活体叶片接种：一种评估杨树杂交无性系对茎干溃疡病抗病性的替代方法

本研究方案的目的是探讨利用杨树杂交育种进行病原接种及抗病性评估的方法。我们采用活体叶片接种法作为传统方法的替代方案，旨在推进杨树茎干溃疡病的育种工作。通过叶片接种法，研究人员可在杂交后的第二年对大规模杂交后代群体进行抗病性筛选。

在杨树杂交育种中，通过叶片接种法实现对干部溃疡病的早期滑动选择。叶片接种法最具优势的方面在于其高效性和高通量性。首先，该方法可显著缩短抗病性选择周期，将杂交后5至7年才能完成的选择过程缩短至杂交后2年即可完成。

其次，该方法可在数周内评估大规模杂交克隆系的抗病性。叶片接种法将推动中国杨树对干枯病菌（Botryosphaeria dothidea 和 Cytospora chrysosperma）的抗性杂交育种，以及北美地区杨树溃疡病的杂交育种。此外，该方法可用于筛选抗病株系，促进杨树分子育种的发展。除用于杨树茎干溃疡病的杂交育种外，叶片接种法还可用于筛选天然或突变杨树群体的抗病性，以及评估杨树茎干溃疡病病原菌的感病性。

此外，该方法可为抗病基因的挖掘和抗病性的遗传分析提供致病型信息。首先，在水中加入马铃薯提取物、葡萄糖和琼脂，以制备马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基，用于真菌菌株的培养。将溶液在100摄氏度加热10分钟，以完全溶解各组分。

将PDA培养基倒入25毫升试管中。在121.1摄氏度下对所有试管灭菌30分钟。然后，在洁净台中将灭菌后的试管冷却至50至60摄氏度。

将培养基倒入直径为9.0厘米的培养皿中，在室温下冷却。随后，将真菌病原体在PDA培养基中于28摄氏度培养7天后的菌丝体切成约0.5厘米见方的小块。将真菌小块接种至PDA培养皿中央，确保菌丝面朝向培养基。

然后，将接种的真菌病原体在恒温培养箱中培养7至10天。培养后，将含有真菌菌丝的PDA培养基切成边长为1.0至1.2厘米的方形小块。从一年生杨树克隆主枝顶端选取 newly matured fully extended 叶片。

确保叶片无病虫害及机械损伤。对于多年生杨树杂交克隆的一年生枝条，选取所选枝条顶端第五至第七片叶作为接种材料。用清水喷洒所选的杨树克隆植株或枝条。

干燥后，在接种操作前一小时或一天，用75%酒精擦拭选定的叶片。首先，准备溃疡病原菌的真菌培养物以及用于叶片接种的杨树材料。对于较小的叶片，将两个预先制备好的方形真菌菌丝块和PDA块接种到杨树克隆植株自上而下第五至第七片叶的上表面。

确保菌丝面朝向叶片，接种位置位于半片叶片的中央。将四个方形真菌菌丝块和四个PDA块接种到大杨树叶片上部第五至第七片叶的上表面，然后用透明胶带包裹接种后的叶片。

轻轻按压胶带，使其粘附在叶片上，以防止实验过程中菌丝块移动和水分流失。接着，使用5 mL注射器针头在叶片和菌丝块上刺穿五个位点，使针头从杨树叶的上表面穿透至下表面，并穿过菌丝块。其中一个穿刺位点位于菌丝块中心，其余四个分别靠近菌丝块四个顶点，距离顶点1至2毫米处。

在接种后三天内检查接种叶片，观察菌丝接种物是否发生位置移动或失水现象。观察叶片下表面穿刺伤口周围坏死病斑的出现情况。实验结束时，摘下所有接种过的叶片，并将其放入塑料样品袋中。

首先，取用保存在塑料袋中的接种溃疡病菌的杨树叶片。小心去除叶片上的塑料保护膜，并轻轻清除叶表面的菌丝接种物。通过观察坏死斑点的形状和颜色，检查并鉴定每个杨树无性系的叶片致病型。

然后，将叶片放置在黑色背景的尺子上。使用相机拍摄叶片的下表面，或使用扫描仪扫描叶片，以获得分辨率超过300 dpi的图像。在ImageJ 1.54G软件中打开病害叶片的图像。

根据叶片图像中可见的标尺，在 ImageJ 中设置比例尺。然后，使用 ImageJ 中的魔棒工具识别叶片上的病斑，并测量每个坏死斑的面积。测量完所有坏死斑后，记录各面积数值，并将这些数值导出为电子表格以供进一步分析。

如果菌丝覆盖的穿刺位点周围的病斑明显大于PDA覆盖位点周围的病斑，则将其归类为病害位点。如果菌丝覆盖的穿刺位点出现病斑颜色变化、菌丝状结构、分生孢子器和分生孢子等特征，也将其定义为病害位点。计算每个杨树杂交无性系克隆的有效PDA病斑区域的平均面积。

将菌丝接种点分为发病和未发病两类。然后，计算受试杨树无性系的发病率。计算叶片上病斑的平均面积。

根据所有测试的杨树无性系病斑的平均面积，建立五级病害分级标准。利用五级病害分级标准计算每个杨树无性系的病情指数。接着，采用Shapiro-Wilk检验，验证不同抗性水平下杨树无性系数量的正态分布情况。

根据病害指数，将所有测试的杨树无性系分为五个或七个抗性等级：高抗、中抗、低抗、无抗性、无感病性、感病、中感、高感和极高感。茎干溃疡病原菌接种后，在杨树叶片上诱导产生坏死病斑，甚至出现类似分生孢子器的结构。

此外，叶片的着生位置和光照条件会影响叶片病害的严重程度。