Name: 基于贻贝 （Mytilus galloprovincialis） 血细胞运动的毒理学和生态毒理学测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-13T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: 了解基于地中海贻贝（Mytilus galloprovincialis）血细胞运动的体外毒理学检测方法。该技术通过延时显微成像和细胞追踪软件评估污染物毒性，为环境生物监测和生态风险评估提供敏感的新型终点指标。

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本研究由意大利大学与研究部授予迪斯特巴（DiSTeBA）的“&#34;Dipartimento di Eccellenza&#34;”项目资助，项目编号CUP: F85D18000130001，以及由欧洲联盟NextGenerationEU计划PNRR资助的国家生物多样性未来中心（NBFC），项目编号CN00000033。我们还感谢萨伦托大学生物与环境科学与技术系的BIOforIU基础设施提供的支持。

所有实验均在意大利动物福利立法（D.L.26/2014）的框架下进行，该法规实施了欧洲委员会理事会指令（2010/63 EEC）。Mytilus galloprovincialis 是一种滤食性双壳类动物，通常称为地中海贻贝。它原产于地中海及欧洲大西洋沿岸南部地区，已被引入并在北美西部、亚洲和南非广泛分布。该物种在全球多个地区是重要的商业渔业资源。所用试剂和设备的详细信息列于材料表中。
1. 人工海水（ASTM）或过滤天然海水的制备
<ol>
	<li>根据 ASTM D1141-98 (2021)32 配制人工海水（ASW）时，将以下盐类溶解于蒸馏水中（每升水中的克数）：27.65 NaCl、0.133 NaHCO3、3.33 MgCl2·6H2O、2.66 Na2SO4、0.733 CaCl2·2H2O、0.466 KCl、0.067 KBr、0.02 H3BO3、0.013 SrCl2·6H2O、0.0019 NaF。ASW 溶液的 pH 值为 7.80。</li>
	<li>配制过滤天然海水（FSW）时，采集未受人为活动影响地点的天然海水（37 PSU），使用 0.2 µm 滤膜进行过滤。</li>
</ol>
2. 动物适应
<ol>
	<li>将成年贻贝样本（Mytilus galloprovincialis Lam.）在恒温室内含曝气人工海水（ASW）或过滤海水（FSW）的静水培养箱中驯化24小时（每只动物1升，期间禁食），温度保持在15 °C，用于后续实验。</li>
</ol>
3. 血细胞运动性评估的试剂制备
<ol>
	<li>按上述方法制备过滤海水（FSW）或标准生理盐水（SPS）。将4.77 g HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸）、25.48 g NaCl、13.06 g MgSO4、0.75 g KCl 和 1.47 g CaCl2 溶解于约800 mL蒸馏水中，再加蒸馏水定容至1 L。用1 M NaOH调节pH至7.36。</li>
	<li>用二甲基亚砜（DMSO）配制20 mg/mL中性红储备液。</li>
	<li>配制中性红染色液：取5 µL中性红储备液加入995 µL FSW或SPS中。</li>
	<li>配制含2 mM L-谷氨酰胺、40 IU/mL青霉素G和100 µg/mL链霉素的FSW或SPS：向10 mL FSW/SPS中加入100 µL 2 mM L-谷氨酰胺溶液和100 µL青霉素/链霉素混合液。</li>
	<li>用FSW或SPS配制0.4%台盼蓝溶液。 
	注意：中性红储备液的配制参照Martínez-Gómez等33的方法。中性红储备液在4 °C保存时可稳定2–3周。中性红染色液和0.4%台盼蓝溶液应在使用前新鲜配制。</li>
</ol>
4. 血淋巴取样
<ol>
	<li>用注射器预先吸入 0.5 mL 过滤海水（FSW）或标准生理盐水（SPS）（15 °C 下）。</li>
	<li>用解剖刀沿腹面轻轻且小心地撬开贝壳瓣。保持解剖刀位置不动，或使用移液器吸头固定开口。将皮下注射器的针头插入两瓣壳之间的空隙。</li>
	<li>根据 UNEP/RAMOGE34 的方法，用预先装液的注射器从后闭壳肌中缓慢吸取 0.5 mL 血淋巴。</li>
	<li>将针头从注射器上取下，并将注射器内的液体转移至微量离心管中。</li>
	<li>从 3–4 只贻贝中采集血淋巴，并在 15 °C 下按个体间的相同比例将样品混合于同一管中。 
	注意：预先在注射器中装液可在采样时立即将血淋巴以 1:1 比例稀释。根据 Martínez-Gómez 等人33 的研究，使用 FSW 或 SPS 以 50:50 比例稀释血淋巴是防止血细胞聚集的常用方法。</li>
</ol>
5. 血细胞铺板与培养
<ol>
	<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数。</li>
	<li>用 FSW 或 SPS 将血淋巴稀释至浓度为 1 × 106 个细胞/mL。</li>
	<li>通过台盼蓝染色法评估悬浮血细胞的活力：将 100 µL 溶于 FSW 或 SPS 中的 0.4% 台盼蓝溶液加入 100 µL 血细胞悬液中，于 15 °C 孵育 5 分钟。</li>
	<li>随后，取一滴悬液加入血细胞计数板中，在显微镜下观察并计数未染色（有活力）和已染色（无活力）的细胞。</li>
	<li>根据所计数细胞总数中活细胞所占比例评估血细胞活力35。</li>
	<li>使用以下公式进行细胞活力评估35： 
	活细胞百分比 (%) = [活细胞数 / 总细胞数（活细胞 + 无活力细胞）] × 100</li>
	<li>确保血细胞活力高于 95%，方可继续后续实验步骤。</li>
	<li>将 50 µL 稀释后的血淋巴加入细胞培养用 96 孔平底聚苯乙烯 TC 处理微孔板的每个孔中，并盖上盖子。</li>
	<li>于 15 °C 静置 30 分钟，使血细胞贴附于孔底形成单层细胞。</li>
	<li>用微量移液器轻轻吸除多余的血淋巴。</li>
</ol>
6. 短期检测
<ol>
	<li>对于短期实验（1–4 小时内），立即将贴壁于孔板底部的细胞与 100 µL 溶于 FSW 或 SPS 中的不同浓度待测物质在 15 °C 下孵育。每种实验条件至少使用三个孔，进行三次重复测定。</li>
	<li>孵育结束后，按照步骤 8 评估细胞运动能力。</li>
</ol>
7. 长时间暴露实验
<ol>
	<li>对于长时间暴露实验，即24-48小时暴露实验，将培养的贴壁细胞与溶于培养基（FSW或ASW）中并添加有2 mM L-谷氨酰胺、40 IU/mL青霉素G和100 µg/mL链霉素的不同浓度待测物质在15°C条件下共同孵育。每种实验条件至少使用三个孔，进行三次重复测定。</li>
	<li>孵育结束后，按照步骤8评估细胞运动能力。</li>
</ol>
8. 利用延时显微镜评估细胞运动性
<ol>
	<li>将含有贴壁活体血细胞的多孔板放入多功能酶标仪中。</li>
	<li>通过延时显微镜对多孔板上的细胞进行实时成像，评估贴壁活细胞的运动性：在20倍放大倍数和明场彩色成像条件下，以每分钟1张图像的速率，连续10分钟采集每孔中同一兴趣区域（ROI）的图像（所用ROI尺寸为720 µm × 720 µm）。</li>
	<li>为更清晰地观察血细胞，在延时显微镜成像前使用活体染料中性红对细胞进行染色，步骤如下：
	<ol>
		<li>移除各孔中的培养液。</li>
		<li>向含有贴壁细胞的多孔板各孔中加入100 µL&#160;含待测物质的生理盐水中溶解的中性红染色液&#160;&#160;。</li>
		<li>在15 °C条件下孵育15分钟，随后洗去多余染料。</li>
		<li>加入100 µL溶于过滤人工海水（FSW）或标准生理盐水（SPS）中的待测物质。对细胞进行成像以评估其运动性。 
		注：使用多功能酶标仪可同时从大量孔中获取图像，从而实现对所有实验条件及重复样本中细胞运动性的同步检测。中性红染料会被溶酶体摄取并在其中蓄积，表现为细胞质内微小的橙色斑点，而细胞核因嗜酸性活体染料不对其进行染色而呈现为透明空洞。图像采集在室温20 °C下持续进行10分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 细胞追踪与速度测量参数的计算
<ol>
	<li>使用 ImageJ 对每个孔中在延时显微镜下获取的相同感兴趣区域的图像帧进行分析。</li>
	<li>将图像保存在名称中不含空格的文件夹中。图像格式可为 JPEG 或 PNG。</li>
	<li>打开 ImageJ。点击 文件 &#62; 导入 &#62; 图像序列。</li>
	<li>使用 ImageJ 的 手动追踪 插件对单个细胞进行细胞追踪。在连续图像中标记单个细胞的位置，从而实现对细胞位置随时间变化的追踪。</li>
	<li>每孔至少分析 40 个细胞，排除离开记录视野的细胞。</li>
	<li>将来自 ImageJ 插件&#34;Manual Tracking&#34;的数据集导入免费的 Chemotaxis and Migration Tool 软件中。</li>
	<li>使用 Chemotaxis and Migration Tool 软件，根据该软件免费提供的用户指南36中的详细说明或以下步骤，量化诸如平均速度、欧几里得距离、迁移距离和方向性等速度参数：
	<ol>
		<li>将来自 ImageJ 插件&#34;Manual Tracking&#34;的数据集导入 Chemotaxis and Migration Tool 软件。</li>
		<li>选择所需的切片数量（例如，用于追踪的图像数量）。</li>
		<li>通过设置 x/y 像素大小和时间间隔来校准软件。x/y 校准表示像素边长（单位为 µm），时间间隔表示每张图像之间的时间间隔。</li>
		<li>调整参数和数值后，点击 应用设置。</li>
		<li>绘制轨迹并导出为图像。点击 测量值 按钮查看测量结果，并保存数据。</li>
		<li>点击 统计 按钮，保存轨迹序列的速度和方向性数据。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>比较对照组细胞与在不同浓度测试物质处理下的血细胞所计算出的速度参数。 
	注：迁移距离（单位为 µm）指观察期间（10 分钟）细胞迁移路径的总长度。欧几里得距离（同样以 µm 为单位）指细胞起始点与终点之间的直线距离。平均速度（单位为 µm min-1）通过每个细胞的迁移距离除以追踪持续时间计算得出。方向性定义为每条轨迹的欧几里得距离与总迁移距离的比值。</li>
</ol>

<ol><li>Di Paolo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioassay+battery+interlaboratory+investigation+of+emerging+contaminants+in+spiked+water+extracts+-+Towards+the+implementation+of+bioanalytical+monitoring+tools+in+water+quality+assessment+and+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Bioassay battery interlaboratory investigation of emerging contaminants in spiked water extracts - Towards the implementation of bioanalytical monitoring tools in water quality assessment and monitoring.</a> Water Res. 104, 473-484 (2016).</li>
<li>Brack, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect-based+methods+are+key.+The+European+Collaborative+Project+SOLUTIONS+recommends+integrating+effect-based+methods+for+diagnosis+and+monitoring+of+water+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Eur%22%5BJournal%5D)">Effect-based methods are key. The European Collaborative Project SOLUTIONS recommends integrating effect-based methods for diagnosis and monitoring of water quality.</a> Environ Sci Eur. 31 (1), 10(2019).</li>
<li>Lionetto, M. G., Caricato, R., Erroi, E., Giordano, M. E., Schettino, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+application+of+carbonic+anhydrase+activity+in+bioassay+and+biomarker+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Ecol%22%5BJournal%5D)">Potential application of carbonic anhydrase activity in bioassay and biomarker studies.</a> Chem Ecol. 22 (sup1), S119-S125 (2006).</li>
<li>Lionetto, M. G., Caricato, R., Giordano, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pollution+biomarkers+in+the+framework+of+marine+biodiversity+conservation%3A+State+of+art+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Water%22%5BJournal%5D)">Pollution biomarkers in the framework of marine biodiversity conservation: State of art and perspectives.</a> Water. 13 (13), 1847(2021).</li>
<li>Connon, R. E., Geist, J., Werner, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect-based+tools+for+monitoring+and+predicting+the+ecotoxicological+effects+of+chemicals+in+the+aquatic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Effect-based tools for monitoring and predicting the ecotoxicological effects of chemicals in the aquatic environment.</a> Sensors. 12 (9), 12741-12771 (2012).</li>
<li>Fabbri, E., Valbonesi, P., Moon, T. W. Pharmaceuticals in the marine environment: Occurrence, fate, and biological effects. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFabbri%2C+E+%22Contaminants+of+Emerging+Concern+in+the+Marine+Environment%22">Contaminants of Emerging Concern in the Marine Environment</a>. León, V. M., Bellas, J. Chapter 2, Elsevier. Amsterdam. 11-71 (2023).</li>
<li>Lionetto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescence+of+model+polyethylene+terephthalate+nanoplastics+for+cell+interaction+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomaterials%22%5BJournal%5D)">Autofluorescence of model polyethylene terephthalate nanoplastics for cell interaction studies.</a> Nanomaterials. 12 (9), 1560(2022).</li>
<li>Damiens, G., Gnassia-Barelli, M., Loquès, F., Roméo, M., Salbert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+biomarker+response+index+as+a+useful+tool+for+environmental+assessment+evaluated+using+transplanted+mussels%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Integrated biomarker response index as a useful tool for environmental assessment evaluated using transplanted mussels.</a> Chemosphere. 66 (3), 574-583 (2007).</li>
<li>Ogidi, O. I., Onwuagba, C. G., Richard-Nwachukwu, N. Biomonitoring tools, techniques and approaches for environmental assessments. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOgidi%2C+OI+%22Biomonitoring+of+Pollutants+in+the+Global+South%22">Biomonitoring of Pollutants in the Global South</a>. Izah, S. C., Ogwu, M. C., Hamidifar, H. , Springer. Singapore. (2024).</li>
<li>Rosner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+broad-taxa+approach+as+an+important+concept+in+ecotoxicological+studies+and+pollution+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">A broad-taxa approach as an important concept in ecotoxicological studies and pollution monitoring.</a> Biol Rev. 99 (1), 131-176 (2024).</li>
<li>Gagné, F., Burgeot, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bivalves+in+ecotoxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedia+of+Aquatic+Ecotoxicology%22%5BJournal%5D)">Bivalves in ecotoxicology.</a> Encyclopedia of Aquatic Ecotoxicology. , 247-258 (2013).</li>
<li>Caricato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbonic+anhydrase+integrated+into+a+multimarker+approach+for+the+detection+of+the+stress+status+induced+by+pollution+exposure+in+Mytilus+galloprovincialis%3A+A+field+case+study%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Total+Environ%22%5BJournal%5D)">Carbonic anhydrase integrated into a multimarker approach for the detection of the stress status induced by pollution exposure in Mytilus galloprovincialis: A field case study.</a> Sci Total Environ. 690, 140-150 (2019).</li>
<li>Calisi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+functional+alterations+in+hemocytes+of+Mytilus+galloprovincialis+exposed+in+high-impact+anthropogenic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Mar+Environ+Res%22%5BJournal%5D)">Morphological and functional alterations in hemocytes of Mytilus galloprovincialis exposed in high-impact anthropogenic sites.</a> Mar Environ Res. 188, 105988(2023).</li>
<li>Viarengo, A., Burlando, B., Evangelisti, V., Mozzone, S., Dondero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+and+specificity+of+metallothionein+as+a+biomarker+for+aquatic+environment+biomonitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarkers+in+Marine+Organisms%22%5BJournal%5D)">Sensitivity and specificity of metallothionein as a biomarker for aquatic environment biomonitoring.</a> Biomarkers in Marine Organisms. Garrigues, F., Barth, H., Walker, C. H., Narbonne, J. F. , Elsevier Science. Amsterdam. 29-43 (2001).</li>
<li>Bocchetti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contaminant+accumulation+and+biomarker+responses+in+caged+mussels%2C+Mytilus+galloprovincialis%2C+to+evaluate+bioavailability+and+toxicological+effects+of+remobilized+chemicals+during+dredging+and+disposal+operations+in+harbor+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Contaminant accumulation and biomarker responses in caged mussels, Mytilus galloprovincialis, to evaluate bioavailability and toxicological effects of remobilized chemicals during dredging and disposal operations in harbor areas.</a> Aquat Toxicol. 89 (3), 257-266 (2008).</li>
<li>Calisi, A., Lionetto, M. G., Caricato, R., Giordano, M. E., Schettino, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometric+alterations+in+Mytilus+galloprovincialis+granulocytes%3A+A+new+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Toxicol+Chem%22%5BJournal%5D)">Morphometric alterations in Mytilus galloprovincialis granulocytes: A new biomarker.</a> Environ Toxicol Chem. 26 (6), 1435-1441 (2007).</li>
<li>Burgos-Aceves, M. A., Faggio, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+to+the+study+of+the+immunity+functions+of+bivalve+haemocytes%3A+Physiology+and+molecular+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Shellfish+Immunol%22%5BJournal%5D)">An approach to the study of the immunity functions of bivalve haemocytes: Physiology and molecular aspects.</a> Fish Shellfish Immunol. 67 (6), 513-517 (2017).</li>
<li>Canesi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+kinase-mediated+cell+signaling+in+the+activation+of+Mytilus+hemocytes%3A+Possible+role+of+STAT-like+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Tyrosine kinase-mediated cell signaling in the activation of Mytilus hemocytes: Possible role of STAT-like proteins.</a> Biol Cell. 95 (9), 603-613 (2003).</li>
<li>Novas, A., Barcia, R., Ramos-Martínez, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+production+by+hemocytes+from+Mytilus+galloprovincialis+shows+seasonal+variations%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Shellfish+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide production by hemocytes from Mytilus galloprovincialis shows seasonal variations.</a> Fish Shellfish Immunol. 23 (4), 886-891 (2007).</li>
<li>Pruzzo, C., Gallo, G., Canesi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+vibrios+in+marine+bivalves%3A+The+role+of+interactions+with+hemolymph+components%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Persistence of vibrios in marine bivalves: The role of interactions with hemolymph components.</a> Environ Microbiol. 7 (5), 761-772 (2005).</li>
<li>Le Foll, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Mytilus+edulis+hemocyte+subpopulations+by+single-cell+time-lapse+motility+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Shellfish+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Mytilus edulis hemocyte subpopulations by single-cell time-lapse motility imaging.</a> Fish Shellfish Immunol. 28 (2), 372-386 (2010).</li>
<li>Rioult, D., Lebel, J. -M., Le Foll, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+tracking+and+velocimetric+parameters+analysis+as+an+approach+to+assess+activity+of+mussel+%28Mytilus+edulis%29+hemocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell tracking and velocimetric parameters analysis as an approach to assess activity of mussel (Mytilus edulis) hemocytes in vitro.</a> Cytotechnology. 65 (5), 749-758 (2013).</li>
<li>Udayan, G., Giordano, M. E., Pagliara, P., Lionetto, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motility+of+Mytilus+galloprovincialis+hemocytes%3A+Sensitivity+to+paracetamol+in+vitro+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Motility of Mytilus galloprovincialis hemocytes: Sensitivity to paracetamol in vitro exposure.</a> Aquat Toxicol. 265, 106779(2023).</li>
<li>Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+imaging+cellular+motility+and+interaction+dynamics+in+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system.</a> Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).</li>
<li>Ivanina, A., Falfushynska, H., Beniash, E., Piontkivska, H., Sokolova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomineralization-related+specialization+of+hemocytes+and+mantle+tissues+of+the+Pacific+oyster+Crassostrea+gigas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Biomineralization-related specialization of hemocytes and mantle tissues of the Pacific oyster Crassostrea gigas.</a> J Exp Biol. 220 (18), 3209-3221 (2017).</li>
<li>Furukawa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemocyte+migration+and+expression+of+four+Sox+genes+during+wound+healing+in+Pacific+abalone%2C+Haliotis+discus+hannai%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Shellfish+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hemocyte migration and expression of four Sox genes during wound healing in Pacific abalone, Haliotis discus hannai.</a> Fish Shellfish Immunol. 117, 24-35 (2021).</li>
<li>Lau, Y., Gambino, L., Santos, B., Espinosa, E., Allam, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+oyster+%28Crassostrea+virginica%29+hemocyte+motility+by+the+intracellular+parasite+Perkinsus+marinus%3A+A+possible+mechanism+for+host+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Shellfish+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of oyster (Crassostrea virginica) hemocyte motility by the intracellular parasite Perkinsus marinus: A possible mechanism for host infection.</a> Fish Shellfish Immunol. 78, 18-25 (2018).</li>
<li>Gendre, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+hemocyte+motility+by+chemical+and+biological+stresses+in+Mytilus+edulis+and+Dreissena+polymorpha%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Shellfish+Immunol%22%5BJournal%5D)">Modulation of hemocyte motility by chemical and biological stresses in Mytilus edulis and Dreissena polymorpha.</a> Fish Shellfish Immunol. 139, 108919(2023).</li>
<li>Kaloyianni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+effects+of+inorganic+and+organic+contaminants+on+haemolymph+of+mussels%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+C%3A+Toxicol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Oxidative effects of inorganic and organic contaminants on haemolymph of mussels.</a> Comp Biochem Physiol C: Toxicol Pharmacol. 149 (4), 631-639 (2009).</li>
<li>Sendra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoplastics%3A+From+tissue+accumulation+to+cell+translocation+into+Mytilus+galloprovincialis+hemocytes.+Resilience+of+immune+cells+exposed+to+nanoplastics+and+nanoplastics+plus+Vibrio+splendidus+combination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hazard+Mater%22%5BJournal%5D)">Nanoplastics: From tissue accumulation to cell translocation into Mytilus galloprovincialis hemocytes. Resilience of immune cells exposed to nanoplastics and nanoplastics plus Vibrio splendidus combination.</a> J Hazard Mater. 388, 121788(2020).</li>
<li>Pizzagalli, D. U., Pulfer, A., Thelen, M., Krause, R., Gonzalez, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+motility+patterns+displayed+by+immune+cells+under+inflammatory+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">In vivo motility patterns displayed by immune cells under inflammatory conditions.</a> Front Immunol. 12, 804159(2021).</li>
<li>ASTM D1141-98. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Standard+Practice+for+Preparation+of+Substitute+Ocean+Water%22">Standard Practice for Preparation of Substitute Ocean Water</a>. , (2021).</li>
<li>Martínez-Gómez, C., Bignell, J., Lowe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+membrane+stability+in+mussels%5BTitle%5D)+AND+%22ICES+Techniques+in+Marine+Environmental+Sciences%22%5BJournal%5D)">Lysosomal membrane stability in mussels.</a> ICES Techniques in Marine Environmental Sciences. 56, 1-41 (2015).</li>
<li>UNEP/RAMOGE. Manual on the biomarkers recommended for the MED POL Biomonitoring Programme. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22UNEP%22">UNEP</a>. , Athens. (1999).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr Protoc Immunol. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).</li>
<li>Asano, Y., Horn, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAsano%2C+Y+%22Instructions+Chemotaxis+and+Migration+Tool+2.0+Version+1.1%22">Instructions Chemotaxis and Migration Tool 2.0 Version 1.1</a>. , (2013).</li>
<li>Wilkinson, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmaceutical+pollution+of+the+world%27s+rivers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Pharmaceutical pollution of the world's rivers.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 119 (8), e2113947119(2022).</li>
<li>Parisi, M. G., Pirrera, J., La Corte, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+organic+mercury+on+Mytilus+galloprovincialis+hemocyte+function+and+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+B%22%5BJournal%5D)">Effects of organic mercury on Mytilus galloprovincialis hemocyte function and morphology.</a> J Comp Physiol B. 191 (1), 143-158 (2021).</li>
<li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+motility+driven+by+assembly+and+disassembly+of+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li>
<li>Bailly, M., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+motility%3A+Insights+from+the+backstage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell motility: Insights from the backstage.</a> Nat Cell Biol. 4 (5), E292-E294 (2002).</li>
<li>Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., Plastino, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+dynamics%2C+architecture%2C+and+mechanics+in+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Actin dynamics, architecture, and mechanics in cell motility.</a> Physiol Rev. 94 (1), 235-263 (2014).</li>
<li>Mosca, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+high+temperature+and+exposure+to+air+on+mussel+%28Mytilus+galloprovincialis%2C+Lmk+1819%29+hemocyte+phagocytosis%3A+Modulation+of+spreading+and+oxidative+response%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">Effects of high temperature and exposure to air on mussel (Mytilus galloprovincialis, Lmk 1819) hemocyte phagocytosis: Modulation of spreading and oxidative response.</a> Tissue Cell. 45 (3), 198-203 (2013).</li>
<li>Beaudry, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+temperature+on+immunocompetence+of+the+blue+mussel+%28Mytilus+edulis%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Xenobiot%22%5BJournal%5D)">Effect of temperature on immunocompetence of the blue mussel (Mytilus edulis).</a> J Xenobiot. 6 (1), 5889(2016).</li>
<li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+effects+of+seawater+acidification+and+high+temperature+on+hemocyte+parameters+in+the+thick+shell+mussel+Mytilus+coruscus%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Shellfish+Immunol%22%5BJournal%5D)">Combined effects of seawater acidification and high temperature on hemocyte parameters in the thick shell mussel Mytilus coruscus.</a> Fish Shellfish Immunol. 56, 554-562 (2016).</li>
<li>Schmeisser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+approach+methodologies+in+human+regulatory+toxicology+-+Not+if%2C+but+how+and+when%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Int%22%5BJournal%5D)">New approach methodologies in human regulatory toxicology - Not if, but how and when.</a> Environ Int. 178, 108082(2023).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究中描述的方案是一种新型的体外方法，适用于通过评估M. galloprovincialis血细胞的运动能力及其变化，快速且灵敏地测定药物和污染物的毒性。运动能力是这些细胞免疫功能的一个独特方面21,22,23,37,38，因此细胞运动能力的任何改变都可能预示着这些细胞免疫功能的改变。细胞运动是一项关键的细胞功能，整合了多种细胞过程，如细胞黏附、细胞信号传导、细胞骨架活性、细胞内信号传递以及细胞体积调控，并需要复杂生化与生物力学信号的整合与协调39,40,41。这些过程中的任何一个或其组成部分均可能成为药物和污染物毒作用的潜在靶点。因此，细胞速度和/或运动轨迹的改变可作为敏感的毒性终点，综合反映对多个细胞靶点的影响。
该方案适用于 体外 可对受试物质进行短期（持续1-4小时）或长期暴露（持续24-48小时）的效应评估，从而实现对污染物和药物潜在毒性效应的快速筛选。采用96孔板可同时检测多种物质或单一物质的不同浓度，节省时间和试剂。此外，该方案还可根据需要适配其他设备，如相差显微镜或荧光显微镜。在此情况下，细胞可在无需染色或使用荧光活体染料的条件下进行成像。
尽管该方法为毒理学筛选提供了新颖且灵敏的替代方案，但其在更广泛的应用中仍存在一些局限性。首先，温度是该方案应用中的一个关键因素。已知贻贝血细胞对温度变化较为敏感，温度对血细胞的影响较为复杂，过高或过低的温度均会对其免疫功能产生负面影响。42,43,44. 如方法建立过程中所观察到的，温度对细胞运动能力影响的关键阶段是细胞收获、黏附及在基质上培养的初始阶段，该阶段需遵循生物体的适应温度。在初始阶段，若温度高于适应温度仅升高几度，就可能严重影响细胞铺展形态和运动能力的获得。因此，建议温度为15 &#176;建议使用 C 培养血细胞。用于评估细胞运动能力的延时图像采集在 20 °C 的室温下进行，持续 10 分钟。 &#176;C. 根据方法建立过程中的初步观察，培养细胞在此时间段内于20℃暴露 &#176;C 对血细胞运动性无显著影响。该方法的另一局限性在于需要对血细胞进行人工追踪，这可能引入操作者依赖的变异，并需要耗费大量时间且对细节要求较高。然而，使用活体染料中性红可增强细胞的可视性，进而通过清晰显示发达的溶酶体系统来改善细胞追踪效果。该染料不染色细胞核，因此细胞核呈现为空白的孔状结构，在人工追踪细胞时易于识别和定位。该方法的另一局限性与它的 体外 自然。尽管 体外 该条件虽为评估细胞运动性提供了受控环境，但可能无法完全模拟实际发生的复杂相互作用与应答过程 在体内，尤其是在整个生物体的免疫反应中。
近年来，生命科学领域已普遍采用新的方法和技术，旨在提高研究效果并减少对动物实验的依赖45该方案提供了一种替代性的高灵敏度检测方法 体外 对污染物和药物作用效应及作用机制的筛选，以快速评估环境基质中单独或混合存在的化学污染物的毒理学效应。该方法聚焦于一个新的终点指标——免疫系统细胞的运动能力，可对药物和污染物在多种细胞靶点上产生的毒理学效应提供整合性响应。在此意义上，该方法拓展了 体外 文献中现有的检测方法相比，该方法还从多检测整合应用的角度为环境生物监测提供了参考。本方案的某些特点符合3R原则（替代、减少和优化），有助于减少脊椎动物的活体实验。 在体内 动物实验以及更符合伦理且高效的毒理学和生态毒理学暴露毒性检测方法的发展。这些特点包括以低侵入性方式从贻贝中采集血淋巴、检测所需血淋巴量少，以及使用多孔板，可同时进行多种毒物浓度的暴露处理并设置重复，从而在时间和试剂方面实现显著节约。

基于效应的方法，例如 体外 和 体内 生物测定法代表了检测环境化学污染物对生物体影响的创新工具，并可作为环境监测和风险评估的手段1,2,3,4它们通过克服经典分析化学方法的一些局限性，对后者形成了有力补充。例如，基于效应的方法能够评估污染物的生物可利用性、对生物体健康的影响，以及混合物的联合毒理学效应。而这些联合效应仅依靠化学分析往往无法预测。5.
近年来，新兴关注污染物（新兴污染物）的生态毒理学研究领域中，基于效应的方法可作为检测生物暴露情况和评估其对生物群影响的有用工具1,5,6,7。多种基于效应的方法在环境监测与评估中采用双壳类软体动物作为测试生物8,9。这些生物具备若干特性，使其适用于生态毒理学研究，例如分布广泛、具有滤食性、固着生活方式、能够生物富集多种环境污染物并产生可检测的污染物响应、可利用不同生命阶段进行实验，以及易于在实验室条件下维持7。它们对污染物暴露高度敏感，并根据物种、生命阶段和环境条件的不同，对有毒污染物表现出多种响应8,9,10。因此，多个环境指南将双壳类物种列为标准化的测试物种10,11。
在双壳类软体动物中，广泛分布的Mytilus galloprovincialis因其在接触化学污染后可产生早期可检测的响应，成为生态毒理学研究中最常用的物种之一，这些响应包括金属硫蛋白的诱导、抗氧化酶活性的改变、溶酶体膜不稳定、脂质过氧化、脂褐素积累、微核频率升高以及碳酸酐酶的诱导12,13,14,15。血细胞是具有免疫功能的血淋巴细胞，被广泛用于研究环境污染物对双壳类软体动物的毒理学影响4,13,16,17。这些细胞在机体免疫应答中起关键作用，执行多种重要的细胞介导的先天免疫功能，包括通过吞噬作用清除微生物，以及在呼吸爆发过程中释放溶酶体酶、抗菌肽和活性氧代谢物等多种细胞毒性反应18,19,20。血细胞本质上是可运动的细胞21,22,23&#160;，能够在机体免疫应答的早期迁移至感染部位。总体而言，运动能力是所有免疫细胞的基本特征，因为它使这些细胞能够进行免疫监视，从而保护机体24。针对多种软体动物物种的研究表明，血细胞的运动能力在其免疫应答、伤口愈合以及与病原体的相互作用中均具有关键作用。这种运动能力受特定分子通路的调控，凸显了软体动物血细胞功能的复杂性与特化性21,25,26,27。
尽管运动性在血细胞生理学中具有根本重要性，但极少有研究探讨血细胞运动性对环境化学污染物的敏感性23,28,29,30最近，我们课题组表征了自发运动的特征 Mytilus galloprovincialis 在经组织培养处理的聚苯乙烯96孔微孔板中培养血细胞，并检测血细胞运动对敏感性的响应 体外 对对乙酰氨基酚的暴露23. M. galloprovincialis 血细胞表现出基于伪足的随机样运动和快速的形态变化，这与之前在另一种贻贝物种中观察到的结果一致。 Mytilus edulis21,22,23,28, 并且已在人类免疫细胞中有所描述31血细胞的运动性最近被证明对化学应激因子敏感23,28. 基于上述先前研究结果，本研究提出了一种新型的 体外 基于运动性评估污染物毒性和生态毒性的快速灵敏方法 M. galloprovincialis 血细胞及其变化，通过细胞运动速度分析（平均速度、迁移距离、欧几里得距离和方向性）进行量化。该方法提供了以下可能性 体外 在短期实验（持续1-4小时）或长期暴露实验（持续24-48小时）中检测多种物质的毒性。

<table><tbody><tr><td>0.2 &amp;micro;m 滤膜（直径 25 mm）</td><td>ABLUO&amp;nbsp;</td><td></td><td>实验耗材</td></tr><tr><td>2.5 ml 皮下注射器针头 22G</td><td>Rays</td><td>2522CM32</td><td>实验耗材</td></tr><tr><td>96 孔平底聚苯乙烯 TC 处理微孔板</td><td>Corning</td><td>3916</td><td>实验耗材</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;·2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&amp;nbsp;</td><td>C3881-1KG</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>Chemotaxis and Migration Tool 软件&amp;nbsp;</td><td>(Ibidi GmbH)</td><td></td><td>软件</td></tr><tr><td>Cytation 5&amp;nbsp;</td><td>Agilent BioTeck</td><td>Cytation 5</td><td>设备：细胞成像多功能读板仪</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）&amp;nbsp;</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&amp;nbsp;</td><td>472301</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL 锥底离心管</td><td>Corning</td><td>352196</td><td>实验耗材</td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;BO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&amp;nbsp;</td><td>B0394</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>血细胞计数板 Fast read 102</td><td>Biosigma</td><td>BVS100</td><td>实验耗材</td></tr><tr><td>HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸）</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&amp;nbsp;</td><td>H3375-500G</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>NIH</td><td></td><td>软件</td></tr><tr><td>KBr</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&amp;nbsp;</td><td>P9881</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merk&amp;nbsp;</td><td>104936</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&amp;nbsp;</td><td>G7513</td><td>细胞培养基必需氨基酸</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&amp;nbsp;</td><td>M2670</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&amp;nbsp;</td><td>M7506</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>显微镜 Nikon Eclipse E600</td><td>Nikon</td><td></td><td>设备：细胞成像&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Riedel-de Haen</td><td>31481</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&amp;nbsp;</td><td>31434-1KG-R</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Fluka</td><td>71519 500g</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&amp;nbsp;</td><td>S5761-1KG</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>中性红</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&amp;nbsp;</td><td>N4638-1G</td><td>活细胞染料</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&amp;nbsp;</td><td>P0781-100ML</td><td>细胞培养用抗生素</td></tr><tr><td>SrCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&amp;nbsp;</td><td>255521</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>台盼蓝&amp;nbsp;</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&amp;nbsp;</td><td>T8154</td><td>细胞染料</td></tr></tbody></table>

一种基于贻贝（mytilus galloprovincialis）血细胞运动性的毒理学与生态毒理学检测方法

A Toxicological and Ecotoxicological Assay Based on Mussel (Mytilus galloprovincialis) Hemocytes Motility

血细胞是双壳类软体动物中具有免疫活性的循环细胞，在介导细胞免疫的多种重要功能中发挥关键作用。在免疫反应的早期阶段，血细胞会主动迁移至感染部位。这种固有的运动能力是这些细胞的基本特征，代表了一种整合了细胞黏附、细胞信号传导、细胞骨架动态变化以及细胞体积改变等多种过程的关键细胞功能。因此，药物或污染物暴露后细胞运动性的改变可作为一项有效的毒理学终点指标。尽管细胞运动性在细胞生理学中具有基础性作用，但从毒理学角度对其开展的研究仍较为匮乏。本研究提出一种新颖的 体外 一种基于评估血细胞运动性的污染物毒性和生态毒性快速灵敏检测方法 Mytilus galloprovincialis我们建立了一种基于血细胞黏附于96孔聚苯乙烯微孔板底部的细胞运动性检测方法。在暴露于不同浓度药物后，通过延时显微成像结合细胞追踪技术，定量分析细胞的运动轨迹和速度，从而评估药物对血细胞运动性的影响。由于可相对无创地从动物体内采集血细胞，该方法为污染物和药物作用效果及其作用机制的筛选提供了一种替代性检测手段。该方法符合3R原则（替代、减少与优化），有助于解决伦理问题，并减少对脊椎动物的使用。 体内 动物实验。

本研究介绍了一种利用Mytilus galloprovincialis血细胞运动性快速、灵敏地评估污染物毒性和生态毒性的新型体外方法。图1A-C展示了血细胞在培养孔底部贴附30分钟后具有代表性的延时成像结果。在进行运动性评估前，图中细胞已用中性红染色。采用多功能酶标仪在20倍放大倍数下，以每分钟拍摄一张图像的频率，连续10分钟通过光学显微镜监测细胞运动。图1A-C显示了从同一兴趣区域（ROI）在0分钟、5分钟和10分钟时采集的11帧图像中的三帧。三幅图像中对相同的细胞进行了编号，以突出其移动轨迹，且编号在各图间保持一致，以清晰展示其运动路径。
细胞表现出基于片状伪足活性的单细胞运动以及快速的形态变化。细胞用活体染料中性红进行标记，以提高追踪过程中的可视性。中性红是一种两亲性弱阳离子染料，可轻易穿透细胞膜。进入细胞后，染料因质子化而被截留在溶酶体中。贻贝血细胞，特别是颗粒细胞，具有发达的溶酶体系统；因此，通过中性红染色可清晰观察到这些细胞，其细胞质富含多个呈红色标记的溶酶体，而细胞核（不被染料标记）则呈现为透明的空洞。
根据Udayan等人的研究23，通过应用该方案可观察到两种主要的血细胞形态类型：(1) 呈双极豆状、有时具阿米巴样轮廓的铺展细胞，以及较小的星形圆形细胞（细胞编号 n = 3 和 10）。在这两类细胞中，运动特征表现为持续的形态变化，伴有伪足和丝状伪足的不断伸展与回缩。
该实验方案通过构建轨迹图（如图2所示）并计算主要的速度参数（如平均速度和运动方向性），实现了对血细胞运动能力的成功评估。在基础生理条件下，血细胞贴壁30分钟后，铺展细胞和小型细胞的上述参数分别为6.46 ± 0.2 µm/min和0.56 ± 0.02（均值±标准误），以及5.18 ± 0.34 µm/min和0.37 ± 0.03。因此，该方案可根据速度参数对不同血细胞群体进行分类。
通过应用该方案，可在血细胞暴露于药物或污染物后检测其运动速度参数的变化。 图 3A-D 展示了该实验的代表性结果 体外 将贻贝血细胞暴露于对乙酰氨基酚，该物质是释放到环境中的药物（PiE）之一，在全球河流中具有最高的浓度和检出频率31.
根据 Udayan 等人23的研究，在对照细胞中，两种细胞形态的细胞均表现出随时间显著增加的运动速度，提示在24小时培养期间血细胞被激活，可能模拟了因抽离并接种至培养环境而实验性诱导的炎症反应。当细胞暴露于药物时，铺展细胞的血细胞运动活性在24小时后显著降低（图3A），但在小圆形细胞中未观察到该现象（图3C），后者在0时间点测得的平均基础速度较低。此外，该方案可检测药物暴露后细胞运动轨迹的变化，表现为小圆形细胞在24小时后运动方向性显著增强，而铺展细胞在暴露1小时后方向性显著下降（图3C、D）。
<img alt="细胞随时间变化的显微镜图像，显示编号的细胞簇；比例尺为 100 µm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67285/67285fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图 1：中性红染色血细胞贴壁 30 分钟后代表性的时间推移成像。 在进行运动性评估前，使用活体染料中性红对细胞进行染色。通过光学显微镜以 20 倍放大倍数，每分钟采集一张图像，持续监测 10 分钟。为简洁起见，图中 A、B 和 C 展示了同一兴趣区域（ROI）在 0 分钟、5 分钟和 10 分钟时所采集的 11 个帧中的三个。三个图像中相同细胞均标有相同编号，以说明其移动轨迹，箭头表示时间间隔。比例尺为 100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67285/67285fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="轨迹分析图；包含25条粒子轨迹的路径图，x/y轴单位为微米。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67285/67285fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：M. galloprovincialis 血细胞的代表性轨迹图。 所示轨迹来自一个单独的孔。图中显示了25个细胞的轨迹。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67285/67285fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="对乙酰氨基酚对细胞运动性、速度和方向性的影响；24小时内对照组与2 mg/L处理组的图表比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67285/67285fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3对乙酰氨基酚暴露（24 h）对铺展细胞（A，B）和小型圆形星状细胞（C，D）迁移速度和迁移方向性的影响 数据以均值 ± 标准误表示。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）及 Tukey 事后检验对数据的统计学显著性进行评估。*p &lt; 0.05 与对照组（p &lt; 0.05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67285/67285fig03largev2.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

该文章提出了一种新颖的方法 体外 基于污染物对生物运动性影响的快速灵敏毒性及生态毒性评估方法 Mytilus galloprovincialis 血细胞。该方法旨在促进更符合伦理且更灵敏的毒理学和生态毒理学暴露试验的发展。

一种基于贻贝（Mytilus galloprovincialis）血细胞运动性的毒理学与生态毒理学检测方法

血细胞是双壳类软体动物中循环的具有免疫能力的细胞，在细胞介导的先天性免疫等多种重要功能中发挥关键作用……

本研究的目的是基于以贻贝（Mytilus galloprovincialis）作为模式生物，评估其血细胞运动能力，从而建立一种新型的体外快速、灵敏检测污染物毒性和生态毒性的方法。基于效应的方法，例如体外和体内生物测定法，是检测环境化学污染物对生物体影响的创新工具。这些方法可作为环境生物监测和风险评估中的有效手段。本研究通过关注利用血细胞运动性作为评估污染物对贻贝影响的新终点指标，解决了毒理学领域的一个重要空白。尽管血细胞运动性对免疫反应至关重要，但其在双壳类动物中对污染物暴露的敏感性尚未得到充分研究。我们的发现从多个方面推动了毒理学和生态毒理学的研究进展。通过提供新的毒性筛选终点、减少脊椎动物实验以支持伦理研究，以及提升在生态毒理学中的适用性，该方法可在环境生物监测中广泛应用，并可针对生态毒理学中的其他免疫细胞进行调整应用。首先，用0.5毫升标准生理盐水预填充注射器，并将盐水温度调节至15摄氏度。将已适应环境的成年贻贝标本放置于适合采集血淋巴的位置。使用解剖刀，沿腹面轻轻且小心地将贝壳略微撬开。保持解剖刀位置不动，或使用移液器吸头维持开口状态。然后，将注射器的针头插入瓣膜之间的空隙中。使用预装的注射器，从后闭壳肌处轻轻采集0.5毫升血淋巴。接着，将针头从注射器上取下，将注射器内的液体转移至微量离心管中。将从三到四只贻贝采集的样品在15°C条件下合并至同一离心管中。在评估血细胞活力后，取50 µL稀释后的血淋巴加入96孔平底聚苯乙烯TC处理培养板的孔中，盖上盖子进行培养。在15°C条件下孵育30分钟，使血细胞贴壁并形成单层。 然后，使用微量移液器轻轻吸除孔中的过量血淋巴。若需在1至4小时内进行短期实验，请立即加入100 µL用生理盐水溶解的待测物质。对于24至48小时的长期暴露实验，则将培养的贴壁细胞与溶解于补充培养基中的待测物质在15°C条件下共同孵育。首先，获取经目标物质处理的培养血细胞。为了更清晰地观察血细胞，从每个孔中移除培养基，并在进行延时显微观察前，加入100微升中性红活体染色液对细胞进行染色。将细胞置于气候培养箱中，于15摄氏度孵育15分钟。孵育后，洗去多余的染料，并加入100 µL溶于标准生理盐水中的待测物质。将含有处理后细胞的多孔板放入多功能酶标仪中。在20倍放大条件下，通过时间序列显微镜和明场成像对多孔板进行实时成像。为进行细胞追踪和计算流速参数，使用 Gen5 软件获取单帧图像，并将图像保存至名称中不含空格的文件夹中。在 ImageJ 中，依次点击文件、导入和图像序列。使用手动追踪插件对单个细胞进行细胞追踪。将来自 ImageJ 手动追踪插件的数据集导入 Chemotaxis and Migration Tool 软件中。选择用于追踪的所需切片数量。使用 X/Y 像素尺寸和时间间隔设置对软件进行校准。设置参数后，点击“应用设置”。绘制轨迹并导出为图像。点击“测量值”按钮查看结果，并保存数据。然后，点击统计按钮，保存该轨迹序列的速度和直线性数据。将对照组细胞的计算出的流速参数与暴露于不同浓度测试物质的血细胞的参数进行比较。通过延时成像评估血细胞的运动能力，记录单个细胞在10分钟内的运动轨迹，并在0、5和10分钟三个时间点持续追踪编号细胞的运动。观察到两种血细胞形态，即铺展细胞和较小的圆形星状细胞。这两种细胞类型均因伪足和片状伪足的活动而持续改变形态。速度和方向性图谱显示，在基础生理条件下，铺展细胞的移动速度快于较小的细胞。对乙酰氨基酚暴露24小时后，显著降低了铺展细胞的运动能力，而小细胞则未表现出这种降低。小细胞的运动定向性在暴露于对乙酰氨基酚24小时后显著增加，而铺展细胞的定向性在仅暴露1小时后即出现下降。

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基于贻贝 （Mytilus galloprovincialis） 血细胞运动的毒理学和生态毒理学测定

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