异养酵母与光合产糖蓝细菌共培养体系的构建与定量分析

我们的研究旨在了解涉及分泌蔗糖的蓝细菌与异养真菌的人工菌群中的微生物互作网络。过去，微生物学家通常研究单一微生物的纯培养物。然而在自然界中，微生物通常以菌群形式存在，因此理解混合培养中的微生物相互作用至关重要。

一个主要挑战是找到合适的生长条件，包括能够支持所有共培养成员生长的培养基。本文主要关注优化光合成员的蔗糖产量和分泌量，以为异养成员的生长提供基础。对于无菌培养中生长情况的追踪，可采用光密度或背向散射测量等常规技术。

然而，这些技术不适用于需要获得各物种单独细胞数量的共培养体系。在本方案中，我们结合荧光标记与细胞计数方法，以区分不同的共培养组分。此外，我们还证明，从简单、低成本到昂贵、高通量的各种不同方法均可获得相似的结果。

首先，在培养培养物三天后，将蓝细菌细胞离心收集。将沉淀重悬于 25 毫升无菌 CoYBG-11 培养基中。在室温下以 4,000g 离心 20 分钟。

然后通过倾倒弃去上清液。在测定光密度后，于无菌条件下向250毫升带挡板的锥形瓶中加入计算量的CoYBG-11。随后，加入计算体积的蓝细菌和异养细胞悬浮液，使最终培养体积达到50毫升。

对于50毫升培养液，使用50微升的1摩尔IPTG储备液。然后将烧瓶置于光培养箱中，光照强度约为200微摩尔光子每平方米每秒。环境条件补充为：30摄氏度下添加2%二氧化碳，150转/分钟振荡培养，湿度保持在75%。

取样时，将锥形瓶从培养箱中取出，并在无菌条件下从培养物中吸取1毫升样品。为准备显微镜下定量分析，请确保计数室和盖玻片无灰尘和细胞残留。通过轻轻施加压力，将盖玻片滑至两个支撑条上，正确放置，同时避免破损。

当盖玻片正确放置后，观察两玻璃表面之间的牛顿环，同时确保盖玻片不发生滑动。随后充分混匀细胞悬液，并将数微升滴加至计数室边缘，通过毛细作用使液体完全充满计数室。

然后使用光学显微镜的适当物镜，对准计数室的网格线进行聚焦。根据给定的细胞大小，计数相应方格内的细胞。若通过颗粒计数进行定量，则将样品的光密度调整至0.1。

然后将10微升样品加入10毫升等渗测量缓冲液中。盖紧样品杯盖子，通过轻微倾斜样品杯的方式轻轻混匀样品。将样品杯放入颗粒计数器后，将带有适合所用细胞孔径的毛细管插入样品杯中，并关闭仪器门。

启动测量并在适当的范围内进行记录。在此阶段可以区分不同细胞大小的细胞。进行单细胞流式细胞术定量时，应调整样品的光密度，使其适合流式细胞术测量。

应用给定公式，确保在每分钟 10 微升的流速下，细胞计数保持在每秒 1,000 至 10,000 个细胞的范围内。将每种样品细胞悬液各 300 微升转移至 96 孔板中的独立孔内。然后将 96 孔板转移至流式细胞仪的自动进样器中。

打开与样品相关的荧光和散射通道的散点图和直方图。为确定细胞浓度，使用记录功能采集定义的样品体积。根据光养生物在APC-H通道直方图中的红色自发荧光，区分光养生物与异养生物的信号。

然后使用仅显示异养种群的 FITC-H 通道直方图，鉴定含有绿色荧光蛋白的异养细胞。使用 PC5.5-H 通道的直方图区分含有红色荧光蛋白的异养细胞与不含该蛋白的细胞。