Name: 用于原位纤维束表面接枝的人工肺装置启动 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 了解人工肺中空纤维表面接枝zoura聚合物涂层的制备方法，用于减少ECMO回路中的蛋白质吸附和血栓形成。该技术为开发更安全的抗凝医疗器械提供了新途径。

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本工作部分通过美国国立卫生研究院（NIH）1R01HL140231-01A1号服务协议资助。

该方案遵循纽黑文大学人类研究伦理委员会的指导方针。
1. 人工肺回路的包被
注意：人工肺回路采用两步法偶联两性离子 DOPA-SBMA 进行涂层处理。纤维束/氧合器的具体参数属于专有信息。在研究流动对涂层肺抗污性能影响的实验中，氧合器及管路回路（5/16&#34; Tygon 管路，配有可偶联的聚碳酸酯接头）在磷酸盐缓冲液（PBS；pH 7.34，温度约 37 °C）中以泵的最大流速 1.22 L/min 持续灌注 24 小时。需要说明的是，氧合器中的实际流速取决于患者需求和具体临床情况，在成年患者中通常介于 2–7 L/min 之间。本实验选用 PBS 是为了在流动条件下便于定量检测涂层纤维上关键血液凝固标志物的污损程度。若使用全血评估剪切速率对涂层纤维抗污性能的影响，可能会受到全血污损的干扰因素影响；而采用 PBS 可消除此类混杂效应。人工肺的涂层处理按以下步骤进行：
<ol>
	<li>用去离子水（DI水）中30%的甲醇循环清洗肺部回路20分钟，随后用去离子水中10%的甲醇和去离子水各循环20分钟，以清洁回路。</li>
	<li>在进行紫外臭氧等离子体（UVO）处理前，用低流速的过滤压缩空气干燥回路2小时。</li>
	<li>将清洁后的肺部回路放入UVO等离子体发生器（UVO-Cleaner）中，关闭设备，启动UVO等离子体发生器，使等离子体与装置相互作用20分钟。</li>
	<li>等离子体处理后，应立即进行涂层步骤，避免表面链重排导致等离子体作用产生的活性位点被掩蔽。</li>
	<li>在装置表面改性的同时，配制新鲜的涂层溶液：在600 mL TRIS缓冲液（pH 8.5）中溶解1.2 g多巴胺盐酸盐（Dopamine-HCl），然后按DOPA:SMBA为1:15的摩尔比加入磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯（SBMA）单体并溶解。</li>
	<li>向涂层溶液中滴加5 mM高碘酸钠（20 µL），并混合均匀。使用玻璃烧杯、磁力搅拌子和搅拌台，以150 rpm转速辅助混合。 
	注意：涂层溶液配制后应在不超过20分钟内加入装置。因此，若需对多个肺部装置进行涂层，可采用简便的预充注方法（例如使用泵进行预充注）以提高效率。</li>
	<li>使用大容量注射器（60 cc）抽取并填充涂层溶液，对肺部装置进行预充注。夹闭回路一端，从另一端进行预充注，确保气泡可通过回路的接入连接口排出。</li>
	<li>完全预充注后，将装置置于紫外光源下照射2小时，并每隔10分钟上下翻转装置一次，以搅动溶液。</li>
	<li>紫外光处理后，排空回路，并使用60 cc注射器反复用去离子水（DI水）预充注并排空，轻柔冲洗所有样品。当去离子水冲洗液变为澄清时，将装置用去离子水预充注后置于4 °C冰箱中保存，用于后续解剖及表面分析。</li>
</ol>
2. 肺脏尸检
<ol>
	<li>在化学通风橱中，用经过滤的温和气流排空并干燥肺部回路。</li>
	<li>使用带旋转底座的台钳固定装置，进行设备解剖。使用带锯切割装置外壳的入口/出口连接部分以及外壳的前后面板，再使用工业级美工刀配合锤子，沿其周边小心切割。</li>
	<li>移除面板后，即可接触到纤维毡层。可沿纤维方向进行精细切割，以获取纤维束内任意位置的纤维毡样品（例如表面及内部）。使用镊子夹取样品边缘，避免污染，并将样品转移至装有去离子水的60 mL试管中，以减少样品污染。</li>
</ol>
3. 涂层肺部循环材料上蛋白质污垢的评估
<ol>
	<li>纤维蛋白原吸附试验。
	<ol>
		<li>将尺寸约为 1 cm × 1 cm 的标准化纤维膜样品置于 1 mL 浓度为 3 mg/mL 的纤维蛋白原溶液中，在 37 °C 条件下以 60 rpm 振荡孵育超过 90 分钟。</li>
		<li>用 PBS 缓冲液洗涤样品（3 次），转移至新孔板中，每孔加入 1 mL 浓度为 1 mg/mL 的牛血清白蛋白（BSA），继续孵育 90 分钟，随后再次用 PBS 缓冲液洗涤（3 次），并将样品转移至新的孔中。</li>
		<li>在新孔中，每孔加入 1 mL 以 PBS 稀释 1:1000 的辣根过氧化物酶（HRP）标记的纤维蛋白原抗体，孵育 30 分钟，然后用 PBS 缓冲液洗涤（3 次），并将样品转移至新孔中。</li>
		<li>在新孔中，每孔加入 500 µL 含 0.03% 过氧化氢的 0.1 M 柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH 5.0）中的 1 mg/mL 邻苯二胺（OPD），每隔 30 秒加入，避光孵育 30 分钟。</li>
		<li>每孔加入 500 µL 1 N HCl 以终止过氧化物酶与 OPD 的反应。</li>
		<li>取出各孔中的上清液并转移至比色皿中，使用紫外-可见分光光度计在 492 nm 波长下测定上清液的吸光度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>血小板黏附试验。
	<ol>
		<li>将乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒解冻 20 分钟。</li>
		<li>在解冻过程中，制备混合成人人类血浆以获得富血小板血浆（PRP）。</li>
		<li>为制备 PRP，将解冻的人类血浆样本管以 483 × g 高速离心，使血浆分离为两个区域，其中下三分之一为 PRP，上三分之二则为乏血小板血浆（PPP）。</li>
		<li>去除管底形成的血小板沉淀以及离心后血浆上层的三分之二部分，并通过轻轻摇动试管将沉淀重新分散至上三分之二的血浆中。</li>
		<li>向 PRP 中按体积比 1:1 加入氯化钙（0.2 M），以逆转柠檬酸盐的抗凝作用，随后进行检测。</li>
		<li>将样品（约 1 cm × 1 cm）置于 500 µL PRP 中，在 37 °C 孵育 90 分钟，然后用 PBS 缓冲液冲洗三次，并转移至新孔中。</li>
		<li>每孔加入 300 µL PBS 和 10 µL 10 倍裂解缓冲液，孵育 45 分钟。</li>
		<li>每孔加入 50 µL 反应混合液，避光孵育 30 分钟。</li>
		<li>每孔加入 50 µL HCl 以终止反应。</li>
		<li>为检测吸附血小板裂解物中的 LDH 活性，测定反应孔溶液在 490 nm 和 680 nm 波长下的光吸收值，并用 490 nm 的读数减去 680 nm 的读数，以分析血小板黏附情况。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 流动对防污活性的影响
<ol>
	<li>用 PBS 预灌注人工肺回路，并确保无泄漏。然后将回路固定在滚柱泵上，使 PBS 循环 24 小时。 
	注：1.22 L/min 是可达到的最高流速。</li>
	<li>为模拟流经肺装置的血液的常温状态，在循环过程中将人工肺置于 37 °C 水浴中孵育。</li>
	<li>随后，进行肺组织解剖及蛋白质污染挑战实验，步骤如上所述。 
	注：采用单因素方差分析（one-way ANOVA）判断各独立组均值之间是否存在统计学上的显著差异，并使用 Tukey's HSD 检验确定具体哪些组之间存在差异。</li>
</ol>

Zwitterionic Polymer Grafts for Antifouling in Artificial Lung Fiber Bundles

作者声明不存在竞争性财务利益。Keith Cook 博士和 David Skoog 博士在 ART LLC 拥有所有权权益。

人工肺中涂覆聚二甲基硅氧烷（PDMS）的聚丙烯（PP）纤维显示出臭氧暴露与纤维结构之间的关系，从而确定了紫外臭氧等离子体的敏感化阈值。该阈值可用于指导生成表面自由基所需的暴露时间，以接枝涂层材料，特别是多巴胺聚合物和甲基丙烯酸磺基甜菜碱聚合物。当纤维暴露于紫外臭氧等离子体的时间少于20分钟时，未观察到明显的结构变化。然而，暴露时间达到30分钟或更长时，则出现明显的宏观变化，如卷曲、变硬和脆性增加。在施加抗污两性离子接枝涂层后，X射线光电子能谱证实了多巴胺聚合物/聚磺基甜菜碱涂层存在于纤维表面。
本研究结果数据直接支持关于涂层纤维抗污性能的以下关键结论：1）纤维表面蛋白质吸附程度取决于纤维在束内的位置，与内层纤维相比，外层纤维的纤维蛋白原污染程度较低；2）每种涂层基材上的纤维蛋白原吸附水平均显著低于未涂层材料对照组的污染水平。此外，由于聚多巴胺/聚磺基甜菜碱涂层的作用，内层纤维上的血小板吸附显著减少，而外层纤维上的血小板吸附则与未涂层纤维相比显著增加。在采用ELISA法检测纤维蛋白原污染、异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗人纤维蛋白原抗体吸附以及血小板黏附实验中，均一致观察到一个有趣...

人工肺纤维，也称为中空纤维膜，是制造体外膜肺氧合（ECMO）设备的关键材料，可为危重患者提供呼吸支持。多层此类纤维构成致密的纤维束，作为气体交换单元。然而，聚合物纤维表面会激活血液凝固级联反应，导致血栓形成。人工表面引发的血栓主要由凝血级联反应的激活所驱动，该过程是一系列复杂的酶促反应，最终导致血块形成。当血液接触外来材料（如医疗器械中的材料，包括人工肺、支架、导管等）时，便会触发凝血级联反应1，2。此过程始于血液暴露于人工材料表面，从而激活级联反应的内源性通路。该激活促使凝血酶生成，凝血酶是一种关键酶，可将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，构成血块的结构基础。同时，血小板被激活并在局部聚集，进一步加固血块。最终结果是形成血栓，可能阻塞血流，导致中风或心肌梗死等严重并发症。
为防止人工表面发生血栓形成，通常使用传统抗凝药物，如肝素、华法林以及较新的直接口服抗凝药（DOACs）3，4。这些药物通过干扰凝血级联反应的多个步骤发挥作用。例如，肝素可增强抗凝血酶Ⅲ（antithrombin III）的活性，后者是凝血酶的天然抑制剂；而华法林则抑制维生素K依赖性凝血因子的合成。然而，抗凝药物的使用存在若干挑战。首先，它们会增加出血风险，在某些情况下可能危及生命。其次，抗凝药物的效果具有变异性，需要定期监测并调整剂量，尤其是华法林。此外，长期使用抗凝药物还可能引起骨质疏松和皮肤坏死等不良反应。由于需要全身性抗凝，也限制了在出血高风险患者中使用医疗器械的应用。
由于血栓形成可能阻碍气体在中空纤维膜上的交换，人们已采用多种方法（如浸涂和静电纺丝）在肺纤维上施加抗污涂层，以防止生物污染5,6。人工肺制造商通常采购 commercially available 的中空纤维，并通过一系列步骤将其组装成人工肺，包括将纤维围绕实心芯材捆扎、对纤维束端部进行封装（粘合）、将封装后的纤维束置入具有气体和血液流道的外壳胶囊中，以及组装后的清洗。虽然对尚未植入人工肺的纤维进行涂层处理具有更大的灵活性，但在捆扎前阶段进行的表面改性需经历多个制造步骤，这些步骤涉及涂层表面与后续工艺环境之间的机械和化学相互作用，可能导致设备中出现涂层缺失的纤维；而在需要高涂层覆盖率以限制血栓形成的设备中，这一点至关重要。另一种方法是在已完成封装的纤维束上施加涂层。能够对成品人工肺进行涂层处理的优势在于，这是一种实用且简便的表面工程改造方法，适用于人工肺及其他多种医疗器械。但总体而言，与涂层本身的效能相比，采用喷涂或浸涂等方式施加涂层的方法本身对预防血栓形成的重要性较低。例如，用于医疗器械的中空纤维可在挤出过程中进行浸涂，随后编织成垫片、卷绕成束，并集成至最终的人工肺设备中；或者，也可在设备制造完成后施加涂层。然而，关键因素是&#160;抗血栓涂层的有效施用、耐久性和功效5。这是因为在无全身抗凝的情况下，这些涂层的功能是防止血凝块形成的关键环节，因此必须具备高效且持久的抗污性能，以确保有效预防血栓形成。
尽管目前应用了抗血栓涂层并同时低剂量给予抗凝剂，但由于血栓形成，人工肺模块&#160;在使用相对较短的时间（从数天到3周）后仍必须更换7,8。其纤维膜的气体交换效率在较短时间内即会下降，原因是纤维表面被由纤维蛋白、单个细胞及细胞团组成的膜状血凝块结构污染，&#160;从而增加了气体扩散屏障9。通常，所采用的涂层类型和涂覆方法10,11,12,13,14,15,16,17,18取决于所需的性能，如生物相容性和耐久性。已有多种防污涂层应用于人工肺纤维，包括因具有良好的生物相容性19、耐久性和抗生物污染能力而被广泛使用的硅酮；因具备生物相容性和抗生物污染特性而被采用的聚氨酯（PU）20；因具有生物相容性和抗菌性能而被使用的壳聚糖21,22；可灭活凝血酶的肝素23,8；以及基于亲水性24聚合物的涂层，如聚乙二醇25,26、聚（2-甲氧基乙基丙烯酸酯）27和磷酰胆碱28,29。
两性离子涂层是一种有前景的策略，可在无需全身抗凝的情况下减少人工表面的血栓形成5,6。这类涂层由同时带有正电荷和负电荷的分子组成，电荷相互平衡，形成高度亲水且抗污的表面。这些涂层的两性离子特性可减少蛋白质吸附和血小板黏附，而这两种过程均为凝血级联反应启动的关键步骤。通过阻止血液蛋白与人工表面之间的初始相互作用，两性离子涂层有效抑制了凝血级联的激活，从而降低血栓形成的风险。该方法不仅减少了对全身性抗凝剂的需求，还为医疗器械的长期使用提供了更具生物相容性的解决方案。
在本研究中，我们评估了使用超低污损的两性离子聚（磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯）（pSBMA）涂层结合表面粘附性聚多巴胺（pDOPA）层对人工肺进行预处理的有效性。设备完成涂层处理过程中，每隔10分钟将其侧向翻转一次，持续2小时。为评估纤维束不同区域涂层可能存在的差异，我们检测了位于纤维束表面及内部的纤维上纤维蛋白原和血小板的污损情况。此外，通过比较人工肺在流动暴露前后污损数据的变化，分析了流动对防污性能的影响。对于涉及复杂介质流动的长期抗生物污损应用，两性离子涂层不仅需要抑制全血引起的污损——这是一项极具挑战性的任务——还必须在整个应用期间在血流动力学应力下保持其有效性。这些涂层必须能够提供强大的空间位阻效应，以阻止非特异性蛋白质吸附，并达到适当的表面堆积密度，从而在基底与复杂介质之间形成一层水合膜屏障。此外，涂层必须牢固地附着在表面，确保将涂层锚定到基底的连接分子不会发生脱落30。本文所述方案旨在确保所施加的涂层满足实现有效且持久表面防护的关键要求。

<table><tbody><tr><td>烧杯</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>https://www.thermofisher.com/search/browse/category/us/en/90094065</td><td>用于实验</td></tr><tr><td>Beckman Coulter Allegra X-30R 离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>https://www.mybeckman.in/centrifuges/general-purpose/allegra-x-30</td><td>用于离心操作</td></tr><tr><td>Biochemguard BSL2 安全罩</td><td>Biochemguard</td><td>https://bakerco.com/images/uploads/assets/BiochemGARD_220v_Web_0.pdf</td><td>用于移植物涂层中的紫外光源</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/substance/bovineserumalbumin123459048468</td><td>纤维蛋白原检测材料</td></tr><tr><td>柠檬酸盐抗凝的混合男性血浆</td><td>ZenBio</td><td>https://www.zen-bio.com/products/serum/human-blood-products.php</td><td>用于实验</td></tr><tr><td>柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/citrate-phosphate-buffer?focus=products&amp;amp;page=1&amp;amp;perpage=30&amp;amp;sort=relevance&amp;amp;term=citrate-phosphate%20buffer&amp;amp;type=product</td><td>纤维蛋白原检测材料</td></tr><tr><td>多巴胺盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/h60255</td><td>用于涂层</td></tr><tr><td>多巴胺盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N/A</td><td>纤维蛋白原检测材料</td></tr><tr><td>荧光素标记的山羊免疫球蛋白 G（IGG）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/aq303f</td><td>用于荧光光强测量</td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的抗纤维蛋白原抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/horseradish-peroxidase-conjugated-anti-fibrinogen?focus=products&amp;amp;page=1&amp;amp;perpage=30&amp;amp;sort=relevance&amp;amp;term=horseradish%20peroxidase%20conjugated%20anti-fibrinogen&amp;amp;type=product</td><td>纤维蛋白原检测材料</td></tr><tr><td>加热板</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>https://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/lab-equipment/hot-plates-stirrers/lab-hot-plates.html</td><td>用于实验</td></tr><tr><td>人纤维蛋白原粉末</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/human-fibrinogen?focus=products&amp;amp;page=1&amp;amp;perpage=30&amp;amp;sort=relevance&amp;amp;term=human%20fibrinogen&amp;amp;type=product</td><td>纤维蛋白原检测材料</td></tr><tr><td>Jelight UVO-Cleaner 型号 144AX</td><td>Jelight</td><td>https://www.jelight.com/uvo-cleaner/</td><td>用于医疗器械材料的等离子处理</td></tr><tr><td>乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒</td><td>ABCAM</td><td>https://www.abcam.com/en-us/products/assay-kits/ldh-assay-kit-lactate-dehydrogenase-assay-kit-colorimetric-ab102526</td><td>用于 LDH 检测</td></tr><tr><td>邻苯二胺（OPD）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p9029</td><td>纤维蛋白原检测材料</td></tr><tr><td>PDMS 涂层聚丙烯纤维</td><td>ART LLC</td><td>N/A</td><td>人工肺材料的一部分</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p4417</td><td>纤维蛋白原检测材料</td></tr><tr><td>酶标仪（BioTek）</td><td>BioTek</td><td>https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/plate-reader-metabolic-assays</td><td>用于读取荧光光强</td></tr><tr><td>聚二甲基硅氧烷（PDMS）</td><td>ART LLC</td><td>N/A</td><td>人工肺材料的一部分</td></tr><tr><td>高碘酸钠（NaIO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/substance/sodiummetaperiodate213897790285</td><td>用于涂层</td></tr><tr><td>Stockert Shiley 多流道滚柱泵</td><td>Sorin Biomedical</td><td>N/A</td><td>用于流动实验</td></tr><tr><td>磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯（SBMA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/sulfobetaine-methacrylate-(sbma)</td><td>用于涂层</td></tr><tr><td>TRIS 缓冲盐水（pH 8.5）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8793</td><td>在实验室中使用 TRIS 袋装粉末配制</td></tr><tr><td>Tygon 管路</td><td>ART LLC</td><td>N/A</td><td>人工肺材料的一部分</td></tr></tbody></table>

用于原位纤维束表面接枝的人工肺装置预处理

Artificial Lung Device Priming for In Situ Fiber Bundle Surface Grafting

尽管人工肺纤维束的高比表面积有利于增强气体交换，但其较大的表面积、密集的排列结构以及纤维表面化学特性是导致血栓形成的主要因素。为减轻这一问题，必须对表面化学性质进行均匀改性，以有效减少非特异性蛋白质污染，从而有助于限制血栓形成，并降低因全身抗凝剂使用所引发的血栓栓塞或出血风险。
在本研究中，我们探讨了两性离子聚合物接枝在聚丙烯纤维束上的应用及其抗污性能。接枝过程包括使用两性离子聚磺基甜菜碱分子和多巴胺连接剂对人工肺装置进行预处理。 原位 包被。采用标准的纤维蛋白原酶联免疫吸附测定（ELISA）和血小板乳酸脱氢酶污染检测评估防污性能。X射线光电子能谱证实了表面包被的存在，与未包被的纤维相比，包被纤维上的污染显著减少，表明该接枝工艺的有效性及其在防污方面的应用前景。
然而，采用引涂工艺对纤维束内的纤维进行涂层时，观察到纤维表面涂层外观存在差异，这可能影响整体的防污性能。解决这一问题可进一步提高通过该方法改性的肺纤维束的防污效率 原位 嫁接

本文介绍了一种通过预灌注、拆卸装置以收集涂层纤维样品，并对切片纤维进行抗污性能评估的人工肺回路两性离子聚合物接枝的实验方案。在图1中，展示了人工肺回路表面改性的方法示意图。首先将人工肺暴露于紫外臭氧（UVO）等离子体中，使单线态氧自由基与纤维发生作用，随后通过预灌注涂覆溶液，并在紫外光源下进行2小时的接枝反应，实现两性离子pSBMA在人工肺表面的涂覆。经紫外臭氧等离子体预处理的纤维被修饰上两性离子聚多巴胺/聚磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯（pDOPA-pSBMA），其中pSBMA通过氢键和阳离子-π相互作用锚定在已黏附的聚多巴胺层之上的纤维表面。对涂层后的人工肺进行解剖以获取涂层纤维束的过程如图2所示。在图3中，展示了采用X射线光电子能谱宽程扫描对两性离子聚磺基甜菜碱涂层人工肺纤维表面进行代表性表征的结果。在图4和 图5</stron...

本研究探讨了通过预充氧合器装置在人工肺中空纤维表面涂覆涂层的抗污损活性。尽管这种纤维表面改性方法具有实用性，但涂层工艺的有效性取决于纤维束内各层纤维网上接枝覆盖的程度。

尽管人工肺纤维束的高表面积与体积比可增强气体交换，但其较大的表面积、密集的排列结构以及……

用于重症监护的血液屏障类医疗器械常面临血栓形成问题，这会损害器械功能并增加全身性血栓风险。临床抗凝药物虽可减轻血栓形成，但会增加出血风险。生物材料表面的蛋白质吸附会触发凝血和炎症反应。我们研究了zoura聚合物清洗涂层对ECMO管路蛋白质吸附的影响。目前尚无商业化的抗凝剂能够选择性且有效地抑制医疗器械中的血栓形成，同时不影响患者自身凝血功能。此外，针对各类医疗器械，必须优化并验证表面涂层与工程化处理在数天至数周甚至数月时间范围内的有效性。我们的新科学目标包括：评估不同预处理方法对涂层应用的影响，考察清洗过程中处理涂层溶液的方式对涂层均匀性的影响，研究替代性防污聚合物接枝对非特异性蛋白质污染的作用，以及确定优化后的涂层在体内限制血栓形成的能力。为清洗肺循环回路，先用含30%甲醇的去离子水循环清洗20分钟，随后用含10%甲醇的去离子水循环清洗，最后再用去离子水单独循环清洗20分钟。用设定为低流速的过滤室内空气干燥肺循环系统两小时。将清洁并干燥后的肺循环系统放入紫外臭氧等离子体发生器中。关闭发生器并启动仪器，进行20分钟的等离子体处理。完成等离子体处理后，应立即进入包被步骤，以防止表面链重排以及等离子体作用产生的活性位点丢失。在装置进行表面修饰的同时，将1.2克盐酸多巴胺溶解于600毫升三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液中，置于玻璃烧杯内。随后，按1:15的摩尔比将磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯单体溶解于上述溶液中。然后将五毫摩尔的高碘酸钠以液滴形式加入包被溶液中。使用磁力搅拌子和设定为150转/分钟的搅拌板充分混合溶液。接下来，使用大号注射器抽取并填充管路，以包被溶液对肺部装置进行预处理。夹住管路的一端，并从另一端进行预充，同时通过管路通路连接器引导出气泡。待管路完全预充后，将装置置于紫外光源下照射两小时。每10分钟上下翻转预充装置的两端，以搅动溶液。光照处理后，将管路中的液体完全排出。使用60立方厘米的注射器，用去离子水反复灌注并排空，轻轻冲洗所有样品，直至冲洗流出液变澄清。最后，将装置充满去离子水，置于4°C的冰箱中保存，以备后续解剖及表面分析。进行纤维蛋白原吸附实验时，将纤维膜样品转移至含有1毫升浓度为3毫克/毫升纤维蛋白原溶液的孔板中，在37摄氏度、60 RPM条件下孵育90分钟。用PBS洗涤样品，将其转移至新的孔中，并向每孔加入1毫升浓度为1毫克/毫升的BSA溶液。再孵育90分钟。然后用PBS溶液将样品洗涤三次，并转移至新的孔中。接着，向每孔加入1毫升PBS溶液中按1:1000稀释的辣根过氧化物酶标记的纤维蛋白原抗体。将样品孵育30分钟后洗涤，转移至新的孔中。在新孔中，每隔30秒加入500微升含0.03%过氧化氢的邻苯二胺柠檬酸盐磷酸盐缓冲液，调节pH至5.0。将样品避光孵育30分钟。为了终止过氧化物酶和邻苯二胺的反应，向每个孔中加入500微升1摩尔/升的盐酸。将每个孔中的上清液转移至比色皿中。使用紫外-可见分光光度计在492纳米处测定上清液的吸光度。将乳酸脱氢酶检测试剂盒解冻20分钟。在试剂盒解冻的同时，准备混合的成人人血浆以获得富血小板血浆。制备富血小板血浆时，将解冻的人血浆样本管在483 G条件下离心，使血浆分离为两个区域。识别含有富血小板血浆的下三分之一部分和含有贫血小板血浆的上三分之二部分。小心移除试管底部的血小板沉淀以及上三分之二含有贫血小板血浆的部分。通过轻轻摇动试管，将血小板沉淀轻柔地分散到上层血浆中。检测前，向富血小板血浆中加入氯化钙，以逆转柠檬酸盐的作用。接着，将纤维膜样品置于500 µL富血小板血浆中，在37°C孵育90分钟。孵育结束后，将样品转移至新的孔板中，并用PBS溶液冲洗三次。再次将样品转移至新的孔中。向每孔加入 300 微升 PBS 溶液和 10 微升 10 X 裂解缓冲液。将样品孵育 45 分钟，然后向每孔加入 50 微升反应混合液，并避光孵育 30 分钟。每孔加入 50 µL 盐酸以终止反应。为检测吸附血小板裂解物中乳酸脱氢酶的活性，在 490 nm 和 680 nm 波长下测定各孔溶液的光吸收值。与未包被的对照组相比，编码的 PP-PDMS 纤维显著减少了纤维蛋白原污染。在无流动条件下，PP-PDMS纤维的外层束与内层束之间的纤维蛋白原污染无显著差异。在持续24小时PBS流动条件下，PP-PDMS纤维外层束和内层束的纤维蛋白原污染均保持在较低水平，且无显著差异。血小板污染在PP-PDMS纤维的外层束中高于内层束和未涂层对照组。与未暴露于流动条件下的内层束相比，外层束的血小板污损显著更高。在24小时PBS流动条件下，外层束与内层束之间的血小板污损无显著差异，且污损水平均较低。

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Bioengineering

生物工程

用于原位纤维束表面接枝的人工肺装置启动

我们课题组开发了一种生物反应器培养系统，可模拟心血管系统的生理脉动应力，用于再生可植入的小直径血管移植物。...

使用脉动生物反应器构建基于生物材料的血管移植物

我们开发了一种去细胞化肺细胞外基质以及新型仿生生物反应器，可用于生成具有功能的肺组织。通过将细胞接种至基质中并在生物反应器中进行培养，所生成的组织在体内移植后短期内即表现出有效的气体交换功能。...

肺组织工程操作步骤

全器官脱细胞技术可制备天然生物支架，用于再生医学。本文介绍了一种非人灵长类动物肺再生模型，其中完整肺脏在生物反应器中进行全器官脱细胞处理，随后接种成体干细胞和内皮细胞，该生物反应器可支持血管循环和液体培养基通气。...

非人灵长类动物肺脏脱细胞与再细胞化：基于专用大型器官生物反应器的方法

一种新型声带生物反应器被构建并表征，该反应器能够向培养细胞施加生理相关的振动刺激。该动态培养装置与纤维状聚（ε-己内酯）支架构建出一种模拟声带的微环境，可调控间充质干细胞的行为。...

新型声带生物反应器的构建与表征

重现器官特异性的微环境（可刺激局部血管生成）对于受损组织的成功再生至关重要。本报告展示了一种新方法，即将纤维蛋白凝胶植入活体小鼠的肺表面，以探究肺特异性微环境如何调控成年小鼠中的血管生成及肺泡再生。...

在小鼠肺部植入纤维蛋白凝胶以研究肺特异性血管生成

生物材料技术的进步使得三维多细胞类型结构的构建成为可能。我们已开发出静电纺丝方案，用于制备三种独立的支架，以培养气道的主要结构细胞，从而构建气道细支气管壁的三维体外模型。...

通过调整静电纺丝工艺为三层结构提供三种独特环境 体外 气道壁模型

移植物狭窄是组织工程气道替代物面临的关键障碍。为了研究导致狭窄的细胞机制，我们采用了一种经骨髓单个核细胞（BM-MNC）接种的组织工程气管替代小鼠模型。本文详细描述了我们的实验方案，包括支架制备、BM-MNC分离、移植物接种以及移植手术。...

在小鼠模型中接种与植入生物合成组织工程气管移植物

本实验方案的目标是在管状电纺支架中建立人巨噬细胞与肌成纤维细胞的动态共培养体系，利用可分离剪切应力与周期性拉伸的生物反应器，研究材料驱动的组织再生过程。...

一种多信号生物反应器，用于在流动和拉伸条件下评估生物材料的炎症反应与再生能力

本方案描述了一种通过使用肺泡上皮II型细胞、成纤维细胞和内皮细胞重新接种脱细胞化精密切割肺组织切片，以生成可重复且小规模工程化肺组织的方法。...

由脱细胞肺切片制备的工程化肺组织

该方案描述了一种可进行成像的生物反应器，可用于选择性去除大鼠气管的内源性上皮，并在外源细胞接种后使其在管腔表面均匀分布，随后实现长期培养 体外...

成像引导式生物反应器用于生成生物工程化气道组织

本文介绍了利用脱细胞和再细胞化方法构建生物工程小鼠肺脏的技术，同时详细描述了后续的原位肺移植过程。...

利用脱细胞小鼠肺和原代人内皮细胞移植生物工程化肺

了解人工肺中空纤维表面接枝zoura聚合物涂层的制备方法，用于减少ECMO回路中的蛋白质吸附和血栓形成。该技术为开发更安全的抗凝医疗器械提供了新途径。

用于原位纤维束表面接枝的人工肺装置预处理

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