Name: 异养酵母与光养分泌糖的蓝细菌相结合的共培养物的组装和定量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T13:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: 了解异养酵母与光养分泌糖的蓝细菌共培养体系的组装与定量监测方法。本方案结合荧光标记、粒子计数和流式细胞术，为微生物互作网络研究提供可靠技术支撑。

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本工作由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，DFG）资助——SFB1535——项目编号 458090666（项目 B03，资助对象为 KS、AM&#160;和 IA），以及大型科研仪器项目 INST 208/808-1。DCD 目前以 SFB1535 项目梅尔卡托研究员身份访问杜塞尔多夫海因里希·海涅大学（HHU Düsseldorf）。EJK 还获得了美国国家科学基金会奖助项目 #1845463 和 #2334680 的额外支持。

Protocol for Co-Culturing Sucrose-Secreting Cyanobacteria with Fungal Partners

作者无任何利益冲突需要披露。

在实验室环境中，对多种微生物模型进行单一无菌培养的操作已有数十年的历史。然而，尽管自然界中生命的主要形式是微生物群落，但在同一培养容器中组合两种或多种微生物伙伴的技术仍不够成熟，且面临现有知识和方法学上的空白所带来的挑战。预测群落中细胞的行为也更加困难，因为细胞之间会产生 emergent 相互作用和代谢物交换，从而显著影响共培养体系的命运34,35。因此，建立共培养体系并非易事，涉及培养基的确定、共同生长条件的筛选、种间微量代谢物/信号分子的交换，以及随时间变化的共培养组成等多个层面。近年来，在光合型、分泌糖类的蓝细菌与异养型伙伴的组合构建方面取得的进展，现已能够初步总结出一些规律和方法，为设计新型共培养组合提供有益的指导。基于这些知识，本实验方案的第一部分提供了构建包含蔗糖分泌型蓝细菌与一种或多种酵母的共培养体系的逐步操作指南。
在首次尝试建立非相关微生物共培养体系时，一个关键考虑因素是选择一种共同培养基，以满足两种或多种物种的全部营养需求。由于篇幅限制，此处无法提供该过程的完整详细方案（在某些情况下可能还需要高度定制化），但以下内容概述了需要重点考虑的几个方面。一种直接的初步方法是将典型的蓝细菌培养基（例如BG11；见表1）与目标异养微生物已建立的最小培养基进行比较。将异养型最小培养基中存在但标准蓝细菌培养基中缺失的组分添加至后者中，是初始测试的良好起点8,36。需要注意的是，由于最小培养基通常添加了较高浓度的有机碳源以支持异养生长（例如1%–4%葡萄糖），其设计往往旨在支持较高的异养菌细胞密度，而这一密度在初期共培养实验中可能难以达到。同样，某些常见的培养基成分本身也可作为有机碳源，独立于蓝细菌伙伴提供的光合产物（例如柠檬酸盐），这可能会使后续对蓝细菌/异养菌共培养体系的分析变得复杂。因此，在设计共培养基时，可能无需以完整浓度补足蓝细菌最小培养基中缺失的所有成分。例如，许多生物对环境中不同形态氮源（如N2、硝酸盐、亚硝酸盐、尿素）的利用效率各不相同，甚至可能完全无法利用某些高度氧化的氮源。类似地，许多微生物因缺乏合成某些化合物的完整生物合成途径，可能需要额外补充必需维生素（如维生素B12）、辅因子或必需氨基酸。基于上述原因，最实用的策略可能是首先简单地&#34;合并&#34;蓝细菌伙伴的标准最小培养基（例如BG11）与异养菌的明确定义的最小培养基（例如合成定义培养基[SD]）。随后可通过多轮迭代去除或减少冗余成分，以优化培养基并降低可能抑制任一伙伴生长的化合物丰度。一个有效的起始点是将培养基缓冲至中性或微碱性pH，因为大多数模式蓝细菌通常偏好此类条件。
此时，当提供过量蔗糖时，通常有助于对新共培养体系中固定化的异养生物进行初步生长测试。当然，在选择潜在的异养生物时，重要的是挑选能够分解利用由蓝藻伙伴提供的主要有机碳源的菌种。需要指出的是，蔗糖作为许多工程化蓝藻/异养共培养体系中主要提供的碳水化合物4，其被异养微生物普遍利用的程度不如葡萄糖：异养物种必须编码特异性的蔗糖转运蛋白，或者可能需要胞外转化酶将蔗糖分解为果糖和葡萄糖，而后者通常可被高亲和力转运蛋白识别8。多个研究混合微生物群落的实验室普遍报道的一个重要现象是，光合伙伴与异养伙伴之间会出现高阶的协同或拮抗效应4,8,13。例如，其他天然分泌的代谢物（如有机酸、还原态氮）或辅因子（如铁载体）可能会使共培养条件下一个或两个伙伴的生长速率高于无菌对照。相反，光合作用中水分解导致的培养基过度氧合等潜在有害代谢副产物，已被报道会引起一个或两个伙伴的种间生长抑制8。因此，无菌对照可提供有用的基准，但由于这些涌现性特征的存在，共培养的实际表现可能与预期有所不同。
根据异养伙伴以及 S. elongatus 分泌蔗糖的能力（取决于诱导水平和所用 IPTG 浓度），应测试两种生物的不同比例。共培养的成功主要取决于 S. elongatus 维持异养伙伴生长的能力（即是否能产生足够的碳源）。虽然异养菌株的过度生长通常受限于共培养基中提供的有机碳含量不足，但蓝细菌可能超过异养菌的生长速度，从而导致出现抑制性相互作用（例如过高的氧气条件8,13）。&#160;在初步确定蓝细菌与酵母之间合适的细胞密度比例时，一个合理的近似原则是：蓝细菌伙伴能够支持与其自身细胞体积相等的异养细胞体积。由于真核酵母的细胞体积通常显著大于模型蔗糖分泌型蓝细菌，这意味着在稳态下蓝细菌的细胞密度可能显著更高（例如，对于 S. cerevisiae 可能高出 50 至 100 倍）。因此，在特定实验室条件和物种背景下建立新的共培养体系时，一个良好的起点是根据文献数据（例如参见 B10NUMB3R537）计算蓝细菌和酵母的平均细胞体积，以估算其体积比。初始培养瓶可按此细胞比例接种。为了探索最优条件范围，研究人员可保持蓝细菌浓度恒定（例如 OD750 = 0.3），同时根据可用的光合培养空间通量，以约一个数量级的幅度逐步调整酵母细胞浓度。当然，这一体积“经验法则”依赖于光合伙伴分泌可被异养伙伴利用的有机光合产物（如蔗糖）的速率。一旦建立了共培养条件，随时间仔细监测两个伙伴的生长表现将提供有关理想物种比例的宝贵数据，特别是当早期共培养体系能够维持数天至数周时，可使研究人员识别出共培养末期达到的稳态比例。这些信息可用于后续实验中选择每种伙伴物种的初始接种密度，从而帮助培养体系更快地达到自适应的理想物种比例。
在实验方案的第二部分，提供了共培养分析的详细说明。对共培养体系进行可靠的定量是其成功实施的关键：光合自养且分泌碳源的伙伴菌的生长（或至少代谢活性）对于维持异养菌的生存至关重要。尽管接种时所用的蓝细菌与异养菌的比例并不总是需要优化（因为长期共培养通常会趋向于稳定的组成比例），但整合一些方法来防止任一伙伴菌不受控地生长仍可能十分重要，例如通过培养物稀释或对一个或多个物种进行包封36,38,39,40。如上所述，蓝细菌伙伴产生的副产物在高浓度下可能对异养菌具有抑制作用（例如 O2），而异养代谢的某些产物也可能损害蓝细菌的健康。大多数已发表的共培养体系所采用的异养菌生长速率通常快于大多数模式蓝细菌物种；因此，异养菌的生长速率往往受限于蓝细菌所提供的有机碳供应量。尽管如此，确定随时间变化的物种丰度动态对于揭示稳定性失败的原因，并优化长期培养中稳健的共培养体系具有关键意义。
本文提供了使用计数板、颗粒计数器和单细胞流式细胞术进行定量的实验方案。所有这些技术都是共培养体系表征的有用工具，但各自具有不同的前提条件、优势和局限性。只要培养体系中的所有组分能够通过细胞形态或其他特性在显微镜下被清晰区分，计数板就具有非常广泛的适用性。其最大优势在于设备价格低廉，几乎每个实验室都能配备。除了可以获得共培养体系的组成及各组分比例信息外，还能同时观察细胞的形态特征和生长状态，并检测可能存在的污染物。然而，计数板的使用也非常耗时，工作量大，且通量较低。
颗粒计数器和单细胞流式细胞术均具有高通量以及操作便捷、节省时间的巨大优势。细胞计数依赖于共培养体系中各组分细胞在尺寸上的明显差异，而单细胞流式细胞术还可通过区分荧光标记，实现对包含两个以上相同大小成员的共培养体系，甚至基于不同荧光标记来区分同一生物体的两种不同突变体的定量分析。在所提供的Synechocystis与S. cerevisiae和U.&#160;maydis人工组装示例中，利用细胞内荧光报告蛋白mKate2和eGFP来区分两种酵母。相同的荧光报告蛋白也可用于区分同一生物体（例如S. cerevisiae）的两种基因修饰菌株，这些菌株仅依靠其光散射特性无法被区分。类似策略已被用于追踪合成细菌群落41。根据细胞类型、群落中组分的数量及其潜在的自发荧光范围，荧光标记的选择需格外谨慎，以避免光谱特性的重叠，尤其是考虑到蓝细菌具有自发荧光的特性42。
本文阐述了如何在科学数据的存储、管理和共享方面遵循FAIR&#160;指导原则。FAIR是“可发现（Findable）、可访问（Accessible）、可互操作（Interoperable）和可重用（Reusable）”的缩写43。随着这些原则被越来越广泛地接受，它们有望改变生物研究的格局，推动数据管理与使用朝着更加开放、协作和高效的方向发展。尽管将数据存入注释性研究背景（Annotated Research Context, ARC）44可确保可访问性的关键组成部分，但使用开源软件重现数据处理步骤同样至关重要。原始FCS文件存储了流式细胞术实验的数据和元数据（包括激光器和检测器的信息，如波长、滤光片等）45。这些文件可在专有软件之外加载和读取，从而实现复杂的数据分析；例如，已有多个工具包支持在Python环境中处理原始数据。所介绍的工具包展示了如何利用Python中众多可用工具包之一，在不依赖专有软件的情况下加载、读取和可视化包含细胞计量数据的原始.fcs文件23。使用上述开源软件可避免专有软件带来的高昂许可费用，提供对数据处理全过程（如转换、补偿、设门等）的完全控制，并可在同一平台集成多种工具。
将单细胞流式细胞术与细胞分选仪联合使用的一个重要附加优势是，还可通过FACS收集特定类型的细胞。这对于应用各种组学技术深入研究共培养体系中的物种相互作用（如RNA测序或代谢组学）具有极高价值。这类设备明显的缺点是价格昂贵，因此在某些实验室中，此类仪器的可负担性和可及性可能成为明显的限制因素。
有趣的是，对共培养体系中三种伙伴微生物的多种定量方法进行直接比较后发现，不同技术之间的结果具有很好的一致性，表明基于光密度（OD）测量构建的混合体系可通过所有描述的方法进行可靠定量。值得注意的是，蓝细菌的总数量约为两种酵母物种数量的3至4倍，这一现象可能源于蓝细菌细胞尺寸较小。该观察结果与普遍认知相符，即在未校准的情况下，光密度值无法提供实际细胞数量的信息46。而两种酵母的计数结果则处于相近水平（表2 和 表3）。此外，与单一种类培养物的定量结果相比表明，这三种方法均为区分不同细胞类型的可靠工具，但颗粒计数器除外，因其未能区分两种酵母物种。
本质上，单细胞流式细胞术应用无疑是监测共培养体系组成的最强大工具，能够实现每秒计数 1,000 至 10,000 个细胞。当共培养的伙伴种类超过两种，或伙伴之间在形态和/或直径上相似时，这一优势尤为明显。值得注意的是，目前存在多种可用于监测共培养体系的替代方法。例如，可通过荧光测定法或微型生物反应器连续追踪荧光标记微生物在共培养中的生长情况47。然而，这些方法通常仅限于两种伙伴的共培养，且需要严谨的实验设计，例如在荧光标记物的选择方面。扩增子测序（16S rRNA 测序）及其他与复杂生物信息学分析相结合的高通量测序技术，是表征合成微生物群落的另一种选择48,49,50。这些技术适用于高通量研究，可用于分析长期培养中已建立的相互作用、进化相关问题，或追踪多种微生物伙伴之间的突变情况。
综上所述，经过合理设计的简化微生物共培养体系提供了一种强大的方法 &#34;自下而上&#34; 一种用于研究物种间动态关系的方法，而这种动态关系在自然界占主导地位的多物种群落中往往更难探究51,52,53在此提供一种简化的实验方案，可供科学界 readily 采用，以建立和分析新的蓝细菌与异养伙伴的配对组合。显然，要充分利用人工微生物共培养体系可能带来的基础性研究洞见，并确定人工设计的微生物群落是否能够实现文献中常赋予它们的生物技术应用潜力，仍需开展大量研究。

近年来，随着基因组工具和DNA技术的迅速发展，生物工程研究 increasingly 能够将微生物混合群落视为可行的生物生产策略，而不再局限于单一纯培养体系。相较于单一种类的微生物培养，微生物群落具有多种潜在优势，包括功能特化与分工协作、环境适应性与稳定性，以及底物利用效率的提升1。然而，由于物种间相互作用所引发的高阶行为具有不确定性，多物种群落的可预测性工程设计面临复杂挑战2。种间信号传递与代谢物交换是实现分工协作原则的核心机制，但同时也可能导致群落成员之间出现意料之外的协同或拮抗效应3。要充分挖掘混合微生物群落的潜力，该领域仍需取得显著进展，其中包括开发灵活的双菌和三菌共培养平台，以自下而上（&#34;bottom up&#34;）的方式更深入地表征和理解微生物之间的相互作用。
目前，该领域内正在使用的共培养平台主要有几种主导类型，包括互补的营养缺陷型伙伴，以及能够分泌对多种微生物普遍有益的代谢物的微生物。在后一类中，蓝细菌已被改造为通过引入特定代谢途径而成为高效的初级生产者，这些途径可促进其分泌易于代谢的碳水化合物，并已在多种理性设计的微生物群落中得到研究。简而言之，在此类工程化微生物群落中，蓝细菌伙伴能够利用光和CO2作为主要输入物质，通过产氧光合作用过程，这些菌株可分泌中心碳糖作为公共产物。其中一类工程化蓝细菌菌株已被改造为能够分泌二糖蔗糖4。这类菌株之所以可能取得成功，是因为蔗糖是一种接近多种生物中心碳代谢的代谢物，且常作为所谓的&#34;相容性溶质&#34;大量积累，以适应多种非生物环境胁迫5。在多种蓝细菌模式生物中，仅需少量的遗传干预即可实现高效的蔗糖分泌4。
能够分泌蔗糖的蓝细菌是研究理性设计微生物群落的有用平台，因为多种异养微生物可以将蔗糖作为其主要的碳源和能源进行代谢。事实上，已有许多实验室利用少数几种具备蔗糖分泌能力的模式蓝细菌，理性设计出包含一种或多种异养微生物的多物种共培养体系或群落，这些体系最终仅依赖光和CO2作为初始输入，无需额外补充有机碳源4。异养菌株可单纯依赖蓝细菌提供的碳水化合物生存，也可被用于将蔗糖原料转化为更高价值的生物产品（例如燃料、聚合物、色素等）。除了作为一种可持续生物生产的潜在策略外，此类简单的共培养体系还可作为研究非相关微生物物种之间涌现性相互作用的平台。
本文视频重点介绍利用产糖蓝细菌作为灵活平台的设计方法和先决条件，用于构建仅需补充光照和无机碳输入即可保持稳定的简单微生物群落。虽然含有单一已知微生物的培养体系的建立与监测通常较为直接，可通过光密度（OD）或背向散射法轻松实现，但当两种或多种生物共存于同一容器中时，这些方法便不再适用。其主要原因是这些检测手段无法区分不同的微生物，因此只能提供培养物的整体信息，而无法解析各个生物个体的生长情况。此外，蓝细菌在400–750 nm范围内具有广泛的吸收光谱，若试图测定异养菌在OD600 处的光密度，会因藻蓝蛋白（在620 nm处有吸收峰）的存在而导致结果失真。因此，本文提供了在实验室中构建蓝细菌与异养菌混合群落的具体实验方案，以及可用于长期分析此类群落性能的通用检测方法。尽管这些方案主要针对一种模式蓝细菌（可分泌蔗糖）与一种或多种模式异养微生物的配对组合，但本研究的目的是为希望设计新型物种组合的研究人员提供参考资源，以加速此类共培养体系的优化过程。因此，除物种特异性操作步骤外，还包含了相关信息与策略，以便读者根据自身需求对这些方案进行调整和推广，从而建立个性化的微生物群落体系。
由于本文所述共培养平台具有灵活性，因此介绍了多种先前已报道可与分泌糖类的蓝细菌进行共培养的异养物种的实验方案。例如，提供了集胞藻Synechococcus elongatus PCC 7942 与常用实验室酵母酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae共培养的逐步操作方案。此外，本文还包含适用于评估其他模式物种共培养体系性能的实验方案，其中包括玉米黑粉菌Ustilago maydis的酵母形态形式。
本文重点介绍建立蓝细菌/异养生物共培养体系并随时间对这些混合群落的性能进行基本表征所需的一系列核心实验方案。具体而言，重点介绍了适用于准确统计不同物种的单细胞流式细胞术和颗粒计数方法，以及用于评估细胞形态的显微镜技术。这些实验方案旨在根据实际研究需求和可用设备进行调整和优化。重要的是，文中提供了在实验室中建立和监测共培养体系时所需的技术说明及其他注意事项。最后，还包含了使用 Python 软件包对原始 FCS6 文件进行非专有化数据分析的示例。总之，本研究的目标是使基于蓝细菌的共培养技术更广泛地为科学界所用。

<table><tbody><tr><td>10x Ph1 物镜</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>46 04 01-9904</td><td></td></tr><tr><td>525/40 nm 带通滤光片</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>A01-1-0051</td><td>FITC 滤光片（用于 488 nm 激光）</td></tr><tr><td>660/10 nm 带通滤光片</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>A01-1-0055</td><td>APC 通道（用于 638 nm 激光）</td></tr><tr><td>710/50 nm 带通滤光片</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B71092</td><td>PC5.5 通道（用于 561 nm 激光）</td></tr><tr><td>Multisizer 4e 专用 Accuvettes</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>A35473</td><td>带盖样品杯</td></tr><tr><td>Multisizer 4e 专用 30 &amp;mu;M 孔径管</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>C92760</td><td>毛细管</td></tr><tr><td>高压灭菌器</td><td>Lab Associates</td><td>EQM-ARBP</td><td>用于材料灭菌</td></tr><tr><td>ROTILABO&amp;reg; 挡板烧瓶，直颈，250 ml</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>LY95.1</td><td></td></tr><tr><td>BG11 / CoYBG11 组分</td><td>不同供应商</td><td></td><td>参见表 1&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>瓶顶式无菌过滤器</td><td>Sigmaaldrich</td><td>Z222593</td><td>用于培养基无菌过滤，避免使用高压灭菌</td></tr><tr><td>45 &amp;micro;m 毛细管</td><td>Omni Life Science</td><td>OLS 5651738</td><td></td></tr><tr><td>CASY 细胞计数仪 TTC 型</td><td>Schaerfe Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CASY 计数杯</td><td>Omni Life Science</td><td>OLS 5651794</td><td></td></tr><tr><td>CASYclean</td><td>Omni Life Science</td><td>OLS 5651786</td><td>清洗液</td></tr><tr><td>CASYton 溶液</td><td>Omni Life Science</td><td>OLS 5651808</td><td>等渗溶液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>离心管（50 mL）</td><td>Sigmaaldrich</td><td>CLS430828</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>BOC</td><td>270182-L</td><td>用于供应无菌蓝藻培养物及共培养体系</td></tr><tr><td>CONTRAD&amp;reg; 70</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>81911</td><td>深度清洁液</td></tr><tr><td>盖玻片 20 &amp;times; 26 × 0.4 mm</td><td>VWR International GmbH</td><td>631-1190</td><td>计数室用盖玻片</td></tr><tr><td>比色皿</td><td>Sarstedt&amp;nbsp;</td><td>67.742</td><td></td></tr><tr><td>蓝藻 BG-11 淡水培养基溶液</td><td>Merck KGaA</td><td>C3061</td><td></td></tr><tr><td>CytExpert 软件 v. 2.6</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>流式细胞仪应用软件</td></tr><tr><td>CytoFLEX 鞘液</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B51503</td><td>鞘液</td></tr><tr><td>CytoFLEX S 流式细胞仪</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>BE51180</td><td></td></tr><tr><td>Multisizer 4e 专用 DxH 清洁剂</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>628022</td><td>清洗液</td></tr><tr><td>Eppendorf 管小型离心机</td><td>Labstac</td><td>CEN16-15</td><td>用于离心少于 2 mL 的培养物</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>K928.1</td><td></td></tr><tr><td>FACS 管</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>2523749</td><td>半自动模式用管</td></tr><tr><td>FlowClean 清洁剂，500 ml</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>C48093</td><td>日常清洁液</td></tr><tr><td>量筒</td><td>Sigmaaldrich</td><td>Z131121</td><td>用于培养基配制</td></tr><tr><td>HEPPSO</td><td>Merck KGaA</td><td>R426725</td><td></td></tr><tr><td>Infors MultiTron 光照培养箱</td><td>Infors AG</td><td></td><td>白色 LED 光源</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Merck KGaA</td><td>I6758</td><td>分装保存于 -20&amp;deg;C，使用时融化并置于冰上&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Multisizer 4e 专用 Isoton II</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>8448011</td><td>等渗溶液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Kaluza v. 2.2</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B16406</td><td>流式细胞术数据分析软件</td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>VWR International GmbH</td><td>115-2221</td><td>无尘擦拭纸</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Merck KGaA</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>KPO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Noah Chemicals</td><td>7790-53-6</td><td></td></tr><tr><td>烧杯</td><td>VWR</td><td>213-3747</td><td></td></tr><tr><td>96 孔微量板，滑盖，平底，聚苯乙烯，透明</td><td>SARSTEDT AG &amp; Co. KG</td><td>82.1581.001</td><td></td></tr><tr><td>显微镜底座</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>47 09 18-9902/16</td><td></td></tr><tr><td>显微镜镜体</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>47 30 14</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q 超纯水系统</td><td>Merck Millipore</td><td>C85358</td><td></td></tr><tr><td>Multisizer 4e 颗粒计数器</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B23005</td><td>CASY 细胞计数仪的替代设备</td></tr><tr><td>改进型 Neubauer 计数板，深度 0.02 mm</td><td>Assistent Germany</td><td></td><td>计数室</td></tr><tr><td>改进型 Neubauer 计数板，深度 0.1 mm</td><td>Paul Marienfeld GmbH &amp; Co. KG</td><td>640010</td><td>计数室</td></tr><tr><td>即用型日常质控荧光微球</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>C65719</td><td>质控参考标准</td></tr><tr><td>SCHOTT 瓶</td><td>Dutscher</td><td>90347</td><td>用于储存</td></tr><tr><td>Specord&amp;reg;200 Plus 分光光度计</td><td>Analytic Jena GmbH</td><td></td><td>OD600/750 测定</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Merck KGaA</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>台式大容量离心机</td><td>Labstac</td><td>CEN18-06R</td><td>收集培养物生物量</td></tr><tr><td>酵母氮源基础培养基（不含氨基酸，不含硫酸铵）</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>11743014</td><td></td></tr></tbody></table>

异养酵母与光合产糖蓝细菌共培养体系的构建与定量分析

Assembly and Quantification of Co-Cultures Combining Heterotrophic Yeast with Phototrophic Sugar-Secreting Cyanobacteria

随着对可持续生物技术需求的不断增长，包含光合微生物与异养伙伴物种的混合菌群正被探索作为太阳能驱动生物生产的手段。其中一种方法是利用能够固定CO2并分泌有机碳的蓝细菌，以支持共培养异养微生物的代谢活动，后者进而将碳源转化为更高价值的产品或服务。本实验方案提供了一套技术性描述，旨在协助研究人员建立一种将分泌蔗糖的蓝细菌菌株与真菌伙伴（以模式酵母物种为代表）进行共培养的体系。该方案阐述了建立共培养体系的关键前提条件：确定培养基组成、监测各伙伴物种单独生长的特性，以及对在同一培养容器中组合的多物种混合培养物进行分析。文中总结了用于共培养监测的基本实验技术，包括显微镜观察、细胞计数器和单细胞流式细胞术，并提供了符合FAIR（可发现、可访问、可互操作、可重复使用）原则的非专有软件示例，用于分析原始流式细胞术标准（FCS）文件数据。最后，还对在尝试建立分泌糖类的蓝细菌与新型异养伙伴共培养体系时经常遇到的瓶颈和潜在问题进行了评述。本方案为研究人员提供了一份资源指南，适用于构建包含蓝细菌与异养微生物的新共培养微生物组合。

光合生物共培养体系的建立 S. elongatus 和异养型酵母 
我们此前已报道了共培养的详细结果 Synechococcus elongatus PCC 7942 及其多种亚株 S. cerevisiae有关该蓝藻/酵母共培养结果的全面描述，请参见8为简洁和准确起见，此处不再重复这些结果。简而言之，先前的结果表明，在建立长期蓝细菌-酵母共培养体系时需考虑多个重要因素。其中首要问题是，酵母在仅由蓝细菌提供固定碳源的条件下能否存活，这在很大程度上取决于该酵母菌株利用蔗糖的效率。 S. cerevisiae 经进化或改造后能更高效代谢蔗糖的菌株27,28 在长期（数天至数周）的蓝藻共培养实验中，更有可能存活并过渡到共培养生长模式，达到更高的细胞密度，并表现出更强的稳健性8共培养接种的初始阶段对酵母活力尤为关键，这可能与培养物稀释、培养基成分转换和/或浓缩碳源的撤除所造成的应激有关。因此，在共培养启动时，采取措施缓解从营养较丰富的培养基向最低限度碳源供应环境的过渡，有助于提高实验的性能与重复性（参见步骤1.2.1.1）。此外， S. cerevisiae 表现出与高氧环境一致的应激反应，当接种至高密度培养物中时 S. elongatus，与O的形成一致2 作为产氧光合作用的主要副产物。因此，防止蓝藻共生体过度生长的努力和/或交替的“光照/黑暗”光周期可显著延长其存活性 S. cerevisiae 在长期共培养中。有关共培养相对于无菌对照样本常见的现象的进一步总结，请参见讨论部分。
使用不同方法监测共培养物的生长 
下文描述了采用三种不同方法对人工混合的三方共培养体系（包括集胞藻Synechocystis以及两种酵母S. cerevisiae和U. maydis）进行定量分析的示例。在制备混合培养物时，首先测定各单菌培养物的OD750（用于蓝细菌）和OD600（用于异养生物），并调整至OD值为0.1。随后按照光密度比1:1:1混合单菌培养物（需注意，光密度与细胞计数不同，参见上文）。为了便于在流式细胞仪中区分两种酵母，实验中使用了基因工程改造的报告菌株：持续表达细胞质mKate2荧光蛋白的S. cerevisiae FY1679-O1B29（基因型：URA3Δ/pTDH3::mKate2；菌株：S. cerevisiae mKate230），以及持续表达eGFP的U. maydis菌株AB3331（基因型：pep4Δ/pRpl40::egfp；菌株：U. maydis eGFP32）。值得注意的是，所用蓝细菌菌株携带一种复制型质粒，可驱动黄色荧光蛋白mVenus的组成型强表达（Synechocystis sp. PCC 6803 pSHDY-Pcpc560-mVenus，菌株Synechocystis mVenus，类似文献33），此外，该菌株还因含有光合系统而表现出典型的强烈自发荧光。
使用计数板进行显微镜下定量： 所用三种微生物人工混合物中的所有细胞类型均可通过显微镜轻松区分（图2A）：Synechocystis 和 S. cerevisiae 均呈球形细胞，但直径差异显著（Synechocystis：直径约1.5–3 µm，S. cerevisiae：直径约3–6 µm），而 U. maydis 细胞呈细长的雪茄状形态，长度至少为10 µm（图2A）。这些明确的形态学特征使得混合物中每种组分的精确定量成为可能。以一个示例说明，在四个大方格中分别计数到 S. cerevisiae 细胞数目为37、18、36 和 21（图2B），其平均值为28个细胞。由于所用血球计数板的每个大方格面积为1 mm2，计数室深度为0.02 mm，因此相当于每0.02 µL中含有28个细胞。换算后即为1,400 个细胞/µL，相当于1.4 × 106 个细胞/mL。其他细胞类型也以相同方法进行计数，并计算相应浓度（图2C，表2）。
<img alt="利用扫描电镜图像、数据表和流式细胞术象限图分析进行微生物鉴定。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67311/67311fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：由 Synechocystis 以及酵母 S. cerevisiae 和 U. maydis 组成的三菌共培养体系的显微定量分析。（A）指示微生物人工混合物的微分干涉对比（DIC）显微图像。所有物种均可通过其形态轻松区分。比例尺：10 µm。（B）基于OD值为0.1的纯培养物人工混合体系的代表性计数结果。分析了网格边缘的四个大方格（见图 1D中标记为红色的部分）。（C）利用四个方格中不同细胞计数的平均值，根据以下公式计算悬浮液中细胞的浓度：平均值/(计数室深度 [0.02 mm] × 计数方格面积 [1 mm2] × 1,000)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67311/67311fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
使用颗粒计数器进行定量分析：颗粒计数器可根据颗粒大小测定悬浮液中颗粒的数量。在本示例数据集中，使用了配备45 µm毛细管的颗粒计数器。由于S. cerevisiae和U. maydis细胞的尺寸相似，因此在颗粒计数器中无法区分二者，而较小的Synechocystis细胞则可被明显分离。单一种类培养物的分析结果显示，两种酵母在3至6 µm范围内出现位置相同的峰（图3A）。测量过程中施加负压，促使细胞进入毛细管，导致电阻发生短暂变化，仪器据此变化确定颗粒大小。在混合培养物中可检测到两个明显不同的峰，一个对应较小的蓝细菌细胞，另一个代表两种酵母细胞的合并组分（图3B）。值得注意的是，除了反映活细胞的峰之外，还在约1 µm处检测到额外的峰（图3），这些峰对应细胞碎片和更小的颗粒。信号若出现在比预期更大的直径范围，可能是由细胞聚集所致。需注意的是，峰的形状反映了细胞的均一性：尖锐的峰表示细胞高度均一，这在共培养体系中不太可能出现。在共培养体系中，若共存的两种细胞尺寸差异明显，则预期会出现非常宽的峰，甚至两个独立的峰。对于异养真菌的纯培养物，峰形可能为中等宽度。
<img alt="集胞藻属、黑粉菌属和酵母菌属在共培养分析中的细胞直径分布图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67311/67311fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：利用颗粒计数器对包含 Synechocystis mVenus 以及酵母 S. cerevisiae mKate2 和 U. maydis eGFP 的三元共生体系进行定量分析。（A）三种菌株各自纯培养物分析结果的可视化输出（使用45 µm毛细管的颗粒计数器），如图中所示。（B）在相同条件下对人工构建的三元共生体系进行分析的典型可视化输出文件。颗粒计数器无法区分两种酵母物种，二者在图中均由第二个峰表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67311/67311fig3v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
使用单细胞流式细胞术进行定量分析：借助单细胞流式细胞仪，可根据细胞的（自发）荧光和光散射特性轻松区分不同的细胞群体。光合细胞（Synechocystis）与异养细胞（U. maydis 和 S. cerevisiae）可通过光合色素在 APC-H 通道中检测到的红色自发荧光加以区分（图 4A）。在初步区分光合细胞与异养细胞的基础上，可通过 FITC-H 通道中的 eGFP 荧光标记和 PC5.5 通道中的 mKate2 荧光标记进一步区分两种异养细胞群体（图 4B、C）。在显示三个细胞群体散射特性的散点图（FSC-H 与 FSC-Width）中，各细胞群体也可被有效区分，仅有少量重叠（图 4D）。
采用该方法，取10 µL稀释后的样品以10 µL/min的流速进行分析，可在1 min内定量约70,000个细胞。其中约60%的细胞可归为集胞藻属（Synechocystis）（4.23 × 106 个细胞/mL），其余40%则平均分布于玉米黑粉菌（U. maydis）（1.35 × 106 个细胞/mL）和酿酒酵母（S. cerevisiae）（1.36 × 106 个细胞/mL，图4E，表2）之间。
<img alt="流式细胞术结果；混合培养物细胞群体的图示：异养型、eGFP、mKate2。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67311/67311fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：利用单细胞流式细胞术定量分析由蓝细菌 Synechocystis mVenus 以及酵母 U. maydis eGFP 和 S. cerevisiae mKate2 组成的三物种共培养体系。在流式细胞仪上检测 Synechocystis mVenus（深绿色）、U. maydis eGFP（浅绿色）和 S. cerevisiae mKate2（红色）以 ⅓ OD750 / ⅓ OD600 / ⅓ OD600 比例混合的培养物所获得的示例图：（A）显示所有细胞在 APC-H 通道（激发：638 nm，发射：660/10 nm）中的事件数与荧光强度直方图，用于根据自发荧光区分光养型与异养型细胞；（B）所有异养型细胞在 FITC-H 通道（激发：488 nm，发射：525/40 nm）中的事件数与荧光强度直方图，用于根据绿色荧光特性区分 U. maydis eGFP 与 S. cerevisiae mKate2 细胞；（C）所有异养型细胞在 PC5.5-H 通道（激发：561 nm，发射：710/50 nm）中的事件数与荧光强度直方图，用于根据红色荧光特性区分 U. maydis eGFP 与 S. cerevisiae mKate2 细胞；（D）FSC-Width 与 FSC-H 通道散射信号的点图，用于识别无荧光特性的细胞群体；（E）群体统计结果，包括事件数、百分比，以及相关荧光通道的算术平均值与标准差（SD）。细胞总数及其大小和荧光信号在 10 µL 样本体积、流速为 10 µL/min 的条件下测定。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67311/67311fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
为比较不同定量方法的结果，以下两个表格（表2 和 表3）列出了测定的细胞数量。采用前述三种方法测定的最终细胞浓度在所有方法中均处于相近的范围。细胞计数仪提供的样本量最高，其次是颗粒计数器和显微镜定量法，各方法之间大约相差一个数量级。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">1:1:1 共培养</td>
			<td>分光光度计</td>
			<td colspan="2">细胞计数仪</td>
			<td colspan="2">颗粒计数器</td>
			<td colspan="2">显微镜计数室</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">生物体</td>
			<td>OD750/600</td>
			<td>细胞计数</td>
			<td>细胞/mL</td>
			<td>细胞计数</td>
			<td>细胞/mL</td>
			<td>细胞计数</td>
			<td>细胞/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Saccharomyces cerevisiae mKate2</td>
			<td>0.0333</td>
			<td>13,618</td>
			<td>1.36 x 106</td>
			<td rowspan="2">1,546*</td>
			<td rowspan="2">2.58 x 106*</td>
			<td>112</td>
			<td>1.40 x 106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Ustilago maydis eGFP</td>
			<td>0.0333</td>
			<td>13,541</td>
			<td>1.35 x 106</td>
			<td>89</td>
			<td>1.11 x 106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Synechocystis sp. PCC 6803 mVenus</td>
			<td>0.0333</td>
			<td>42,330</td>
			<td>4.23 x 106</td>
			<td>3,094</td>
			<td>5.16 x 106</td>
			<td>271</td>
			<td>3.39 x 106</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：不同定量方法的比较：人工混合培养。 注意，使用颗粒计数器无法区分U. maydis 和S. cerevisiae（*）。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">单培养</td>
			<td>分光光度计</td>
			<td colspan="2">流式细胞仪</td>
			<td colspan="2">颗粒计数器</td>
			<td colspan="2">显微镜计数板</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">生物体</td>
			<td>OD750/600</td>
			<td>细胞计数</td>
			<td>cells/mL</td>
			<td>细胞计数</td>
			<td>cells/mL</td>
			<td>细胞计数</td>
			<td>cells/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Saccharomyces cerevisiae mKate2</td>
			<td>0.1</td>
			<td>38,936</td>
			<td>3.89 x 106</td>
			<td>1,928</td>
			<td>3.21 x 106</td>
			<td>403</td>
			<td>4.03 x 106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Ustilago maydis eGFP</td>
			<td>0.1</td>
			<td>36,927</td>
			<td>3.69 x 106</td>
			<td>2,465</td>
			<td>4.11 x 106</td>
			<td>307</td>
			<td>3.07 x 106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Synechocystis sp. PCC 6803 mVenus</td>
			<td>0.1</td>
			<td>127,864</td>
			<td>1.28 x 107</td>
			<td>8,186</td>
			<td>1.36 x 107</td>
			<td>428</td>
			<td>1.07 x 107</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：不同定量方法的比较：使用单一/无菌培养物进行校准。

本方案为共培养体系的建立和定量监测提供了全面的指导，包括光能自养型分泌糖类的蓝细菌与异养型酵母的共培养。

随着对可持续生物技术需求的不断增长，包含光合微生物与异养伙伴物种的混合菌群正在被……

我们的研究旨在了解涉及分泌蔗糖的蓝细菌与异养真菌的人工菌群中的微生物互作网络。过去，微生物学家通常研究单一微生物的纯培养物。然而在自然界中，微生物通常以菌群形式存在，因此理解混合培养中的微生物相互作用至关重要。一个主要挑战是找到合适的生长条件，包括能够支持所有共培养成员生长的培养基。本文主要关注优化光合成员的蔗糖产量和分泌量，以为异养成员的生长提供基础。对于无菌培养中生长情况的追踪，可采用光密度或背向散射测量等常规技术。然而，这些技术不适用于需要获得各物种单独细胞数量的共培养体系。在本方案中，我们结合荧光标记与细胞计数方法，以区分不同的共培养组分。此外，我们还证明，从简单、低成本到昂贵、高通量的各种不同方法均可获得相似的结果。首先，在培养培养物三天后，将蓝细菌细胞离心收集。将沉淀重悬于 25 毫升无菌 CoYBG-11 培养基中。在室温下以 4,000g 离心 20 分钟。然后通过倾倒弃去上清液。在测定光密度后，于无菌条件下向250毫升带挡板的锥形瓶中加入计算量的CoYBG-11。随后，加入计算体积的蓝细菌和异养细胞悬浮液，使最终培养体积达到50毫升。对于50毫升培养液，使用50微升的1摩尔IPTG储备液。然后将烧瓶置于光培养箱中，光照强度约为200微摩尔光子每平方米每秒。环境条件补充为：30摄氏度下添加2%二氧化碳，150转/分钟振荡培养，湿度保持在75%。取样时，将锥形瓶从培养箱中取出，并在无菌条件下从培养物中吸取1毫升样品。为准备显微镜下定量分析，请确保计数室和盖玻片无灰尘和细胞残留。通过轻轻施加压力，将盖玻片滑至两个支撑条上，正确放置，同时避免破损。当盖玻片正确放置后，观察两玻璃表面之间的牛顿环，同时确保盖玻片不发生滑动。随后充分混匀细胞悬液，并将数微升滴加至计数室边缘，通过毛细作用使液体完全充满计数室。然后使用光学显微镜的适当物镜，对准计数室的网格线进行聚焦。根据给定的细胞大小，计数相应方格内的细胞。若通过颗粒计数进行定量，则将样品的光密度调整至0.1。然后将10微升样品加入10毫升等渗测量缓冲液中。盖紧样品杯盖子，通过轻微倾斜样品杯的方式轻轻混匀样品。将样品杯放入颗粒计数器后，将带有适合所用细胞孔径的毛细管插入样品杯中，并关闭仪器门。启动测量并在适当的范围内进行记录。在此阶段可以区分不同细胞大小的细胞。进行单细胞流式细胞术定量时，应调整样品的光密度，使其适合流式细胞术测量。应用给定公式，确保在每分钟 10 微升的流速下，细胞计数保持在每秒 1,000 至 10,000 个细胞的范围内。将每种样品细胞悬液各 300 微升转移至 96 孔板中的独立孔内。然后将 96 孔板转移至流式细胞仪的自动进样器中。打开与样品相关的荧光和散射通道的散点图和直方图。为确定细胞浓度，使用记录功能采集定义的样品体积。根据光养生物在APC-H通道直方图中的红色自发荧光，区分光养生物与异养生物的信号。然后使用仅显示异养种群的 FITC-H 通道直方图，鉴定含有绿色荧光蛋白的异养细胞。使用 PC5.5-H 通道的直方图区分含有红色荧光蛋白的异养细胞与不含该蛋白的细胞。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

异养酵母与光养分泌糖的蓝细菌相结合的共培养物的组装和定量

来源：Jiang, H., Ho, M. 蓝细菌中完整藻胆体的分离与表征. J. Vis.

蓝细菌培养物制备用于生物量生产

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