Name: CRISPR-Cas9 介导在无饲养层条件下培养的人多能干细胞中的基因缺失 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 21 s
Description: 学习CRISPR-Cas9介导的基因敲除技术在人胚胎干细胞H9中的应用。该方法利用慢病毒递送系统实现L2HGDH基因稳定敲除，同时保持细胞多能性和三胚层分化能力，为发育生物学和再生医学研究提供重要工具。

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本研究工作得到了阿拉伯联合酋长国大学（UAEU）研究基金的资助，基金编号为 #12M105、#12R167（扎耶德健康科学中心）、21R105（扎耶德·本·苏丹慈善与人道主义基金会（ZCHF）），以及由阿布扎比先进技术研究委员会（ATRC）的技术项目管理支柱ASPIRE通过ASPIRE精准医学研究所阿布扎比（ASPIREPMRIAD）授予的VRI-20-10号基金。

本研究中使用的基因序列、试剂和设备的详细信息见材料表。
1. 单导向RNA（sgRNA）设计、克隆及慢病毒载体生产
注意：使用两种不同的靶向 L2HGDH 基因第一外显子的sgRNA序列，均引自Qiu等人的研究6，其中序列1和序列2的PAM位点分别为AGG和TGG。两种sgRNA长度均为20 bp，并在末端修饰以添加用于限制性内切酶Bsmb1的连接序列，以便克隆至目标载体（LentiCRISPRv2）中，具体方法如先前报道所述6。连接序列在sgRNA设计阶段即已加入，用于克隆目的。
<ol>
	<li>将化学合成的sgRNA进行退火，并利用先前报道的优化方案，将其克隆至Bsmb1单切位点的慢病毒载体LentiCRISPRv2中67。</li>
	<li>采用标准化且优化的方案进行慢病毒包装与浓缩7。</li>
	<li>进行慢病毒生产时，使用DMEM培养基（含10% FBS和1×青霉素/链霉素（P/S））接种HEK293T细胞（密度为1 × 105 个细胞/cm2），在37 °C、5% CO2及湿润条件下，于组织培养箱中过夜培养。</li>
	<li>当细胞融合度达到90%时，使用低成本阳离子聚合物PEI，将入门载体（空骨架或表达sgRNA的质粒）与包装质粒共同转染至HEK293T细胞中，具体操作如先前所述7。</li>
	<li>转染后48小时和72小时收集含有慢病毒上清液（LVS）颗粒的条件培养基，并使用蔗糖垫进行超速离心，在4 °C下以1,25,000 × g离心2小时。</li>
	<li>将LVS颗粒浓缩至原体积的至少200倍，分装后保存于PBS中，置于-80 °C冰箱中直至使用。</li>
	<li>按照制造商说明书，使用qPCR慢病毒滴度检测试剂盒测定慢病毒颗粒的滴度（参见材料表）。</li>
</ol>
2. 慢病毒感染与单细胞克隆扩增
<ol>
	<li>对于LVS颗粒感染，将含有1 × 105个细胞/0.5 mL hESC培养基（基础培养基 + P/S + 10 µM Rock抑制剂）的人胚胎干细胞（H9）悬液接种于经完全Matrigel（1:50稀释）包被的24孔板中，每孔加入500 µL培养基，过夜培养以使细胞贴壁。额外接种若干孔细胞，不进行LVS感染但接受嘌呤霉素处理，作为未感染对照组。 
	注意：细胞计数可使用手动血细胞计数板或自动细胞计数仪进行。</li>
	<li>次日，以感染复数（MOI）为10的条件感染细胞，并加入8 µg/mL聚凝胺，于37 °C孵育8小时，随后更换为新鲜的hESC培养基 + P/S（不含Rock抑制剂），继续培养至细胞融合度达到90%。</li>
	<li>当细胞融合度达到90%时（通常为感染后48–72小时），开始添加浓度为0.8 µg/mL的嘌呤霉素进行筛选，并持续筛选直至未感染组细胞全部死亡（对照组）。</li>
	<li>筛选完成后（通常为4–6天），将稳定转导的细胞按1:4比例传代，扩增后用于冻存及后续分析。</li>
	<li>使用表达L2HGDH-sgRNA-16的细胞进行单细胞筛选和克隆扩增。</li>
	<li>为此，制备相当于500个细胞/10 mL完全生长培养基的细胞悬液，每孔加入100 µL该悬液至96孔板的各个孔中。</li>
	<li>细胞静置培养3天后开始观察。</li>
	<li>标记出形成单克隆的孔，并每隔一天更换培养基，直至克隆生长至足够大小（通常约2周），然后进行进一步扩增、冻存和分析。</li>
</ol>
3. 基因组DNA提取、MS-BSP PCR及Sanger测序
<ol>
	<li>根据制造商说明，使用基因组DNA提取试剂盒从细胞中分离基因组DNA（参见材料表）。</li>
	<li>采用基于突变位点的特异性引物（MS-BSP）分析法，对PAM识别序列上游的突变位点进行定位8。</li>
	<li>为此，设计一条无偏性的右引物L2H-UMSBSP-R1，用于扩增Exon1外侧区域，以无偏好性地扩增任何目标序列。</li>
	<li>设计一条有偏性的左引物L2H-BMSBSP-F1，其序列与sgRNA完全相同，用于扩增靠近PAM识别序列的目标区域。 
	注意：在极高严谨性的PCR条件下，未发生突变的克隆会在凝胶上观察到扩增产物；而在PAM识别序列上游附近存在突变的CRISPR敲除克隆中则不会观察到扩增产物。</li>
	<li>为定位单碱基对突变，通过PCR扩增一段长度为468 bp、覆盖L2HGDH基因整个Exon1的序列，并进行Sanger测序，随后使用clustalw进行多序列比对分析8。</li>
</ol>
4. 人胚胎干细胞分化及拟胚体（EB）形成实验
<ol>
	<li>按照既定方案，使用双SMAD抑制法对对照组及不同CRISPR克隆的人胚胎干细胞（H9）进行定向分化，诱导其向神经外胚层命运分化9,10,11。</li>
	<li>当细胞融合度达到90%时，在100% KSR培养基中加入LDN193189（200 nM）和SB431542（10 µM）处理24小时，随后加入XAV939（2 µM）继续处理2天。</li>
	<li>3天后，在8天内将KSR培养基比例（Knockout DMEM补充15% (v/v) KSR、1% (v/v) L-谷氨酰胺、1% (v/v) P/S、1% (v/v) 10 mM MEM以及0.1% (v/v) 2-巯基乙醇）逐步降低（75%、50%、25%），并与N2培养基（DMEM/F12补充1x N2添加剂、1x P/S）混合，最终完全替换为100% N2培养基。</li>
	<li>在第12天开始时，使用PAX6作为神经外胚层标志物对细胞进行固定，用于免疫染色。</li>
	<li>对于中胚层和内胚层命运决定的研究，采用基于小分子CHIR99021的方法，具体步骤见先前发表的文献12,13。</li>
	<li>当细胞融合度达到70%时，在确定性内胚层（DE）培养基中加入3 µM CHIR99021处理24小时，随后固定细胞，使用Brachyury作为中胚层特异性标志物进行免疫染色。</li>
	<li>对于内胚层阶段，继续在不含CHIR99021的DE培养基中额外培养24小时，然后固定细胞，使用FOXA2进行免疫染色。</li>
	<li>对于拟胚体（EB）形成实验，将细胞接种于低吸附细胞培养表面，不使用Matrigel，在悬浮条件下培养24小时后拍摄显微图像。</li>
</ol>
5. 蛋白质印迹分析
<ol>
	<li>用 PBS 洗涤细胞两次，然后使用含有 1% SDS 和 1× 蛋白酶与磷酸酶抑制剂混合物的 1× RIPA 缓冲液裂解细胞。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 16,000 × g 离心 10 分钟澄清裂解液，随后收集上清液。</li>
	<li>使用 BCA 蛋白定量试剂盒按照制造商说明书测定总蛋白浓度，并用 4× 上样缓冲液将样品调整至 2 µg/µL。</li>
	<li>在 70 °C 变性蛋白样品 10 分钟，等量上样后使用 4%–12% 的梯度 SDS-PAGE 凝胶进行电泳分离7，随后在 4 °C 条件下以恒定电压 100 V 转移至 PVDF 膜上，持续 1 小时。</li>
	<li>用 5% 脱脂牛奶封闭膜，然后在 4 °C 条件下与一抗稀释液孵育过夜，并持续旋转。</li>
	<li>随后，用 PBST 缓冲液洗涤膜 5 次，再在室温下与相应的 HRP 标记二抗孵育 1 小时。</li>
	<li>再次用 PBST 缓冲液洗涤膜 5 次，加入化学发光底物孵育后，使用 X 射线胶片显影。</li>
</ol>
6. 免疫染色
<ol>
	<li>将细胞接种于P4孔板中，在固定前至少培养24小时，以确保细胞充分贴附于表面。</li>
	<li>用PBS洗涤细胞3次，以去除死亡细胞及培养基成分，随后在室温下用4%多聚甲醛固定15分钟。</li>
	<li>使用0.3% Triton X-100对细胞进行透化处理，然后在室温下用含2% BSA的PBS封闭非特异性结合位点，封闭时间为1小时。</li>
	<li>将样品与一抗（OCT4、NANOG、SOX2、KI67、PAX6、Brachuary、FOXA2）在1% BSA中稀释后，于4 °C孵育过夜。</li>
	<li>用PBS洗涤细胞3次，然后加入相应的二抗（羊抗小鼠488、羊抗兔488、羊抗小鼠546、羊抗兔546），用1% BSA稀释后于室温孵育1小时。</li>
	<li>最后用PBS洗涤样品3次，用DAPI复染，然后使用荧光显微镜成像。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在利益冲突。

本研究建立了一种标准化方法，利用CRISPR-Cas9技术在人胚胎干细胞（hESCs）中实现高效且低成本的基因敲除。该方法从hESC感染开始，经过单细胞克隆筛选与扩增，在3-4周内成功实现了L2HGDH基因的纯合子缺失（表1）。尽管在大多数细胞中可通过瞬时转染实现CRISPR-Cas9介导的基因操作，但在干细胞中该方法面临转染效率低和细胞毒性高的挑战。已有不同研究报道，获得的克隆中最多有10%出现目标基因缺失。例如，Mali等人报道，在靶向AAVS1位点后，人诱导性多能干细胞中的基因组编辑效率为2%至4%3。另一项研究报道，在原始态hESCs中靶向TUNA（一种参与多能性和神经分化的长链非编码RNA）时，编辑效率为1.3%-8.4%14。Ocana等人在靶向人类多能干细胞中的CFTR基因时，报告的编辑效率最高达10%15。因此，为实现高效的基因编辑，必须采用高效的Cas9-gRNA递送方法，这一点在干细胞中尤为关键，因为与典型的体细胞和永生化细胞系相比，干细胞对瞬时递送方法表现出更高的敏感性和抗性5。
本研究报道了一种利用慢病毒介导的sgRNA递送至人胚胎干细胞（hESCs）以获得纯合CRISPR基因敲除细胞系的高效方法。与通过化学或机械手段使用非病毒载体转染相比，采用慢病毒载体将CRISPR-Cas9系统导入hESCs在实现基因删除方面效率显著更高，且耗时更短（数据未显示）。在单克隆筛选及单个克隆扩增后，基因组编辑效率显著提高（约23%）。因此，本方法结合了慢病毒介导的sgRNA和Cas9递送至hESCs的技术，以及一种经济高效的慢病毒制备方案，不仅高效、省时，而且具有成本效益。
以下是一些确保成功操作的建议：（1）使用单一慢病毒载体系统，同时表达 Cas9 和 sgRNA。（2）在表达 Cas9 和 sgRNA 的同一质粒上携带抗生素筛选标记（如嘌呤霉素），可确保几乎 100% 的细胞均表达 Cas9-sgRNA，从而显著提高基因编辑成功的可能性。（3）为了有效感染人胚胎干细胞（hESCs），必须浓缩慢病毒载体以获得高滴度病毒。在多种技术中，最经济的方法是使用大体积的慢病毒液（LVS），将其浓缩至原体积的 100 至 500 倍，以达到 107 至 108 IU/mL 的病毒滴度。（4）在 HEK293T 细胞中进行质粒转染时，使用聚乙烯亚胺（PEI）进行慢病毒载体转染以包装病毒，其效率与常用的转染试剂脂质体（lipofectamine7）相当，且更具成本效益。（5）慢病毒的平均滴度应维持在 5 × 107 IU/mL 范围内。（6）需通过单细胞筛选进行克隆扩增，以在这些细胞中实现目标基因的纯合子缺失。（7）尽管先前研究显示，CRISPR-Cas9 介导的人多能干细胞基因编辑极少引起脱靶突变16,17，但仍建议检测潜在的脱靶位点。可通过高效的 gRNA 设计工具以最小化脱靶效应，并对编辑后的细胞系进行全基因组测序18，尤其是在具有临床意义的实验中。（8）最后，应通过 G 显带和高分辨率分析等方法验证所选克隆的正常核型，以确保无大规模基因组改变。此外，还可进行微核试验以评估微核形成的频率，从而判断是否存在基因组不稳定性。
该方法的主要局限性之一是使用了慢病毒载体系统，导致Cas9和sgRNA稳定整合到基因组中，从而在编辑后持续表达，这是不希望出现的情况。未来可以通过用药物诱导型启动子替代组成型启动子来改进该方法，例如使用强力霉素处理的Tet-on系统，以实现对Cas9基因表达的可控调节。

人类胚胎干细胞（hESCs）和诱导性多能干细胞（iPSCs）是具有分化为体内所有细胞类型潜能的干细胞。这些细胞是研究人类发育以及理解各种疾病潜在机制的重要工具，因此在再生医学、疾病建模和药物发现方面具有巨大前景。此类研究涉及探讨特定基因如何参与生物体的发育、功能及调控过程1,2。
为了阐明基因功能，研究人员采用了多种技术和方法，包括基因敲除或过表达等遗传操作以及基因组编辑。其中，CRISPR-Cas9 技术已成为基因敲除和基因编辑研究中最高效的方法1,2,3。CRISPR-Cas9 系统通过使用一种单链向导 RNA（sgRNA）分子发挥作用，该分子被特异性设计用于识别并结合特定的目标 DNA 序列。作为分子向导，sgRNA 将 Cas9 酶引导至基因组中需要修饰的精确位置。一旦结合到位，Cas9 即在指定位置引发 DNA 的双链断裂。DNA 断裂后，细胞自身的修复机制被激活，主要包括两种修复途径：非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR）。NHEJ 通常在断裂位点产生插入或缺失（indels），从而导致基因的破坏或失活；而 HDR 则能够在断裂位点插入新的 DNA 序列，实现靶向遗传修饰的引入4。
鉴于基因敲除在多能干细胞中的重要性，已有多种关于利用CRISPR-Cas9技术在人胚胎干细胞（hESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）中实现基因敲除的实验方案发表。然而，这些方案中的许多存在显著局限性，例如耗时极长、劳动强度大，且由于采用非病毒基因递送方法，导致效率较低5。这些问题在hESCs/iPSCs中尤为突出，因为这些细胞相较于其他细胞类型已知具有更低的基因编辑效率5。通过提高携带Cas9和sgRNA的质粒递送效率，可在一定程度上克服上述部分限制。使用慢病毒载体系统可成功实现这一目标，并显著改善基因编辑效果。慢病毒包装方案成熟且操作简便，便于实验室广泛采用，即使经验有限的研究人员也能轻松掌握。慢病毒在多种细胞类型中均表现出高效的感染能力，包括hESCs和iPSCs。因此，在hESCs/iPSCs中开展常规基因功能研究时，采用慢病毒系统表达Cas9-sgRNA是理想的选择。
本文提供了一种简单直接的方法，可在比传统方案更短的时间内实现人胚胎干细胞（hESCs）中高效基于CRISPR-Cas9的基因删除（图1）。尽管本研究使用了组成型表达Cas9和sgRNA的慢病毒载体，但也可轻易替换为药物可诱导的Cas9表达系统，以实现对Cas9表达的可控调节。

<table><tbody><tr><td>2-巯基乙醇&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>38.5 mL，无菌且经认证的开放式超透明管&lt;br/&gt;</td><td>Beckman Coulter</td><td>C14292</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stem cell technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>bFGF 重组人源</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0261</td><td></td></tr><tr><td>Brachyury 兔单克隆抗体</td><td>Abclonal</td><td>A5078</td><td></td></tr><tr><td>BsmBI-v2</td><td>NEB</td><td>R0739S</td><td></td></tr><tr><td>chir99021</td><td>Tocris</td><td>4423/10</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel 基底膜基质，无LDEV</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>环杷明</td><td>Stem cell technologies</td><td>72074</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>11995073</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 营养混合物 F12&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>不含 Ca 和 Mg 的 DPBS</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FoxA2/HNF3&amp;beta;&amp;nbsp;</td><td>CST</td><td>8186</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) 兔单克隆抗体</td><td>CST</td><td>2118S</td><td></td></tr><tr><td>温和细胞解离试剂</td><td>Stem cell technologies</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>HyClone 非必需氨基酸 (NEAA) 100倍溶液</td><td>GE healthcare</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67 (D3B5) 兔单克隆抗体</td><td>CST</td><td>9129</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut 血清替代物</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺，100倍</td><td>Invitrogen</td><td>2924190090</td><td></td></tr><tr><td>L2H-BMSBSP-F1</td><td>Macrogen</td><td></td><td>CGTGCGGGTTCGCGTCTGGG</td></tr><tr><td>L2HGDH 多克隆抗体</td><td>Proteintech</td><td>15707-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA1-F</td><td>Macrogen</td><td></td><td>CACCGCGTGCGG&lt;br/&gt; GTTCGCGTCTGGG</td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA1-R</td><td>Macrogen</td><td></td><td>AAACCCCAGACGC&lt;br/&gt; GAACCCGCACGC</td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA2-F</td><td>Macrogen</td><td></td><td>CACCGCCCGCGG&lt;br/&gt; GCTTTTCGCCGG</td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA2-R</td><td>Macrogen</td><td></td><td>AAACCCGGCGAA&lt;br/&gt; AAGCCCGCGGGC</td></tr><tr><td>L2H-SeqF1</td><td>Macrogen</td><td></td><td>GCTAAAGAGCGC&lt;br/&gt; GGGTCCTCGG</td></tr><tr><td>L2H-SeqR1</td><td>Macrogen</td><td></td><td>GTGGACGGGTTG&lt;br/&gt; TTCAAAGCCAGAG</td></tr><tr><td>L2H-UMSBSP-R1</td><td>Macrogen</td><td></td><td>GTGGACGGGTTG&lt;br/&gt; TTCAAAGCCAGAG</td></tr><tr><td>LentiCRISPRv2</td><td>Addgene</td><td>52961</td><td></td></tr><tr><td>mTesR1 完全培养基</td><td>Stem cell technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>Nanog 抗体</td><td>CST</td><td>3580</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基 1x CTS</td><td>Invitrogen</td><td>A1371201</td><td></td></tr><tr><td>Neuropan 2 补充剂 100倍</td><td>PAN Biotech</td><td>P07-11050</td><td></td></tr><tr><td>Neuropan 27 补充剂 50倍</td><td>PAN Biotech</td><td>P07-07200</td><td></td></tr><tr><td>Oct-4 抗体</td><td>CST</td><td>2750</td><td></td></tr><tr><td>Pax6 (D3A9V) XP 兔单克隆抗体</td><td>CST</td><td>60433</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene 感染试剂</td><td>Sigma</td><td>TR1003- G</td><td></td></tr><tr><td>支化聚乙烯亚胺</td><td>Sigma</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2.0</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>Invitrogen</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>qPCR 慢病毒滴度检测试剂盒</td><td>Abm</td><td>LV900</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 抑制剂 Y-27632&lt;br/&gt; 二盐酸盐&amp;nbsp;</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>Tocris</td><td>1614/10</td><td></td></tr><tr><td>Sox2 抗体</td><td>CST</td><td>2748</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>U6-459F</td><td>Macrogen</td><td></td><td>GAGGGCCTATT&lt;br/&gt; TCCCATGATTC</td></tr><tr><td>Wizard 基因组 DNA 纯化试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td></td></tr><tr><td>XAV 939</td><td>Tocris</td><td>3748/10</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr-cas9 介导的无饲养层培养条件下人多能干细胞基因敲除

CRISPR-Cas9 Mediated Gene Deletion in Human Pluripotent Stem Cells Cultured Under Feeder-Free Conditions

用于基因组编辑的CRISPR-Cas9系统已彻底改变了包括干细胞在内的哺乳动物细胞中基因功能的研究。然而，该技术的实际应用，特别是在多能干细胞中，仍面临一些挑战，例如耗时长、劳动强度大以及编辑效率低。本文描述了一种利用高效且稳定的慢病毒介导的基因递送系统，在稳定表达针对L2HGDH基因的sgRNA的人胚胎干细胞（hESC）系中实现CRISPR介导的基因敲除的方法。靶向L2HGDH基因第1外显子的sgRNA经化学合成后克隆至lentiCRISPR v2-puro载体中，该载体将sgRNA与Cas9的组成型表达整合于一个高效的单载体系统中，从而获得更高的慢病毒滴度以感染hESC，并通过嘌呤霉素实现稳定筛选。经嘌呤霉素筛选的细胞进一步扩增，并采用有限稀释法获得单细胞克隆。扩增单克隆后，获得了多个L2HGDH基因的纯合敲除克隆，Western blot分析显示L2HGDH表达量完全降低100%。此外，通过MSBSP-PCR技术，将CRISPR突变位点定位在所选纯合克隆中Cas9的PAM识别序列上游。随后进行Sanger测序以分析确切的插入/缺失情况，并对克隆进行了功能表征。与先前报道的非病毒基因递送方法相比，该方法产生的纯合缺失比例显著更高。尽管本研究聚焦于L2HGDH基因，但这种稳健且经济高效的方法也可用于在多能干细胞中构建其他基因的纯合敲除，以开展基因功能研究。

将 L2HGDH sgRNA 克隆至 lentiCRISPRv2 puro 载体 
lentiCRISPRv2 puro 载体购自商业来源（见材料表），并用 BsmB1 进行酶切，释放出一个 1.8 Kb 的填充片段。如图 2A所示，载体完全被酶切。对于每个构建体，使用反向 sgRNA 序列作为引物，并结合载体序列内的正向引物（U6-459F），对六个克隆进行插入片段存在与否的筛选。采用该方法，仅含有插入片段的克隆可扩增出 288 bp 的 PCR 产物，而不含 sgRNA 反向序列的阴性克隆则无 PCR 产物，如图 2B所示。
H9 感染、稳定筛选及蛋白质印迹分析 
人胚胎干细胞（hESCs）被表达两种不同靶向 L2HGDH 基因第一外显子的 sgRNA 的慢病毒颗粒感染，并用嘌呤霉素进行筛选。通过对稳定共表达 sgRNA 和 Cas9 的异质细胞群体进行蛋白质印迹分析，以确定两种 sgRNA 中哪一种在诱导基因缺失方面更有效。如图 3A所示，在降低异质细胞群中 L2HGDH 表达水平方面，L2HGDH-sgRNA-1 比另一种序列更有效。
克隆筛选、扩增与蛋白质分析 
对表达 L2HGDH-sgRNA-1 的细胞进行单细胞筛选和克隆扩增。标记获得单克隆的孔，并继续培养至克隆达到足够大小（通常为2周），以便进一步扩增、冻存和分析（图3B）。共对22个克隆进行了蛋白质印迹分析，其中获得5个纯合敲除克隆（占23%），针对 L2HGDH 基因。该结果表明，利用慢病毒介导的基因递送实现sgRNA与Cas9在同一表达盒中的稳定共表达，具有较高的基因敲除效率。图4 展示了这5个纯合敲除克隆与对照细胞的蛋白质印迹分析结果，显示所选克隆中目标蛋白表达量相比对照组减少100%。
在DNA水平上的分析 
为了定位Cas9的PAM识别序列上游的CRISPR突变位点，使用对照细胞以及五个不同克隆的基因组DNA进行了基于突变位点特异性引物的聚合酶链式反应（MS-BSP PCR）。如图5所示，两个克隆（A5和B4）的突变位点紧邻PAM识别序列，而另外三个克隆（A1、A9和B12）的突变可能距离PAM位点较远，位于L2HGDH基因第一外显子内20bp的sgRNA序列更上游的位置。
为了确定DNA中的确切突变，对对照细胞（仅感染空载体的H9细胞）以及三个不同的CRISPR克隆A5、A1和B4的纯化PCR产物进行了Sanger测序，并利用ClustalW多重比对工具在PAM位点上游定位了突变位点8。结果表明，A5克隆在PAM位点上游存在缺失突变。另外两个克隆A1和B4则在PAM位点上游显示出插入突变，如图6中所示。
克隆的功能分析 
在生成hESCs中的CRISPR敲除细胞系后，下一步是验证其多能性及分化潜能。为此，我们检测了三个不同克隆（A1、A5和B4）的多种多能性标志物，并将结果与对照组（仅载体感染的H9细胞）进行比较。结果显示，通过OCT4、NANOG和SOX2标志物的免疫染色检测，敲除细胞系的多能性潜能未发生改变。接着，我们对对照组和敲除细胞系也进行了细胞增殖标志物KI67的染色，结果同样显示敲除细胞系与对照组相比无明显差异。这些结果表明，CRISPR敲除未影响这些细胞的自我更新特性。此外，拟胚体形成和克隆形成能力也未受到影响（图7）。使用 体外 我们实验室建立的方法，所有克隆均成功分化为三个胚层细胞，免疫染色结果显示PAX6（神经外胚层标志物）、Brachyury（中胚层标志物）和FOXA2（内胚层标志物）呈阳性。与对照细胞相比，基因敲除细胞系的分化潜能未见改变，表明敲除细胞保留了其分化能力图8).
<img alt="CRISPR 基因编辑工作流程图、慢病毒载体构建、HEK 293T 转染、克隆。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图 1：研究设计的五个步骤示意图。步骤 1：将 sgRNA 设计并克隆至经 Bsmb1 消化处理的 V2 CRISPR 载体中。步骤 2：利用携带 sgRNA 的入门载体与包装质粒共同转染 HEK293T 细胞（通过多质粒共转染法）生成慢病毒颗粒，并采用超速离心法浓缩病毒。步骤 3：以感染复数（MOI）为 10–20 的慢病毒颗粒感染人胚胎干细胞（hESCs），随后使用嘌呤霉素进行稳定细胞系筛选，并分析异质性细胞群体以评估 sgRNA 的编辑效率。步骤 4：从在异质性群体中表现出最高敲低效率的细胞中，采用有限稀释法进行单细胞克隆，并筛选获得单克隆细胞系。步骤 5：扩增单克隆细胞系，并在 DNA 水平、蛋白质水平以及功能层面分析克隆的干性特征和分化潜能。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于DNA分离分析的sgRNA构建体的凝胶电泳图，包含大小标记。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：sgRNA在lentiCRISPR V2.puro载体中的克隆。（A）使用限制性内切酶BsmB1对lentiCRISPR V2.puro载体进行酶切。箭头指示酶切后释放的1.8 Kb填充片段。（B）L2HGDH sgRNA构建体1和2不同克隆的菌落PCR分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="L2HGDH 和 GAPDH 的 Western 印迹分析；带比例尺的细胞培养显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：通过单细胞筛选进行的 Western 印迹分析和克隆扩增。（A）来自两组不同生物学重复（S1 和 S2）的稳定共表达 sgRNA（L2H-1 和 L2H-2）与 Cas9 的异质性细胞群体，以及对照（C）H9 人胚胎干细胞的 Western 印迹分析结果。（B）稳定表达 L2HGDH-sgRNA-1 的 H9 细胞的单细胞筛选与克隆扩增。箭头指示 96 孔板中仅含有单个克隆的孔。比例尺 = 100 µM。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="Western blot 分析，L2HGDH 和 GAPDH 表达，不同样本间的蛋白质比较" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图 4：H9 不同克隆的 Western blot 分析。 （A-C）对 22 个克隆的全细胞裂解液进行 Western blot 分析，获得 5 个 L2HGDH 纯合敲除克隆（占 23%）。 （D）通过另一次生物学重复实验的 Western blot 结果验证 L2HGDH 敲除效果。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="CRISPR 基因编辑；DNA序列分析；梯度PCR结果；SgRNA，PAM位点识别" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5：不同H9克隆的MSBSP PCR分析。（A）用于MSBSP PCR分析的L2HGDH外显子1的序列分析。（B）使用对照和H9 V2 L2HGDH KO克隆B4优化MSBSP PCR分析的退火温度。在96.8时，对照显示出条带，而B4未显示出条带，如箭头所示。（C）对所有纯合KO克隆的分析得出了外显子1内突变位点的如下定位。A1 = 插入/缺失远离PAM位点；A5 = 插入/缺失靠近PAM位点；A9 = 插入/缺失较靠近PAM位点；B4 = 插入/缺失非常靠近PAM位点；B12 = 插入/缺失不靠近PAM位点。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="NCBI序列与SRISPR克隆的Clustal比对图，显示PAM位点突变。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：Sanger测序PCR产物与参考L2HGDH外显子1序列的比对。将A1、A5和B4以及对照细胞的Sanger测序PCR产物与NCBI数据库中L2HGDH基因第一外显子的参考序列进行多序列比对。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="经DAPI染色的干细胞免疫荧光显微镜图像，显示基因表达分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图7"> 
图7：CRISPR基因敲除细胞系的功能表征。（A）对多能性标志物（OCT4、NANOG、SOX2）、自我更新能力（KI67）、拟胚体形成及克隆形成能力进行免疫染色，以对照感染的H9人胚胎干细胞为参照。比例尺：100 µM。（B）根据DAPI染色结果，计算阳性（+ve）表达细胞的百分比。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示经DAPI染色细胞及Pax6、Brachyury、FOXA2标志物分析的免疫荧光图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 8"> 
图8：CRISPR基因敲除细胞系的分化潜能。通过检测神经外胚层标志物PAX6、中胚层标志物Brachyury和内胚层标志物FOXA2的表达，对CRISPR基因敲除细胞系的分化潜能进行功能表征，并以感染对照的H9细胞作为参照。比例尺：100 µM。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>实验步骤</td>
			<td>所需时间</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>将sgRNA克隆至LentiCRISPRv2载体</td>
			<td>4天</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>慢病毒生产及滴度测定</td>
			<td>5天</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hESC感染、稳定细胞筛选与扩增</td>
			<td>2周</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>单细胞克隆筛选与扩增</td>
			<td>2周</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>克隆的功能分析</td>
			<td>2周</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：实验方案步骤的时间线及所需时间估算。

本方法描述了利用高效慢病毒介导的基因递送系统，在稳定表达靶向L2HGDH基因的sgRNA的人胚胎干细胞（hESC）系H9中，构建CRISPR介导的基因敲除。

CRISPR-Cas9 介导的无饲养层培养条件下人多能干细胞基因敲除

CRISPR-Cas9 基因组编辑系统在哺乳动物细胞（包括干细胞）的基因功能研究中引发了革命。然而，其实际应用……

首先，将人胚胎干细胞悬液接种至经Matrigel包被的24孔板中，每孔加入500 µL培养基。置于培养箱中过夜孵育，以促进细胞贴壁。次日，以感染复数为10的条件对已贴壁细胞进行感染，同时加入8 µg/mL的polybrene。将细胞在37摄氏度下孵育8小时。孵育结束后，更换为含有青霉素-链霉素但不含ROCK抑制剂的新鲜培养基。当细胞融合度达到90%时，向培养基中添加浓度为0.8微克/毫升的嘌呤霉素，以启动筛选过程。大约四到六天后，按1:4的比例传代稳定细胞，并扩大培养以进行冷冻保存和进一步分析。为进行单细胞筛选，制备含有500个细胞的细胞悬液，加入10毫升完全培养基。将100微升该悬液接种至96孔板的每个孔中。将细胞置于培养箱中静置三天，然后观察其进一步生长情况。随后标记含有单克隆的孔。每隔一天更换培养基，继续培养直至克隆生长至足够大小，可用于后续扩增、冷冻保存和分析，此过程通常需要两周时间。首先，获取向神经外胚层命运分化的人类胚胎干细胞。当细胞达到90%融合度时，使用200纳摩尔的LDN193189和10微摩尔的SB431542处理细胞，培养基为100% knockout血清替代物。初始培养24小时后，将细胞在含有2微摩尔XAV939的培养基中继续孵育两天。三天后，在八天内逐步降低无血清替代培养基的比例，从75%降至50%，再降至25%，最后完全替换为100% N2培养基。第12天，使用Pax6作为神经外胚层标志物，对细胞进行免疫染色固定。对于中胚层命运决定的研究，将70%汇合度的细胞在定型内胚层培养基中用3微摩尔的CHIR 99021处理24小时。随后使用 brachyury 作为中胚层特异性标志物对细胞进行免疫染色固定。为了研究内胚层阶段，加入不含 CHIR 99021 的定型内胚层培养基，并将细胞继续培养额外 24 小时。对于拟胚体形成实验，将细胞接种于低吸附细胞培养表面，省略 Matrigel，以进行悬浮培养。通过OCT4、NANOG和SOX2标志物的免疫染色检测，敲除细胞系A1、A5、B4与对照细胞相比，其多能性潜能未发生改变。针对细胞增殖标志物KI67的免疫染色显示，敲除细胞系与对照细胞相比，增殖速率无变化。与对照组相比，敲除细胞系的克隆形成和拟胚体形成均未受到影响。通过Pax6、brachyury和FOXA2标志物的免疫染色证实，敲除细胞系A1、A5、B4仍保留分化为三个胚层细胞的能力，其分化潜能与对照细胞相比未发生改变。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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本方案提供了一种利用CRISPR-CAS9在人类多能干细胞中实现特定杂合或纯合核苷酸改变的方法。...

利用CRISPR-Cas9在人类多能干细胞中产生特定基因组修饰

本文介绍了一种利用基于piggyBac的供体质粒和Cas9切口酶突变体，在人类多能干细胞中实现无缝基因编辑的详细方法。在人类胚胎干细胞（hESCs）中，将两个点突变引入肝细胞核因子4α（HNF4α）基因座的第8号外显子。...

利用无缝基因组编辑技术在人类多能干细胞中引入点突变

以下方案提供了将人诱导性多能干细胞（iPS细胞）适应于无饲养层培养的详细说明，使用完全 KnockOut...

无饲养层人诱导多能干细胞的适应、培养与传代——使用完全型KnockOut血清替代无饲养层培养基

学习CRISPR-Cas9介导的基因敲除技术在人胚胎干细胞H9中的应用。该方法利用慢病毒递送系统实现L2HGDH基因稳定敲除，同时保持细胞多能性和三胚层分化能力，为发育生物学和再生医学研究提供重要工具。

CRISPR-Cas9 介导的无饲养层培养条件下人多能干细胞基因敲除

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