pH 值调控，可呈现正电性或中性状态；带负电荷的氨基酸则受 pH 值调控，呈现负电性或中性状态，使其偏离等电点，从而改变其在水溶液中的亲水性。因此，调控肽之间的静电作用和疏水相互作用，有助于其有序自组装。Zhang 等人设计了一种两亲性、pH 响应型自组装肽 methotrexate-coupled KKFKFEFEF，该肽在体外和体内均可响应弱酸性环境，实现从溶液到凝胶的相变。这促进了高效的细胞摄取和内吞作用，从而实现抗癌药物的递送，并提高化疗效果12。Shen 等人13设计了 FF8（KRRFFRRK）肽，该肽在 pH 值大于 9.4 时易于自组装形成纤维。在中性条件下，微生物通过其带负电荷的磷脂膜与带正电荷的肽发生静电相互作用，中和正电荷，并与磷脂分子协同自组装，导致膜破裂，增强杀菌效果13。
利用配位金属触发肽的超分子自组装形成水凝胶是一种相对罕见的方法14。当金属离子与肽发生静电相互作用时，会形成连接肽分子的盐桥，从而引发非共价相互作用和自组装，最终产生凝胶化特性。例如，Abul-Haija 等人15设计了三肽FFD，其在加入铜离子后可从液态转变为水凝胶。Tao 等人16开发了富含谷氨酸和苯丙氨酸的肽E3F3，该肽在锌离子存在下可自组装成纤维状水凝胶，并用于前列腺药物递送。
通过溶剂交换形成多肽水凝胶是最常见的超分子自组装触发条件。当疏水性多肽溶解于有机溶剂后，其疏水基团会充分暴露。当转移至水相时，疏水基团相互靠近，水分子促进多肽氢键的形成，从而导致快速自组装并易于形成水凝胶。例如，Zhang 等人17设计了一种多肽，可在极性有机溶剂中高浓度稳定溶解，加入水稀释后自组装形成β-折叠结构，进而构建多肽纤维水凝胶。Shen 等人13设计了一种还原性多肽ECF-5（ECAFF），预先溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，随后注入水相形成还原性水凝胶，用于靶向清除缺血-再灌注过程中产生的活性氧，在完成清除作用后该凝胶进一步降解为溶液。
本研究基于以往经验，选取了三种简单、快速且具有高度普适性的多肽水凝胶制备策略：（1）pH响应法：将多肽溶解于pH值远离其等电点的溶液中，随后将pH调节至接近等电点。这种变化可促使某些自组装多肽形成纤维并构建多肽水凝胶；（2）金属离子添加法：向水溶性、带负电荷的自组装多肽中加入配位阳离子。多肽之间的金属配位螯合作用促使其自组装形成水凝胶；（3）溶剂置换法：将高浓度多肽溶解于有机溶剂中，然后稀释至水相，从而诱导凝胶化行为。

<table><tbody><tr><td>3-氨基丙基三乙氧基硅烷</td><td>Aladdin</td><td>A107147</td><td>/</td></tr><tr><td>原子力显微镜</td><td>Bruker</td><td>Multimode Nanoscope VIII</td><td>/</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Aladdin</td><td>C290953</td><td>/</td></tr><tr><td>二苯丙氨酸（FF）</td><td>Chinesepeptide</td><td>可定制</td><td>纯度 &gt; 95%</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-aldrich</td><td>34869</td><td>/</td></tr><tr><td>ECF-5 肽</td><td>Chinesepeptide</td><td>序列：ECAFF</td><td>纯度 &gt; 95%</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Aladdin</td><td>H399657&amp;nbsp;</td><td>/</td></tr><tr><td>云母</td><td>Sigma-aldrich</td><td>AFM-71856-02</td><td>/</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Aladdin</td><td>P492453</td><td>/</td></tr><tr><td>流变仪</td><td>Anton Paar GmbH</td><td>MCR302</td><td>/</td></tr><tr><td>硅悬臂梁</td><td>MikroMasch</td><td>XSC11</td><td>/</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Aladdin</td><td>C111549</td><td>/</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Aladdin</td><td>S140903</td><td>/</td></tr><tr><td>TRIS 盐酸盐</td><td>Aladdin</td><td>T431531</td><td>/</td></tr></tbody></table>

机械稳定性自组装肽水凝胶的制备

Preparation of Mechanically Stable Self-Assembled Peptides Hydrogels

多肽水凝胶是由纳米纤维或聚合物通过自组装形成的亲水性极强的三维网络凝胶，可构建锁水网络。其形态与细胞外基质高度相似，因而兼具多肽的生物学功能和响应性凝胶化特性。这些独特性质使其在组织工程、三维细胞培养、癌症治疗、再生医学及其他生物医学领域得到广泛应用。本文介绍了三种利用具有环境响应性凝胶化特性的自组装多肽制备ECF-5多肽水凝胶的方法：（1）pH响应性凝胶化：通过调节pH值诱导氨基酸残基的质子化或去质子化，改变多肽分子间的静电相互作用，从而促进其自组装形成水凝胶；（2）金属离子添加法：多价金属离子与带负电荷的氨基酸残基发生螯合，作为多肽之间的交联桥，形成网络状水凝胶；（3）溶剂置换法：疏水性多肽首先溶解于非极性有机溶剂中，随后在转移至极性水相环境时诱导其自组装形成水凝胶。这些方法均采用常规实验操作，促进多肽自组装为水凝胶。通过设计多肽序列以匹配特定的凝胶化诱导条件，可实现对微/纳米结构和生物学功能的精确调控，凸显了多肽水凝胶在生物医学领域的重要应用潜力。

本文所述的三种制备多肽水凝胶的方法能够实现快速、经济且简便的生产。水凝胶的功能与其多肽序列相关。此处以ECF-5多肽作为代表性示例，展示其物理特性，包括微观形态和机械性能。
如图1A和补充图1所示，ECF-5肽包含一个类似谷胱甘肽的序列和一个苯丙氨酰二肽序列，使其具有谷胱甘肽的还原特性以及自组装能力。将ECF-5肽预先溶解于DMSO中，随后迅速与水溶液混合。在此阶段，该肽迅速发生自组装，数分钟内形成固体凝胶。当最终肽浓度超过1%时，可用镊子夹取该凝胶。
凝胶表面的原子力显微镜（AFM）成像显示，存在由大量肽纤维构成的网络结构，具有密集的孔隙以锁住水分子。稀释后，单根纤维的形貌如图1D所示，高度约为3.5 nm，形成高度一致的较宽纤维束。这与凝胶网络中观察到的纤维形貌一致。此外，在中性条件下，钙金属离子也能诱导该肽形成水凝胶，尽管此过程相对较慢，且形成的凝胶更软。
采用三种方法（pH响应、金属添加和溶剂交换）制备的水凝胶的宏观行为如图2A所示。与去离子水相比，所有水凝胶均表现出半固体特性。流变学常用于区分水凝胶与溶胶。
采用流变学技术比较了通过上述三种凝胶化方法制备的ECF-5水凝胶的宏观粘弹性。如图2所示，ECF-5水凝胶表现出典型水凝胶的粘弹性特征。在应变为0.3%时，展示了不同频率下储能模量（G'）与损耗模量（G''）之间的关系。ECF-5水凝胶的模量对频率依赖性较弱。三种方法制备的水凝胶储能模量（G'）均约为10 kPa，约为损耗模量（G''）的10倍，表现出典型的半固体水凝胶特性（图2B）。这表明，无论采用何种制备方法，ECF-5水凝胶均具有典型的水凝胶粘弹性。
在10 rad/s下，储能模量（G'）和损耗模量（G''）随应变水平变化的曲线图（图2C）显示，在0.1%至10%的应变范围内，G'和G''均基本保持恒定，且G'约为G''的10倍。这表明ECF-5水凝胶是典型的具有应力承受能力的粘弹性水凝胶。
<img alt="多肽结构，纤维的显微图像；图表展示纳米尺度组装和纳米结构分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67267/67267fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：ECF-5多肽水凝胶。 （A）ECF-5的化学结构。（B）1%浓度下ECF-5多肽水凝胶的宏观形貌。（C）水凝胶表面的微观结构。（D）ECF-5多肽纤维的显微形貌。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67267/67267fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="水凝胶的流变学；频率、应变与模量关系图；pH、DMSO、Ca²⁺ 的影响。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67267/67267fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图 2：水凝胶的宏观形貌与流变学表征。（A）三种不同诱导条件下形成的水凝胶的宏观形貌，所有样品中ECF-5肽的终浓度均为3 mg/mL。在1%浓度下，ECF-5水凝胶在三种诱导条件下的频率（B）和应变（B）对储能模量（G'）和损耗模量（G''）的影响。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67267/67267fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
补充图1：肽ECAFF的液相色谱-质谱分析。 （A）保留时间为13.238 min处的峰为产物峰。色谱柱洗脱液在220 nm波长下监测，流速为1 mL/min，流动相为含0.1%三氟乙酸的100%乙腈。ECF-5的产率为97.33%。 （B）电喷雾电离/质谱分析确认ECF-5的分子量为616.1。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67267/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案介绍了三种利用环境条件诱导肽自组装形成水凝胶的快速简便制备方法。此外，还描述了肽水凝胶的表征方法，证明在这些简单条件下可形成机械稳定的肽水凝胶。

多肽水凝胶是由纳米纤维或聚合物自组装形成的高亲水性三维网络凝胶，具有锁水能力……

我的研究探索了肽的功能化，重点关注自组装、生物功能化纤维、水凝胶以及可控分离。本视频描述了ECF-5肽如何响应环境变化而发生自组装，以及肽水凝胶的形成过程。与传统的聚合物水凝胶相比，肽水凝胶具有多样化的生物功能和优异的生物相容性，因而增强了其在生物医学工程和生物材料等领域的应用潜力。该领域的技术突破主要集中在提升自组装性能和生物功能化，包括使用非天然氨基酸的多肽水凝胶、更快的定点化学修饰方法，以及释放特定生物功能化多肽的技术，从而增强其成药性和生物功能应用。目前的多肽成药方法实验要求高，且缺乏普适性。采用常规操作和通用区域开发自组装水凝胶的形成方法，将更有助于推动多肽水凝胶的广泛应用。我们以ECF-5多肽为基础，增加了第三阶段，推广了环境响应型钙离子诱导方法。该方法通过调控多肽的表面结构与性质实现水凝胶的形成。我们正在引入其他具有改进钙离子调控能力的自组装肽设计。为启动用于水凝胶形成的 pH 响应方法，将 5 毫克 ECF-5 肽加入 400 微升去离子水中，并在 40 千赫下超声处理 30 分钟。向肽溶液中加入 40 微升过滤后的 1 摩尔氢氧化钠溶液，并涡旋混合至均匀。继续超声处理 15 分钟，直至溶液完全澄清。首先，使用适当的缓冲液配制浓度为10毫克/毫升的ECF-5自组装多肽溶液。然后，向制备好的溶液中加入60微升盐酸。混合物涡旋振荡后，在室温下静置超过30分钟，以促进水凝胶的形成。将混合物超声处理以溶解肽，并在4°C下保存。使用去离子水配制50毫克/毫升的氯化钙溶液。向460微升ECF-5肽溶液中加入40微升氯化钙溶液。涡旋混匀，室温孵育混合物超过两小时。迅速将一毫升磷酸盐缓冲液加入二甲基亚砜（DMSO）溶解的肽溶液中。充分涡旋混匀，室温孵育。五分钟后，加入 500 µL PBS，静置 15 分钟，然后弃去上清液，保留底部凝胶。ECF-5 肽表现出类似谷胱甘肽的还原性质以及自组装能力，当浓度超过 1% 时可在数分钟内形成固体凝胶。通过 pH 响应、金属添加或溶剂交换方法制备时，ECF-5 水凝胶表现出半固体特性。首先，采用合适的方法制备肽类水凝胶。使用双面胶去除一层云母，并用APTES溶液将云母表面粘附，静置五分钟。使用前用纯水彻底冲洗云母表面。将水凝胶稀释并充分混合后，滴加到修饰后的云母表面进行静态吸附。五分钟后，用纯水冲洗表面并将其干燥。原子力显微镜显示，凝胶表面具有大量多肽纤维，这些纤维形成密集的孔隙以锁住水分，单根纤维则聚集成高度约为3.5纳米的一致性较宽纤维带。

preparation-of-mechanically-stable-self-assembled-peptides-hydrogels

Research

科研

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Biochemistry

生物化学

机械稳定的自组装肽水凝胶的制备

本视频将演示一种快速高效的方法，用于对聚乙二醇进行甲基丙烯酸酯化，从而实现链式聚合反应和水凝胶的合成。视频还将展示如何将甲基丙烯酰胺官能团引入肽分子中，详细介绍评估官能团化效率的常用分析方法，提供故障排除及高级修饰的建议，并演示典型的水凝胶表征技术。...

微波辅助聚乙二醇和树脂上肽的功能化及其在链式聚合和水凝胶形成中的应用

本文描述了通过自组装这一自发过程形成高度有序的肽基结构的方法。该方法利用 commercially available peptides...

短肽自组装形成有序生物分子结构

我们介绍一种新型聚丙烯酰胺水凝胶，称为羟基-PAAm，可实现细胞外基质蛋白的直接结合，且成本低廉、操作简便。将羟基-PAAm水凝胶与微接触印刷技术结合，可独立调控天然细胞微环境中的多种信号，从而用于研究细胞力学转导。...

用于解耦机械转导信号影响的羟基-PAAm水凝胶的制备

我们介绍了由分裂内含肽介导的蛋白水凝胶的合成。该水凝胶的构建单元是两种蛋白共聚物，每种共聚物包含一个三聚体蛋白的亚基（作为交联剂）以及一半的分裂内含肽。混合这两种蛋白共聚物可触发内含肽反式剪接反应，生成可自组装形成水凝胶的多肽单元。该水凝胶具有高度的pH和温度稳定性，与有机溶剂相容，并可 facile...

一种由分裂型内含肽介导的人工蛋白质水凝胶的合成

我们描述了一种用于三维细胞培养的合成水凝胶基质的光介导形成及其后续生物化学图案化的连续过程。文中展示了利用细胞相容性光点击化学构建和修饰水凝胶的方法。此外，还介绍了对这些水凝胶中的图案进行定量与观察、以及测定细胞活力的简便技术。...

光介导的水凝胶形成与图案化及其在细胞培养中的应用

本文描述了基于聚合物低聚物通过腙键交联制备可降解温敏性水凝胶的方案，适用于宏观、微观和纳米尺度，其中纳米尺度可用于制备凝胶纳米颗粒和纳米纤维。...

通过反应性挤出、微流控、自组装和电纺丝在多个长度尺度上制备可降解温敏性水凝胶

本文针对基于蛋白质的水凝胶中调控三维结构的不同方法，从材料特性角度进行了评估。将大孔网络功能化修饰以细胞黏附肽，并利用两种不同的模式细胞系评估其在细胞培养中的可行性。...

用于细胞培养应用的蛋白基水凝胶结构的简便调控

本方法中，我们采用光聚合与点击化学技术，在聚乙二醇（PEG）水凝胶表面构建蛋白质或多肽图案，以提供固定的生物活性信号，用于研究细胞响应 体外.

利用光化学方法在水凝胶上图案化生物活性蛋白质或多肽以用于生物应用

本文介绍了一种合成信息编码的肽模拟寡聚物的方案，并利用胺类和醛类作为动态共价反应对，以及路易斯酸性稀土金属三氟甲磺酸盐作为多功能试剂，指导这些肽模拟物进行序列定向的自组装，形成分子梯状结构。...

信息承载型肽模拟物的合成及其序列导向的动态共价自组装

本实验方案旨在通过免疫染色评估生物功能化自组装肽在细胞黏附、类器官形态及基因表达方面的作用。我们将使用结直肠癌细胞系，以提供一种经济高效的方法来获取用于高强度检测的类器官。...

利用超短自组装肽基质从SW1222细胞系构建和表征结直肠癌类器官

关键词：类器官，结直肠癌，SW1222细胞系，自组装肽，三维细胞培养，肿瘤模型，细胞外基质，癌症研究

学习利用环境响应条件制备机械稳定的自组装肽水凝胶的方法。本方案展示ECF-5肽的pH响应、金属离子诱导及溶剂交换等成胶技术，适用于生物医学工程与生物材料领域的功能化应用研究。

机械稳定性自组装肽水凝胶的制备

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