Name: 使用耻垢分枝杆菌作为分枝杆菌锌限制生长条件的生物指示剂 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: 了解耻垢分枝杆菌在锌限制条件下的生理适应机制，探索细胞形态变化与氧化应激反应。该方法为研究结核分枝杆菌的宿主-病原体相互作用提供了标准化实验方案。

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本研究由美国国家科学基金会（NSF）CAREER奖1844854、美国肺脏协会创新奖IA-937538以及美国国立卫生研究院（NIH）国家过敏与传染病研究所R21 AI109293资助，资助对象为S.P。Allexa D. Burger的现任职单位为美国夏威夷州火奴鲁鲁市夏威夷大学马诺阿分校太平洋生物科学研究中心。

Assessing Bioindicator Phenotypes for Zinc Limitation in M. smegmatis

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<li>Dow, A., Prisic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+ribosomal+proteins+are+required+for+growth+and+morphogenesis+of+Mycobacterium+smegmatis+under+zinc+limiting+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Alternative ribosomal proteins are required for growth and morphogenesis of Mycobacterium smegmatis under zinc limiting conditions.</a> PLoS One. 13 (4), e0196300(2018).</li>
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<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+depletion+induces+ribosome+hibernation+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Zinc depletion induces ribosome hibernation in mycobacteria.</a> Proc Natl Acad Sci. 115 (32), 8191-8196 (2018).</li>
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</ol>

作者无利益冲突。

填补关于替代核糖体（Alt-ribosomes）机制基础知识空白的主要障碍在于难以实现Zn2+限制性条件 体外痕量锌2+ 实验室环境中的污染很常见；因此，获得可重复的锌（Zn）结果具有挑战性2+受限生长条件具有挑战性。Zn2+ 污染可能来自多个来源，尽管最重要且最常见的污染和变异来源是用于冲洗实验器具和配制培养基的超纯水。超纯水系统应得到妥善维护，并在冲洗实验器具或用于配制培养基前，先放水冲洗1分钟。未用超纯水充分清洗或冲洗的烧瓶可能导致锌2+ 污染，这会表现为同一批ZLM中某些培养瓶的细胞密度增加，而其他培养瓶则无此现象。可使用全新的培养瓶来评估Zn的来源是否存在问题2+ 污染来自重复使用的烧瓶或培养基。Zn2+ ZLM 中的污染应通过增加用于制备培养基的物品的冲洗次数，以及使用专门的一套材料来制备 ZLM 予以纠正。如果这些措施均无法成功获得预期的生物指示剂表型，则 [Zn2+] 在超纯水中，应定量检测ZLM，以排除水源为Zn的可能性2+-污染。如先前报道，[Zn2+ZLM 的浓度为 115 ± 37 nM23，且浓度低于 70 nM 和高于 150 nM 通常会导致 Zn2+-耗尽的和Zn2+-污染的表型。然而，良好的培养基制备仅是影响实验结果的因素之一，锌（Zn）添加不足或过量同样会产生影响2+ 可能由于接种物制备和/或培养过程不当所致，例如锌的倾倒不充分2+-洗涤步骤中使用完全培养基。所有 M. smegmatis 此处所包括的培养物均以相同方式制备——Zn2+-污染的（ZLM-C）和 Zn2+-耗尽型（ZLM-D）培养结果被纳入分析，以突出即使实验操作正确，使用同一超纯水系统制备的不同批次培养基之间仍可能出现的差异性。
为确保在ZLM中培养细胞能够获得可重复的Zn结果2+-限制性生物指示表型，需对烧瓶进行唯一标识，始终将其用于相同条件（即使用ZLM或ZRM），在多次使用过程中追踪烧瓶，并处理已达到使用寿命终点或持续产生Zn的烧瓶2+- 使用ZLM处理受污染的生物指示表型。正确的接种物制备对于实现Zn的准确检测至关重要2+限制生长，因为锌（Zn）2+ 未充分洗涤的种子细胞残留是锌污染的常见来源2+-难以从锌中区分的污染2+污染的ZLM。 M. smegmatis 培养物应在ZLM（以及平行培养的ZRM）中生长72小时后进行检测和收获。形态发生及生物指示表型在48至72小时期间表现显著；因此，应在此期间对培养物进行评估或收获以检测Zn2+ 过早（或过晚）的限制可能无法产生完整的生物指示表型。锌耗尽的培养物2+ 将表现出与锌（Zn）处理组相似的细胞长度2+-污染；因此，F420 荧光和OD600 应使用该方法来区分两者。同样，Zn2+受污染的培养物的生长情况可能并不总是优于Zn2+-受限细菌，但F420 荧光以及野生型和Δ突变株的细胞长度altRP 突变体应揭示Zn2+-限制条件达到。
M. tuberculosis 同样如此，因为在 Zn2+ 限制性培养条件下，ZLM 培养基中生长 8 至 10 天时，F420 生物指示表型的丧失现象尤为明显。尽管 M. tuberculosis 并未表现出像 M. smegmatis 那样显著的 Zn2+ 限制性生物指示表型，但本文所述的培养方法已用于通过功能测定和转录组学分析，在 M. tuberculosis 的致病株和减毒株中将 F420 生物指示表型的丧失与 Zn2+ 限制性生长相关联（参考文献23及未发表数据）。因此，监测 F420 荧光是一种可行的方法，可用于观察并验证 M. tuberculosis 中的生物学 Zn2+ 限制条件。需要特别指出的是，Zn2+ 限制条件下导致 F420 荧光减弱的具体机制尚不明确，目前也无法确定荧光减弱是由于辅酶池整体丰度下降，还是因其氧化还原状态发生改变所致，因为只有氧化态形式才会发出荧光29。
如本文所示，制备Zn2+-限制性培养基具有一定的复杂性，即使遵循相同的方案并使用相同的试剂，仍有许多因素可能影响培养基中Zn2+离子的有效浓度。ZLM中微量的Zn2+足以支持细菌的充分生长以及Zn2+-限制表型的表达。这种通过逐步降低Zn2+浓度以实现限制的方式，类似于Wayne的缺氧模型，即细菌在密闭烧瓶中生长时逐渐消耗氧气30。由于缺氧和Zn2+-限制表型均依赖于细菌的生长，如果接种物或培养基中的氧气（或在此模型中的Zn2+）不足，细菌将在启动相应的形态发生程序之前停止生长。因此，尽管在需要实现Zn2+限制时Zn2+污染问题更为明显，但Zn2+过度耗竭也可能导致生长受阻，并在活跃生长期错过Zn2+依赖性的诱导信号，从而带来问题。此外，使用基于单色器或滤光片的酶标仪，无论采用顶部还是底部读数模式检测荧光强度，都会对计算出的F375/420比值产生轻微影响。因此，不同实验室获得的数据可能无法与本文所展示的结果直接比较，但应具有相似性并呈现相同的变化趋势。因此，各实验室应根据自身的超纯水系统对制备可产生Zn2+-限制性生长的ZLM的方法和操作流程进行优化，并应以本文所提供的生物指示表型作为定义Zn2+-限制条件的标准。
由于在标准化和重复性方面存在困难，锌2+-受限的生长条件，一种可及的方法以克服锌2+ 污染的解决方法是在未额外添加锌的培养基中加入螯合剂2+然而，这种方法混淆了对锌的真实生物学响应2+ 局限性，常常导致锌（Zn）缺乏的环境2+ 和其他微量营养素。即使是 Zn2+-特异性螯合剂被证明可上调对铁饥饿的响应，此外还有锌2+依赖性转录应答在 M. tuberculosis23此外，使用螯合剂时需要精确的滴定和时机控制，以避免严重的锌缺乏2+-缺乏的环境，无法反映从 Zn 转换期间的生物学响应2+锌充足2+-有限条件或在游离锌受限环境中持续生长的能力2+ 可用性。最后，添加螯合剂可能与后续应用（例如巨噬细胞或动物感染实验）不兼容。关于使用螯合剂与逐步去除 Zn²⁺ 所获得的 Alt-核糖体在形态与功能上的差异，已有截然不同的结论。2+ 在活跃生长的培养物中耗尽17,24此处强调的是，即使实验操作正确，不同批次培养基中水质纯度的微小差异也会导致不同的表型结果。本文介绍了一种可量化、可重复且具有生物学意义的Alt-核糖体生成系统，即.， 在 Zn2+在不添加螯合剂的情况下培养有限的野生型细胞，该标准化方法对于整合领域内的研究成果、深入理解替代核糖体生物学至关重要。

锌离子（Zn2+锌（Zn）是一种必需的微量元素，也是微生物培养基的标准组分。然而，许多细菌能够耐受 Zn2+ 环境中的锌限制2+限制性条件普遍存在；土壤1，海洋2以及宿主内的生态位3 通常为 Zn2+-受限。因此，大多数细菌已进化出机制以克服锌2+ 局限性并维持细胞功能4. 参与维持锌稳态的系统2+ 稳态受到严格的转录调控5 并参与清除 Zn2+ 使用高亲和力 Zn2+ 导入系统，动员细胞内锌2+ 储备，并替换某些 Zn2+-与替代性 Zn 结合的蛋白质2+-非依赖型旁系同源基因6后一种情况的一个示例是 Zn2+-非依赖的核糖体蛋白（RPs）旁系同源基因，这在Zn中是一种常见特征2+细菌中的响应性调控子4. 这些高度分歧的 Zn2+-独立的 RPs 与它们的 Zn 相区别2+通过破坏Zn来结合旁系同源物2+结合CXXC基序7超过一半的已测序原核生物基因组中包含至少一对重复的核糖体蛋白（RPs），其中，&#160;在许多情况下，一个RP结合Zn2+，而其旁系同源基因则不会8. 虽然C+/C-表示法（表示富含半胱氨酸的Zn2+结合基序）通常用于指代这些旁系同源的核糖体蛋白（RP）配对7，Zn2+-独立的RPs也被描述为初级（Prim）Zn的替代（Alt）版本2+结合RP旁系同源物，因为AltRPs在Zn条件下作为核糖体生物合成的替代RP2+-limited 条件在某些细菌中具有重要意义，且该关键词具有更优的检索性9,10,11.
由于AltRP的表达受到Zn2+的严格调控，因此可以合理推测，在Zn2+受限的情况下，AltRP的表达在功能上可对依赖Zn2+的核糖体蛋白起到冗余作用。事实上，这一特性已在模式土壤细菌Bacillus subtilis中得到证实：在Zn2+受限条件下，通过释放表面的原核核糖体蛋白（PrimRP）L31并以替代性核糖体蛋白（AltRP）L31取而代之，可恢复其生长12,13。然而，某些AltRP与核心PrimRP为旁系同源，例如S14，这意味着它们的整合是在核糖体生物合成过程中必需的12,13。利用AltRP重建核糖体是一个不可逆且耗能较高的过程。尽管这些核心AltRP可能有助于从核糖体中释放Zn2+，但也有可能部分AltRP在Zn2+受限环境中进化出了额外的功能。这一推测得到了以下观察结果的支持：AltRP与其旁系同源的PrimRP存在显著差异；AltRP基因的序列同源性通常在不同物种间的同源基因中更高，反而低于同一物种内结合Zn2+的PrimRP基因序列7,10。由于编码高度分歧的AltRP的基因处于Zn2+依赖性的转录调控之下，因此它们不受严格调控且高度保守的核糖体超级操纵子所施加的选择压力的影响14。核糖体机器遗传信息与AltRP之间选择压力的解耦，使得这些核糖体蛋白（RPs）的进化轨迹不同于同源的PrimRP，从而可能允许相同AltRP在不同细菌中发生谱系特异性的进化10,15。AltRP在细菌中广泛存在，且其遗传调控与典型核糖体蛋白相分离，这引发了一个有趣的问题：将AltRP整合入细菌核糖体是否赋予了含AltRP的核糖体（即Alt-核糖体）某种特殊性质？
分枝杆菌是研究替代型核糖体（Alt-ribosomes）机制特性的理想细菌类群。首先，分枝杆菌拥有一个高度保守的altRP操纵子，其中包含四个编码替代型核糖体蛋白（AltRPs）的基因：S14-2、S18-2、L28-2 和 L33-28,9。分枝杆菌的AltRPs与其主要核糖体蛋白（PrimRP）同源物存在显著差异；在全部四对PrimRP/AltRP中，某一AltRP基因在不同分枝杆菌物种间的相似性均高于其在同一物种内的PrimRP对应基因10。AltRPs在分枝杆菌内部也表现出谱系特异性的进化特征，例如结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）和牛分枝杆菌（M. bovis）中的AltRPs S18-2和L28-2，其C末端具有其他分枝杆菌中不存在的独特序列10。其次，这一亲缘关系密切的细菌类群中既包含非致病性成员，也包含致病性成员，它们存在于多种多样的环境中，从土壤（例如M. smegmatis）到多种宿主，包括人类（例如M. tuberculosis）、牛类（例如M. bovis）、水生生物（例如M. marinum）以及禽类（例如M. avium）等。分枝杆菌中altRP操纵子的高度保守性、特定AltRP基因的谱系特异性进化，以及该类群成员所处环境的巨大差异，为解析AltRP功能及Alt-核糖体机制特性的保守性与谱系特异性进化提供了独特的机会。尽管原核生物基因组中广泛存在AltRPs，但目前仅在少数几种细菌中对AltRPs和Alt-核糖体的功能进行了研究9,10,11,12,13,16,17,18,19。建立一个标准化系统，并采用特定指标来验证分枝杆菌中Zn2+限制性生长条件，将有助于提升实验结果的可靠性，并推动核糖体研究领域对Alt-核糖体的理解。
Zn2+ 是一种微量元素；因此，即使在配制培养基时未添加 Zn2+，化学试剂和水中微量的 Zn2+ 污染仍会贡献其生物可利用性。水或化学试剂中所含 Zn2+ 的痕量水平在不同实验室之间可能存在显著差异，从而影响 Zn2+ 限制性生长的实验结果。对进行常规生长测定的大多数实验室而言，每次独立配制培养基时都经验性地定量 [Zn2+] 过于繁琐，但若能建立一种机制以彻底消除生长培养基中 Zn2+ 污染的可能性，则具有内在的重要价值。为此，本文提供了一种详细的方法，用于制备化学成分明确的 Zn2+ 限制性培养基（ZLM）、培养容器以及种子培养物，以实现 M. smegmatis 和 M. tuberculosis 的 Zn2+ 限制性生长及替代型核糖体（Alt-ribosome）的生产。在 ZLM 中培养后，通过检测关键的形态发生特征（以 OD600 测定的细胞密度、细胞长度以及辅酶 F420 的荧光强度）来验证是否成功实现了 Zn2+ 限制。辅酶 F420 是一种脱氮蝶呤辅因子，在产甲烷菌和分枝杆菌的分解代谢及抗氧化应激防御中具有重要作用20,21。重要的是，由于该辅因子含量丰富，分枝杆菌在 420 nm 激发光照射下会呈现自发荧光22。尽管 [Zn2+] 与 F420 荧光之间的分子关联尚不明确，但监测培养物中 F420 荧光是一种可行且可靠的生物指示方法。
在 M. smegmatis 中，生物指示表型出现在野生型细菌中，而缺失 altRP 操纵子的缺失突变株则不会经历相同的形态发生程序，因此可作为差异性生物指示剂10。&#160;尽管 M. tuberculosis 在 Zn2+ 限制条件下不表现出与 M. smegmatis 相同的形态发生程序，但 M. tuberculosis 对 Zn2+ 限制具有强烈且全局性的响应，并在此方法下表现出关键的生物指示表型23。因此，本文所定义的系统能够在相同的生长条件（即 Zn2+ 限制）下生成 Prim-和 Alt-核糖体，从而有助于解析 Alt-核糖体功能及其在塑造细菌生理过程中的作用。该生长方法已被用于解析活性 Alt-核糖体的结构，并证明其在野生型 M. smegmatis 中的翻译活性24。 进一步支持该生长方法和生物指示表型能够凸显 AltRP 在 Zn2+ 限制期间生物学功能的是：AltRP 的表达对于 Zn2+ 依赖的形态发生至关重要，并对 Zn2+ 限制条件下的 M. smegmatis 转录组和蛋白质组产生显著影响10,25。 相同的方法经过对接种量和培养时间的微小调整后，也可用于生成 Zn2+ 限制条件下的 &#160;M. tuberculosis 培养物9,23。本文详细描述了在 M. smegmatis 和 M. tuberculosis 中实现 Zn2+ 限制性生长的实验方案及生物指示表型，重点放在 M. smegmatis 上，因为该细菌对培养基中的 Zn2+ 污染更为敏感，且相较于生长缓慢的病原体更易于获得。

<table><tbody><tr><td>1000 mL 真空过滤系统，标准系列</td><td>VWR</td><td>10040-440</td><td></td></tr><tr><td>125 mL 锥形摇瓶</td><td>Greiner Bio-One</td><td>679501</td><td></td></tr><tr><td>14 mL 培养管，塑料，带双位置盖</td><td>VWR</td><td>60818-725</td><td></td></tr><tr><td>250 mL 锥形摇瓶</td><td>Greiner Bio-One</td><td>679502</td><td></td></tr><tr><td>40X-1000X 实验室双目光学生物显微镜</td><td>Omax</td><td>M82EZ</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 生物反应管，无菌</td><td>VWR</td><td>76211-286</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 高性能离心管，带标志盖</td><td>VWR</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>Alcojet 低泡粉末洗涤剂</td><td>Alconox</td><td>1404</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸铁铵（III），棕色</td><td>Thermo Scientific</td><td>AAA1119930&amp;nbsp;</td><td>分子量：265 g/mol，配制 1M 溶液时将 1.325 g 加入 5 mL 超纯水中；避光保存于 4 °C</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Thermo Scientific</td><td>J10857-A1</td><td></td></tr><tr><td>D-泛酸钙</td><td>Thermo Scientific</td><td>AC243300050</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1345-10G</td><td></td></tr><tr><td>无水柠檬酸，结晶状</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP339-500</td><td></td></tr><tr><td>无水葡萄糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>D14-500</td><td></td></tr><tr><td>Difco Middlebrook 7H9 肉汤</td><td>BD Diagnostics</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>DiluPhotometer OD600，用于细胞密度测定和 Bradford 检测</td><td>Implen</td><td>OD600-10</td><td></td></tr><tr><td>GENios FL 微孔板读板仪</td><td>Tecan</td><td></td><td>已停产</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>Infinite M200 PRO 多功能微孔板读板仪</td><td>Tecan</td><td>LGE140213-20BL</td><td></td></tr><tr><td>L-天冬酰胺</td><td>Thermo Scientific</td><td>AAB2147336&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>L-亮氨酸</td><td>Thermo Scientific</td><td>A1231122</td><td></td></tr><tr><td>Macrofire SP CCD 相机</td><td>Optronics</td><td></td><td>与 Olympus 显微镜配合使用</td></tr><tr><td>七水硫酸镁</td><td>VWR</td><td>97062-134</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Direct 8 水纯化系统</td><td>Millipore</td><td>C85358</td><td></td></tr><tr><td>Moticam X3</td><td>Motic</td><td></td><td>已停产，由 Moticam X5 Plus 取代；与复合显微镜配合使用</td></tr><tr><td>油酸</td><td>Thermo Scientific</td><td>031997-14</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX51 正置显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td>已停产，由 BX53M 取代</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>半微量双面一次性塑料比色皿</td><td>VWR</td><td>97000-590</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠，晶体</td><td>VWR</td><td>VW1494-01</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>吐温 80</td><td>MP Biomedicals</td><td>103170</td><td></td></tr><tr><td>七水硫化锌，结晶状/ACS 级</td><td>MP Biomedicals</td><td>219145290</td><td></td></tr></tbody></table>

使用mycobacterium smegmatis作为分枝杆菌锌限制生长条件下的一种生物指示剂

Using Mycobacterium smegmatis as a Bioindicator for Zinc-Limited Growth Conditions in Mycobacteria

许多细菌在锌缺乏条件下构建替代型核糖体2+通过替换锌实现限制性生长条件2+与锌结合的核糖体蛋白2+-非依赖型旁系同源基因。由于Zn2+ 实验室中的污染很常见。为解决这一问题，有时会在培养基中添加螯合剂，但这种方法会干扰生物体对逐渐变化的 Zn 的生理响应2+&#160;局限性，并与核糖体休眠相关。本文详细介绍了用于锌2+-limited 条件下生长，而无需添加螯合剂。采用该方法，模式细菌 Mycobacterium smegmatis，经历依赖于替代核糖体的形态发生。由于形态发生在锌存在时可被调控且仅在锌条件下发生2+限制性条件， M. smegmatis 可作为生物指示剂，用于验证具有生物学意义的生长条件。三种生物指示表型（细胞密度、细胞长度和辅酶F420 荧光）来指示 Zn2+ 野生型中的限制因素被描述，并概述了无法构建替代核糖体的缺失突变体在这些生物标志物上的变化。由于痕量锌2+ 污染难以在每批培养基中得到有效控制，且锌的精确定量2+ 在每次培养基制备过程中进行检测均过于繁琐，因此监测该生物指示表型是验证锌制备的一种可行方法2+受限生长培养基。为帮助确定Zn的合适培养条件2+-限制性生长和替代核糖体生成过程中，针对锌的生物指示表型变化进行了分析2+-污染或严重含锌2+缺锌的Zn制备物2+-有限培养基中也适用。有关实现 Zn 的更多细节2+限制性生长与替代性核糖体生成 M. tuberculosis 呈现了相关的生物指示表型。总体而言，本文所述的详细操作步骤和生物指示表型将有助于标准化分枝杆菌中具有翻译活性的替代核糖体的制备。

生物指示剂表型 M. smegmatis 
野生型 M. smegmatis 在ZLM中培养并达到Zn的培养物2+-与在锌限制条件下培养的细胞相比，生长受限的细胞表现出三种主要的生物指示表型2+-营养充足条件下：[1] OD值降低600，[2] 细胞伸长，以及 [3] 420 nm 处峰值荧光降低。缺失 AltRPs 的突变体（ΔaltRP) 不具有相同的 Zn2+-依赖的形态发生与野生型相同10, 及其在 Zn 中的独特表型2+-限制性培养基可作为差异性生物指示剂。因此，应首先在ZRM和ZLM中培养的野生型中评估全部三种生物指示指标。如果观察到预期的Zn2+-limited野生型表型被观察到，ΔaltRP 缺失菌株应随后进行评估。在ZLM中生长并不总能达到Zn2+-受限条件，这正是需要生物指示剂的原因。独特的野生型和ΔaltRP 生物指示表型证实了具有生物学意义的Zn2+-limiting 条件未达到。当在 ZLM 中培养的菌株未能达到 Zn2+因锌限制而导致的生长受限2+ 培养基或培养容器中存在污染（ZLM-C）时，这些生物指示表型将变得不那么明显，如图所示 图1 和 图2。相反，如果 Zn 的浓度2+ 在ZLM中锌含量过低时，生长会受到锌的限制2+ 耗竭（ZLM-D），表现为培养物浊度降低和生物指示剂表型改变，详见于 图1 和 图2.
细胞密度是衡量 Zn2+ 限制性的强有力指标。在 ZRM 培养基中培养的菌液在 72 小时后始终达到较高的浑浊度（OD600 超过 5），可能出现聚团现象，并且颜色明显比在 ZLM 培养基中培养的菌液更黄（数据未显示）（图 1A）。与 Zn2+ 充足条件相比，Zn2+ 限制性条件会抑制所有菌株的生长（表现为 OD600 降低），且 ΔaltRP 菌株的细胞密度低于野生型（图 1A）。在 ZLM 培养基中进行 Zn2+ 限制性培养时，野生型菌株的 OD600 始终介于 3.5 以上至 5 以下，而 ΔaltRP 菌株则低于 3（图 1A）。在 ZLM 培养基中因 Zn2+ 污染（ZLM-C）而生长的菌液，其细胞密度（OD600 超过 5）与在 Zn2+ 充足的 ZRM 培养基中培养的菌液相似（图 1A）。若 ZLM 培养基中的 [Zn2+] 过低，菌液将严重缺乏 Zn2+（ZLM-D），导致生长受阻，这在野生型菌株中表现为细胞密度降低（OD600 低于 3；图 1A）。野生型菌株的细胞密度（3.5 &lt; OD600 &lt; 5）应作为验证 Zn2+ 限制性条件的首个生物指示表型检查点。只有达到预期细胞密度的野生型菌液才应被采纳，对 ΔaltRP 菌株的分析应在确认野生型菌株呈现 Zn2+ 限制性生物指示表型之后进行。
在Zn限制的ZLM培养基中培养的野生型静止期培养物2+ 呈细长形，平均细胞长度约为 9 µm，而 Zn2+-在ZRM培养基中培养的完全培养物较短，平均细胞长度约为 3 µm (图1B）。在含锌的ZLM中培养的野生型菌株2+ 污染（ZLM-C）不能完全伸长，但略长于 Zn2+-补充完全的细胞，其平均细胞长度为 5 µm锌的生物指示2+ 整批ZLM出现污染表明可能在制备过程中发生了污染，而个别培养物（即培养瓶）中的污染则表明是由于培养瓶清洗不当或培养操作过程中引入污染。在锌严重缺乏的ZLM中培养的野生型培养物2+ (ZLM-D) 的伸长程度较低，平均细胞长度约为 7 µm (图1B）。在突变体中未观察到野生型的细长表型 ΔaltRP 菌株，以及 ΔaltRP 锌受限的细胞2+ 平均细胞长度约为 5 µm (图1B). 图2 显示在不同制备的ZLM或ZRM中培养的细胞（经步骤2处理后）的代表性图像，使用复式光学显微镜观察。经步骤4处理后，来自如图所示视野中的多个区域的细胞 图2 用于计算图中所示培养物的平均细胞长度 图1B. 野生型的伸长表型特异性地依赖于 Zn2+限制性条件；当培养物处于锌限制条件下时，不会观察到细胞伸长2+-锌充足或严重缺锌2+-耗竭的（图1B 和 图2).
F 水平降低420 荧光生物指示表型在荧光扫描中观察效果最佳（图1C）。辅因子F的荧光降低420 通过计算375 nm（背景）与420 nm（辅因子F的自发荧光）处荧光强度的百分比来进行定量420) 如步骤 3.16.5 所述，表示为 F375/420对于不具备荧光扫描功能的单色酶标仪，可在375 nm和420 nm处（两者发射波长均为475 nm）进行单点读数，用于计算F375/420. 在含锌培养基中培养的野生型菌株2+- 充足条件（即在 ZRM 中）具有高度可重复的 F375/420 约 17% (图1D）。F的减少420 Zn中的荧光2+在ZLM中培养的有限培养物表现出F的增加375/420 约 27%（图1D）。F420 Zn中的荧光2+受限的 ΔaltRP 在相同条件下，该菌株的荧光强度显著低于野生型，这一点在荧光扫描图中可直观观察到（图1C）。F375/420 在 Zn 中更具变异性2+-limited ΔaltRP 菌株，范围约为50%-80%（图1D）。在ZLM培养基中培养但显示出Zn生物指示现象的培养物2+ 污染（ZLM-C）已降低 F375/420 至约21%，且为Zn的培养物2+-耗尽的（ZLM-D）具有 F375/420 约 35%（图1D).
总之，应在野生型和Δ突变体中评估三种生物指示表型altRP 菌株以验证 Zn2+-在ZLM中培养的培养物的限量状态。生物指示剂应如下所述，以适用于具有生物学相关性的Zn2+限制性生长：[1] OD600 野生型的值为3.5 - 5，而ΔaltRP 应变小于3，[2] 野生型细胞约为 10 µm 长，和 ΔaltRP 细胞长度为原来的一半，且 [3] F375/420 Δ的altRP 应变较高，即超过 50%。
生物指示剂表型 M. tuberculosis 
Zn2+受限 M. tuberculosis 不表现出相同的形态发生程序 M. smegmatis. 具体而言，OD值无差异600 Zn之间2+-充足和Zn2+有限培养，以及 Zn2+-有限培养物未表现出任何明显的形态学表型，即它们不会伸长23同样，不存在 Zn2+耗竭的生物指示表型（即细胞密度降低）在 M. tuberculosis 如所观察到的那样 M. smegmatis. Zn2+-limited 培养物相较于 Zn 培养物表现出更明显的聚集现象2+-充足培养物相比，两种条件下在第10天时均表现出明显的结团现象（在Mtb-H37Rv和Mtb-Aux中均观察到）。Zn的关键生物指示表型2+ 局限性在 M. tuberculosis 峰F降低420 荧光，如先前报道的那样23培养8天的结果被呈现于此，以替代10天的培养结果，旨在减少团块形成。荧光强度降低F420 Zn中可见荧光2+-有限培养物，包含单色光（图3）以及滤光片型酶标仪。对于滤光片型酶标仪，使用结核分枝杆菌H37Rv，Zn2+-limited培养物（即在ZLM中培养）的原始荧光值约为Zn培养物的50%2+-完全培养的菌液（即在ZRM中培养；数据未显示）。使用单色酶标仪、底部读数模式以及Mtb-Aux、Zn2+-完全培养的培养物具有 F375/420 约75%，以及Zn2+-受污染的ZLM培养物具有相似的数值。F降低420 锌的荧光2+在ZLM中培养的有限培养物通过F体现375/420 超过100%。Zn2+-limited ΔaltRP 菌株具有相似的生长和F420 Zn中观察到的荧光2+-limited 野生型（图3）且不能作为生物指示剂使用 M. tuberculosis 因为它在 M. smegmatis (图1）。因此，建议对将用于培养的培养基进行测试 M. tuberculosis 随着快速增长的 M. smegmatis
<img alt="细菌研究中的生长曲线、长度分布及荧光分析；图表与箱线图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67274/67274fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1生物指示表型 M. smegmatis 在锌条件下培养2+ 局限性及锌的影响2+ 污染与 Zn2+ 耗竭对表型的影响。 各图中所示的生物指示表型代表性实例均来自72小时的相同培养物。锌的实例2+-污染的（ZLM-C），Zn2+-受限（ZLM-L）和 Zn2+-耗尽（ZLM-D）生长结果来自独立的培养基制备，所有制备均遵循本文所述的相同制备方法（步骤2）。Zn的代表性表型2+有限的野生型和ΔaltRP 菌株均来自同一批次的ZLM。所有菌株和条件均设有三个生物学重复（n=3）。A生长曲线显示在600 nm处检测的光密度（OD600) 并通过 Zn 降低细胞密度2+ 局限性与耗竭。误差线表示重复样本之间的标准差。 (B野生型和Δ突变体的细胞长度altRP 表现出锌诱导伸长表型的菌株2+-有限的野生型。箱线图显示了细胞长度的四分位距、最小值、最大值和中位数 µm. (C) 培养物的代表性荧光扫描图显示峰值 F 减弱420 荧光与 Zn2+ 局限性与减弱的 F420 锌中的荧光2+受限的 ΔaltRP 菌株。每种不同培养基制备条件下，仅展示生物学重复三次中的一个代表性培养结果。荧光扫描采用230 nm至440 nm的激发波长范围，步长为5 nm，发射波长为475 nm。左上方所示平面图是Zn的局部放大视图2+-有限的野生型和ΔaltRP 菌株以凸显在 Zn 存在下 420 nm 处荧光峰的降低2+受限的 ΔaltRP 应变。坐标轴单位与主图相同。所有图例均与 (A) 中相同。 (D) 辅因子F荧光降低的定量分析420，由F的百分比计算得出375/420. 百分比根据 (C) 中荧光扫描获得的数值计算得出。箱线图显示了四分位间距、最小值、最大值和中位数百分比。代表 Zn 的缩写2+培养基类型后括号内提供的相关状态为：R = Zn2+-充足，C = Zn2+-污染，L = Zn2+-受限，且 D = Zn2+-耗尽，其他缩写包括：WT = 野生型菌株，a.u. = 任意单位 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67274/67274fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Zn²⁺-状态电泳结果，WT 与 ΔaltRP，蛋白质分离分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67274/67274fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：M. smegmatis 在 72 小时的代表性显微镜图像。 图像来自 图 1 所示的培养物。细胞使用复合光学显微镜在 1000× 总放大倍数下成像，物镜为 100× 油浸镜头。比例尺为 10 µm。括号中列于培养基类型后的 Zn2+ 相关状态缩写分别为：R = Zn2+-充足，C = Zn2+-污染，L = Zn2+-限制，D = Zn2+-耗尽；其他缩写为：WT = 野生型菌株。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67274/67274fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="荧光激发光谱图；波长与荧光关系；蛋白质研究分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67274/67274fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：在锌离子（Zn2+）限制条件下，M. tuberculosis 中 F420 生物指示表型的丧失，通过营养缺陷型 Mtb mc26206（Mtb-Aux）的代表性荧光扫描图展示。锌离子（Zn2+）污染与锌离子（Zn2+）限制条件下的生长结果来自独立制备的培养基。锌离子（Zn2+）限制的野生型及 ΔaltRP 菌株来自同一批 ZLM 培养基。所有菌株和条件均设有三个生物学重复（n=3）。图中仅展示每次不同培养基制备及菌株中三个生物学重复之一的代表性培养结果。荧光扫描在培养 8 天后采用底部读数模式进行，激发波长范围为 230 nm 至 440 nm，步长为 5 nm，发射波长为 475 nm。括号中紧接培养基类型后标注的缩写表示培养基中与锌离子（Zn2+）相关的状态：R = 锌离子（Zn2+）充足，C = 锌离子（Zn2+）污染，L = 锌离子（Zn2+）限制，D = 锌离子（Zn2+）耗尽；其他缩写为：WT = 野生型菌株，a.u. = 任意单位。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67274/67274fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案详细介绍了Zn的制备方法2+-受限培养基、培养容器和种子培养物以生产 Zn2+-结核分枝杆菌中受限制的核糖体。微量的Zn2+ 导致 Zn2+限制生长，我们描述了用作生物指示剂以验证锌的形态发生特征2+ 局限性 体外 在模式细菌中， 耻垢分枝杆菌， 以及人类病原体 M. tuberculosis.

使用Mycobacterium smegmatis作为分枝杆菌锌限制生长条件下的一种生物指示剂

许多细菌在锌离子（Zn2+）限制性生长条件下，通过用不含锌结合能力的同源蛋白替代锌结合型核糖体蛋白，构建出替代型核糖体。

因此，我们的研究关注的是细菌在锌限制条件下的适应机制，这些机制超出了单纯的锌保存。我们采用致病性细菌结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）和非致病性细菌耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis），以研究锌限制如何影响细菌生理学和致病性等过程。另一个我们感兴趣的方向是替代性核糖体蛋白，许多细菌在锌限制条件下会表达这类蛋白，但我们目前对其了解仍然有限。无论是致病性还是非致病性分枝杆菌，均对锌限制表现出显著反应，数百个基因和蛋白质的表达水平受到微量元素锌的可利用性影响。在生理层面，这导致耻垢分枝杆菌发生显著的形态发生改变，并在耻垢分枝杆菌和致病性结核分枝杆菌中均显著上调氧化应激反应。本实验方案旨在解决在分枝杆菌中产生具有翻译活性的替代核糖体时，锌限制性生长条件难以重复和标准化的问题。我们观察到一些不可控因素，例如强降雨事件，与锌污染及限锌培养基的制备相关。本文所描述的生物指示表型可确保锌限制生长结果的可重复性。此处所述的可量化生物指示表型，能够在不使用螯合剂的情况下实现锌限制条件。因此，该技术能够实现具有翻译活性的替代核糖体的标准化制备，并可用于后续应用，例如巨噬细胞或动物感染实验，以研究宿主与病原体之间的相互作用。我们实验室目前正在致力于解析每种替代核糖体蛋白的特定功能，以及这些蛋白整合到核糖体中如何影响翻译过程。同时，我们也在探索在耻垢分枝杆菌（M. smegmatis）中获得的研究结果是否同样适用于结核分枝杆菌（MTB），以及这些发现是否可用于开发更有效的结核病治疗方案。首先，向一个50毫升的生物反应管中加入5毫升7H9-ADC培养基。然后加入10微升解冻的耻垢分枝杆菌甘油菌种，并拧紧管盖。将反应管牢固地置于约45度角的位置，在37摄氏度、120转/分钟的条件下振荡培养18小时。孵育后，在600纳米处测定光密度，并确认其值约为0.5至0.8。在3000 × g条件下离心培养物5分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于5毫升锌限制培养基（ZLM）中。离心过程中，用70%乙醇注满比色皿直至溢出，静置10分钟以进行灭菌。随后用ZLM冲洗比色皿三次。最后一次离心后，将细胞沉淀重悬于2毫升ZLM中。使用比色皿中的600微升ZLM空白校正分光光度计。将600微升洗涤后的细胞转移至已灭菌的比色皿中，测定600纳米处的吸光度。如果光密度大于1，则使用给定公式进行计算。为了计算在比色皿中向600微升洗涤后的细胞加入多少体积的ZLM可获得1的光密度，将计算出的ZLM体积加入比色皿中。用移液器吹打5到10次充分混匀，然后重新测定吸光度。接下来，将50毫升ZLM加入无菌、经两次高压灭菌的250毫升塑料锥形瓶中。通过向烧瓶中加入50微升已调节至比色皿光密度为1的培养物来接种。对于含锌完全的培养基，加入30微升10毫摩尔的硫酸锌，以达到6微摩尔的终浓度。将培养物在37°C、100 rpm振荡条件下培养三天，使其进入稳定期。每天生长过程中，取200微升培养物加入96孔平底微孔板中，并使用单色器微孔板读板仪测定生长参数。为报告微孔板读板仪获得的细胞密度，需生成标准曲线，将使用特定体积测得的光程长度读数转换为标准的1厘米光程长度。设置激发波长为420纳米，发射波长为475纳米，以测定辅因子F420的荧光。然后将激发波长设为375纳米，发射波长设为475纳米，以测量背景荧光。在激发波长230纳米至440纳米范围内，以5纳米为步长，固定发射波长为475纳米，进行荧光强度扫描。使用以下公式，计算375纳米至420纳米处荧光强度的百分比。三天后，为记录细胞长度，使用无绒布清洁载玻片和盖玻片。用移液器吸取10 µL培养液滴加到载玻片上，然后盖上盖玻片。轻轻按压盖玻片，使培养液均匀扩散，几乎充满整个盖玻片下方区域。使用配备相机的复合显微镜，采用100倍油镜和10倍目镜，观察制备好的玻片。拍摄多个处于焦平面内且静止不动的细胞区域的图像。使用相同的显微镜和物镜，对校准玻片进行成像。在 Fiji 软件中，选择直线工具，沿校准标尺的长度绘制一条直线。选择“分析”，然后选择“设置尺度”，输入尺度条已知距离的单位数值。接着选择“全局”选项，将该尺度应用于所有图像和测量。现在打开图像，使用直线工具沿细胞长度绘制一条线以测量其长度。将弹出窗口中的细胞长度数据复制到电子表格中，或保存为逗号分隔值文件，以便进行统计分析。在ZLM培养基中培养的野生型菌株表现出较低的光密度值，而ΔaltRP菌株在锌充足培养基中的光密度值更低。在ZLM野生型培养物中观察到细胞伸长，平均细胞长度为九微米，而锌充足条件下的细胞较短，约为三微米。在锌限制条件下，ΔaltRP细胞未表现出显著的伸长。荧光扫描显示ZLM野生型培养物的辅因子F420荧光降低，而ΔaltRP菌株表现出更高的荧光变异性。

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