Name: 小鼠头部固定虚拟现实的行为训练程序 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: 学习小鼠头部固定虚拟现实的行为训练方法，包括线性轨道导航和Y迷宫决策任务。该方案整合流体调控与球形跑步机适应训练，为神经科学和认知行为研究提供可靠的实验框架。

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本研究由国家环境卫生科学研究所（ZIC-ES103330）资助。特别感谢 Phenosys 公司的 K. Krepinksy 在系统硬件和软件特性方面提供的帮助，感谢牛津大学的 T. Viney 在行为范式方面的协助，最后感谢美国国立卫生研究院（NIH）的 G. Vargish 在其初步实验流程和手术方法方面给予的指导。

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<li>Fuhrmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locomotion%2C+Theta+oscillations%2C+and+the+speed-correlated+firing+of+hippocampal+neurons+are+controlled+by+a+medial+septal+glutamatergic+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Locomotion, Theta oscillations, and the speed-correlated firing of hippocampal neurons are controlled by a medial septal glutamatergic circuit.</a> Neuron. 86 (5), 1253-1264 (2015).</li>
<li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nat Neurosci. 13 (11), 1433-1440 (2010).</li>
<li>Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+large-scale+neural+activity+with+cellular+resolution+in+awake%2C+mobile+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice.</a> Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).</li>
<li>Leinweber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+in+mice+navigating+a+virtual+reality+environment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging in mice navigating a virtual reality environment.</a> J Vis Exp. (84), e50885(2014).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+evoked+fMRI+paradigms+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Sensory evoked fMRI paradigms in awake mice.</a> Neuroimage. 204, 116242(2020).</li>
<li>Burgess, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+methods+for+accurate+two-alternative+visual+psychophysics+in+head-fixed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">High-yield methods for accurate two-alternative visual psychophysics in head-fixed mice.</a> Cell Rep. 20 (10), 2513-2524 (2017).</li>
<li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+gesture+tracking+in+head-fixed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated gesture tracking in head-fixed mice.</a> J Neurosci Methods. 300, 184-195 (2018).</li>
<li>Aghajan, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+spatial+selectivity+and+intact+phase+precession+in+two-dimensional+virtual+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Impaired spatial selectivity and intact phase precession in two-dimensional virtual reality.</a> Nat Neurosci. 18 (1), 121-128 (2015).</li>
<li>Cushman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisensory+control+of+multimodal+behavior%3A+do+the+legs+know+what+the+tongue+is+doing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multisensory control of multimodal behavior: do the legs know what the tongue is doing.</a> PLoS One. 8 (11), e80465(2013).</li>
<li>Thurley, K., Ayaz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+reality+systems+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Zool%22%5BJournal%5D)">Virtual reality systems for rodents.</a> Curr Zool. 63 (1), 109-119 (2017).</li>
<li>Forro, T., Klausberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+behavior-related+activity+of+distinct+hippocampal+interneuron+types+during+odor-associated+spatial+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Differential behavior-related activity of distinct hippocampal interneuron types during odor-associated spatial navigation.</a> Neuron. 111 (15), 2399-2413.e5 (2023).</li>
<li>Cho, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+astrocytes+modulate+anxiety-like+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Hippocampal astrocytes modulate anxiety-like behavior.</a> Nat Commun. 13 (1), 6536(2022).</li>
<li>Lee, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+visualization+of+mRNA+synthesis+during+memory+formation+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Real-time visualization of mRNA synthesis during memory formation in live mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (27), e2117076119(2022).</li>
<li>Leinonen, H., Tanila, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vision+in+laboratory+rodents-Tools+to+measure+it+and+implications+for+behavioral+research%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Vision in laboratory rodents-Tools to measure it and implications for behavioral research.</a> Behav Brain Res. 352, 172-182 (2018).</li>
<li>Whishaw, I. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+rats+and+mice+in+a+swimming+pool+place+task+and+matching+to+place+task%3A+some+surprising+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Behav%22%5BJournal%5D)">A comparison of rats and mice in a swimming pool place task and matching to place task: some surprising differences.</a> Physiol Behav. 58 (4), 687-693 (1995).</li>
<li>Pinto, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+accumulation-of-evidence+task+using+visual+pulses+for+mice+navigating+in+virtual+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Behav+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An accumulation-of-evidence task using visual pulses for mice navigating in virtual reality.</a> Front Behav Neurosci. 12, 36(2018).</li>
<li>Tirado-Muniz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cage+mate-induced+postsurgical+trauma+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cage mate-induced postsurgical trauma in mice.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 62 (2), 170-178 (2023).</li>
<li>Barkus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refinements+to+rodent+head+fixation+and+fluid%2Ffood+control+for+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Refinements to rodent head fixation and fluid/food control for neuroscience.</a> J Neurosci Methods. 381, 109705(2022).</li>
<li>Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+dynamics+of+hippocampal+place+cells+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation.</a> Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).</li>
<li>Peirson, S. N., Brown, L. A., Pothecary, C. A., Benson, L. A., Fisk, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+and+the+laboratory+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Light and the laboratory mouse.</a> J Neurosci Methods. 300, 26-36 (2018).</li>
<li>Wenk, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+spatial+memory+using+the+T+maze%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Assessment of spatial memory using the T maze.</a> Curr Protoc Neurosci. Chapter 8, Unit 8 5B(2001).</li>
<li>d'Isa, R., Comi, G., Leocani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apparatus+design+and+behavioural+testing+protocol+for+the+evaluation+of+spatial+working+memory+in+mice+through+the+spontaneous+alternation+T-maze%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Apparatus design and behavioural testing protocol for the evaluation of spatial working memory in mice through the spontaneous alternation T-maze.</a> Sci Rep. 11 (1), 21177(2021).</li>
<li>Viney, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spread+of+pathological+human+Tau+from+neurons+to+oligodendrocytes+and+loss+of+high-firing+pyramidal+neurons+in+aging+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Spread of pathological human Tau from neurons to oligodendrocytes and loss of high-firing pyramidal neurons in aging mice.</a> Cell Rep. 41 (7), 111646(2022).</li>
<li>Krumin, M., Lee, J. J., Harris, K. D., Carandini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decision+and+navigation+in+mouse+parietal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Decision and navigation in mouse parietal cortex.</a> Elife. 7, e42583(2018).</li>
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<li>Harvey, C. D., Coen, P., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice-specific+sequences+in+parietal+cortex+during+a+virtual-navigation+decision+task%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Choice-specific sequences in parietal cortex during a virtual-navigation decision task.</a> Nature. 484 (7392), 62-68 (2012).</li>
<li>Pettit, N. L., Yap, E. L., Greenberg, M. E., Harvey, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fos+ensembles+encode+and+shape+stable+spatial+maps+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fos ensembles encode and shape stable spatial maps in the hippocampus.</a> Nature. 609 (7926), 327-334 (2022).</li>
<li>Pinke, D., Issa, J. B., Dara, G. A., Dobos, G., Dombeck, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full+field-of-view+virtual+reality+goggles+for+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Full field-of-view virtual reality goggles for mice.</a> Neuron. 111 (24), 3941-3952.e6 (2023).</li>
</ol>

作者不存在任何利益冲突或竞争性经济利益。

本研究采用综合方法探究小鼠在虚拟现实（VR）环境中的行为反应，重点介绍手术操作、液体限制方案、系统设置以及行为任务的实施。这些发现通过提供详细的实验步骤、训练时间框架和成功率，为该领域做出贡献。这将有助于更有效地在小鼠中应用VR实验流程，并为有意在研究中采用该技术的实验室提供规划与实施支持。
头部固定条的手术植入对于在虚拟现实环境中开展头部固定行为学实验至关重要。通过严格遵循既定操作规程并提供适当的术后护理，可确保头部固定条成功整合，同时将对动物健康和行为的不利影响降至最低。此外，实施液体限制方案以调控小鼠的饮水量，维持其水分水平和渴觉状态。逐步适应过程以及定期提供饮水对于保障动物福利并顺利开展行为学任务至关重要。
VR行为系统的搭建涉及硬件与软件组件的整合，以构建供小鼠使用的沉浸式虚拟环境。通过采用完全沉浸式虚拟显示、液体奖励系统、泡沫聚苯乙烯球作为球形跑步机，以及头部固定装置，实现了对实验条件和数据采集的精确控制。行为学任务包括线性轨道和Y迷宫范式，经过精心设计，用于研究小鼠行为的关键方面，如运动、决策和奖赏处理。
尽管已尽最大努力优化实验流程，研究过程中仍遇到了若干挑战。个体小鼠反应的差异性以及与硬件和软件集成相关的技术问题，给数据采集与分析带来了困难。此外，实验依赖于液体限制方案，因此必须仔细监测动物的水合状态，并相应调整实验程序。有时，小鼠在被放置于球体上时会出现挣扎、不从奖励出口饮水、或僵直不动且无法在球上奔跑的情况。尽管其中一些问题可能是暂时的，但仍必须密切监测小鼠，以确保其未遭遇影响进展的障碍。对于相较于同龄小鼠未能表现出进步的小鼠，应将其从研究中剔除。一项类似实验中，55只小鼠中有4只因无法学会实验范式而被移除25。对于连续5天在球上表现出持续不动的小鼠，在对其体重、饮水时接触奖励出口的能力以及在球上的体位进行了全面评估以确认无潜在健康问题后，将其排除出研究。在此类情况下，研究人员需自行判断采取何种策略以高效恢复实验进程。
这些训练方案旨在逐步增加小鼠的认知挑战，同时确保其能够熟练执行行为学任务。从小鼠在直线轨道训练过渡到Y迷宫范式的标准，取决于其是否达到预定的绩效阈值，例如连续多天成功完成试验并获取奖励。通过实施严格的训练方案，我们能够评估小鼠的行为能力及其对日益复杂任务的适应性。这些经过精心设计的训练流程为行为神经科学研究领域的研究人员提供了坚实的框架，系统性地指导实验动物的训练与评估。通过明确设定进阶标准，研究人员可高效地衡量实验对象的学习曲线，并据此优化训练范式。此外，该方法学策略有助于提升实验间的可重复性与标准化水平，促进跨研究的比较分析，推动对动物模型中认知过程与学习机制的深入理解。
在为小鼠设计虚拟现实（VR）实验范式时，必须认识到在任务复杂性和训练进程方面存在多种可选方法。本方案提供了一个构建实验设计的广泛框架，但具体细节（如奖励传递、偏差控制、刺激类型、任务进程和系统参数）仍需研究者根据研究需求进行定制。例如，某些研究采用更为简化的策略，专注于让动物立即参与任务。Krumin 等人的研究即为一例，他们实施了一种单一且一致的T型迷宫任务，而非在不同任务之间采用渐进式学习方案。相比之下，其他研究则提供了更多样化的试验设计要素，例如刺激强化策略和听觉提示。该研究将听觉反馈作为错误试验的惩罚，并仅以水作为正确试验的奖励26。相反，Zhao 等人则使用10%蔗糖溶液作为正确试验的奖励，且未对错误试验施加任何形式的惩罚27。他们转而通过反偏差训练等方法来减少错误反应，例如增加线索方向相对于动物先前选择发生切换的概率，并调整每日供水量以增强动物动机。实验设计上的差异（例如任务全程是否存在空间线索）可能导致对神经编码的不同解释。Zhao 等人发现后顶叶皮层细胞的选择性可由运动轨迹和空间偏好解释，而 Harvey 等人观察到的是与选择相关的激活序列，两者形成对比27,28。需要指出的是，所使用的特定硬件包括六块LCD显示器、可伸缩舔管和气垫式泡沫塑料球跑步机。不同实验室之间的虚拟现实系统存在多种差异，包括使用投影仪29还是计算机显示器、非球形跑步机30，以及固定式10还是可伸缩舔管。
综上所述，本研究为小鼠在虚拟现实环境中的行为反应提供了有价值的见解，并证明了利用沉浸式技术研究复杂行为的可行性。未来的研究工作可聚焦于优化实验方案、探索决策过程背后的神经机制，以及将研究成果转化为临床应用。通过持续深入理解小鼠行为，科学家可进一步阐明健康与疾病状态下复杂行为背后的神经环路和认知过程。

由于头部固定技术的出现，虚拟现实任务已成为小鼠行为评估的一种强大方法，这种固定方式提供了机械稳定性，而在自由活动的小鼠中这种稳定性将受到破坏1。该方法可减少电生理记录2,3和光学成像4,5,6,7中的运动伪影，同时有助于实现可重复的行为实验8和精确的眼动追踪9。在实验装置中，小鼠被固定于一个由气流支撑的球形跑步机上方。该设备支持在虚拟现实环境中对视觉引导行为进行精细探究。当小鼠在跑步机上移动时，其运动与虚拟环境中的导航实现无缝同步，虚拟场景则通过环绕小鼠的屏幕进行视觉呈现。
本研究具有双重目的：解决实验行为神经科学领域内的关键挑战，并推动该领域方法学的进步。首先，尽管虚拟现实（VR）在学术研究中的应用日益广泛10,11,12，但目前仍缺乏系统性的方法和培训方案，这阻碍了新技术研究者的采用。本研究的主要目标是通过详细描述线性轨道范式中的训练方案来填补这一空白，该范式已在先前的研究中有所展示13,14,15。本文采用一套 commercially available system 来描述这些操作流程。需要声明的是，这些操作指南包含针对该系统的特定组成部分；然而，关于本方案的普适性讨论，请参见“讨论”部分。本研究旨在阐明行为操作流程、执行这些操作的典型时间线，以及训练小鼠在简单线性轨道上奔跑的成功率。
其次，目前仍缺乏关于在此范式中实施小鼠复杂迷宫任务的详细记录。尽管已有研究开发了大鼠的复杂虚拟检测方法11，但小鼠的视觉敏锐度相对较低16，在复杂任务中的表现通常较差17。虽然部分研究已聚焦于特定任务，如证据累积或空间新颖性识别18，但本研究的重点在于阐明小鼠在虚拟现实环境中参与决策范式所需的训练方法。为应对这一挑战，设计了一项信号辨别任务，要求小鼠仅需学习将奖励臂的颜色/亮度（黑色与白色）与奖励关联起来，具体操作为在Y形迷宫的选择点选择黑色臂，且每次试验中正确臂的位置随机化。该任务旨在促使小鼠与虚拟线索进行交互，并揭示其感知辨别能力。
总之，本研究通过提供在小鼠中使用虚拟现实范式的全面训练方案，并阐明在此框架内进行复杂决策任务的方法学，填补了实验行为神经科学领域的关键空白。通过借鉴以往研究的成果和创新的实验设计，本研究旨在简化研究流程，并推动对行为背后神经机制的理解。下文将深入探讨实验步骤与结果，并对研究发现进行讨论。

<table><tbody><tr><td>2.4 mm 螺钉 (00-96 X 3/32)</td><td>Protech International</td><td>8L0X3905202F</td><td>用于增强头杆稳定性</td></tr><tr><td>布比卡因</td><td>Hospira</td><td>NDC:0409-1162-19</td><td>局部麻醉剂</td></tr><tr><td>丁丙诺啡</td><td>Wedgewood Pharmaceuticals</td><td>SKU: BUPREN-INJ010VC</td><td>镇痛</td></tr><tr><td>剃毛推剪</td><td>Wahl&amp;nbsp;</td><td>1565q</td><td>用于剃除手术区域毛发</td></tr><tr><td>钻孔与微注射机器人</td><td>Neurostar</td><td>17129-IDA</td><td>立体定向系统&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>GLUture</td><td>Zoetis</td><td>32046</td><td>外科粘合剂</td></tr><tr><td>头杆植入物</td><td>Luigs-Neumann</td><td>130060</td><td>小鼠头颅植入物</td></tr><tr><td>加热垫 (Lectro-Kennel)</td><td>K&amp;amp;H Manufacturing</td><td>100212933</td><td>术后保温</td></tr><tr><td>止血钳</td><td>World Precision Instruments</td><td>501291</td><td>外科工具</td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>Swam</td><td>L0003648FB</td><td>清洁剂</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Dechra</td><td>B230008</td><td>外科吸入性麻醉剂</td></tr><tr><td>异氟烷/氧气输送装置（带鼻罩）</td><td>Eagle Eye Anesthesia Inc.</td><td>Model 50 Anesthesia</td><td>外科设备</td></tr><tr><td>Metabond</td><td>Parkell</td><td>CB-S380</td><td>粘接水泥</td></tr><tr><td>显微剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td>外科工具</td></tr><tr><td>氧气</td><td>Praxair</td><td>UN1072</td><td>外科用氧</td></tr><tr><td>聚维酮碘棉签棒</td><td>Dynarex</td><td>g172095-05</td><td>外科工具</td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>Hospira</td><td>NDC:0409-1966-02</td><td>水合剂</td></tr><tr><td>无菌棉签（Q-tips）</td><td>Puritan</td><td>25-806 2WC</td><td>外科工具</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Fisher Chemical</td><td>CAS 57-50-1</td><td>主要强化物/动机/奖励物</td></tr><tr><td>镊子</td><td>World Precision Instruments</td><td>504505</td><td>外科工具</td></tr><tr><td>虚拟现实系统</td><td>PhenoSys</td><td>JetBall-TFT</td><td>JetBall 是一种气垫式球形跑步机，可使动物在投影于周围六个显示器上的虚拟世界中自由移动。</td></tr><tr><td>白色石油脂润滑眼膏&amp;nbsp;</td><td>AACE Pharmaceuticals</td><td>NDC:71406-124-35</td><td>眼用润滑膏</td></tr></tbody></table>

小鼠固定头部虚拟现实的行为训练流程

Behavioral Training Procedures for Head-fixed Virtual Reality in Mice

虚拟现实（VR）结合头部固定技术正越来越多地应用于行为神经科学研究中，因为它能够在头部固定的条件下对小鼠进行复杂的行为检测。这种方法可以在精确记录行为的同时，整合多种需要头部固定以减少神经记录过程中运动相关信号噪声的神经生理学技术。然而，尽管VR的使用日益广泛，关于如何实施该技术的详细方法学报道却十分有限。本研究建立了一种训练方案，通过该方案训练雄性和雌性C57BL/6J小鼠在虚拟线性通道中奔跑，通道长度在多次训练过程中从1-3米逐步增加。在此基础上，本研究进一步探索了小鼠在VR环境中执行复杂行为的可行性，采用Y型迷宫范式进行实验。任务要求小鼠从Y型迷宫的选择点出发，导航至具有黑色墙壁的臂。当小鼠连续两天正确率达到或超过70%时，即进入难度逐渐增加的感觉辨别任务阶段。研究结果提供了有关成功训练小鼠进行VR实验的方法学细节，并证明小鼠具备在Y型迷宫中学习导航的能力。所提出的方法不仅为基于VR的行为检测中的训练时长提供了参考依据，也凸显了在小鼠中探究复杂行为的潜力，为更深入的神经科学研究开辟了新的途径。

本初步研究旨在概述小鼠在两种不同任务中进行高效训练的方法：简单通道任务和复杂决策任务（Y迷宫视觉辨别任务）。这些数据为建立虚拟现实环境中行为训练的时间指导方案提供了基础。
操作步骤首先在图1中概述了头夹的手术植入过程。该植入物用于在行为学评估期间稳定小鼠颅骨，从而提高神经记录的精确性，尤其是在与电生理学或成像技术联合使用时。
图2 和 图3 展示了实验系统的硬件组件及装置布局。图2 详细描述了采用培养皿喷泉法的供水系统。该方法包括将一个60 mm × 15 mm的培养皿凹面朝下固定在笼底，在较大培养皿中心位置将一个较小的35 mm × 10 mm培养皿凹面朝下固定，并在小培养皿上方放置另一个60 mm × 15 mm培养皿，凹面朝上，作为储水装置。上层培养皿的高度经过精确调整，以防止垫料污染，同时确保小鼠能够方便地获取饮水。
图3展示了系统硬件及小鼠定位指南。图3A为虚拟现实（VR）装置示意图，包含一个六屏阵列，中央放置球形跑步机。图3B显示小鼠在跑步机上的最佳位置，头部保持自然姿态，四肢均与跑步机表面接触。图3C比较了相对于头夹的正确与错误的小鼠放置方式，强调应使小鼠的正中矢状面居中，而非与头夹本身对齐。
图4 以折线图形式展示了奖励获取曲线，说明了在虚拟现实环境中，小鼠在1米、2米和3米狭窄走廊任务中基于预设进展参数所预期的学习周期。该图显示了小鼠在不同轨道长度下的平均速度，随着任务难度增加，速度逐步提升，反映出任务学习效果的逐步改善。此外，还展示了柱状图，分别表示小鼠达到线性轨道任务标准所需的平均天数，以及各轨道长度对应的平均速度。随后，展示了小鼠学习线性轨道任务的各个渐进阶段。这些任务的设计旨在复现学术文献中已建立的方法，同时确保学习曲线对小鼠而言切实可行，从而促进其顺利通过各个阶段。
最后，图5提供了与Y型迷宫任务相关的数据。该图展示了任务的渐进性质，最初阶段为对纯黑色和纯白色臂之间的简单辨别。这一初始阶段作为基础步骤，用于确立小鼠区分对比性视觉线索的能力。任务的后续阶段通过在每个臂中引入更多比例的对比颜色，逐步增加任务复杂性，从而进一步挑战小鼠的辨别能力。任务难度的逐步提升体现在从纯黑和纯白臂过渡到由90%一种颜色和10%另一种颜色组成的臂。值得注意的是，图5中所示数据表明，尽管辨别准确率随着任务层级的推进而提高，但部分小鼠始终表现出视觉辨别能力的阈值，最高仅能达到80%/20%的白色/黑色辨别水平。这一观察结果凸显了在Y型迷宫任务背景下小鼠视觉辨别能力的内在局限性，为评估该任务的可行性以及受试动物的认知能力提供了有价值的见解。随后，详细描述了Y型迷宫轨道任务的渐进阶段，这些阶段的设计与文献中既定的方法学保持一致。这些阶段确保了小鼠具有可行的学习曲线，支持其逐步完成各层级任务。
<img alt="使用牙科水泥进行装置放置和固定的鼻腔手术示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67312/67312fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：头杆植入手术操作说明。（A）在小鼠颅骨上标记切口位置。（B）螺钉应植入冠状缝左侧距中线1 mm、前囟稍下方的位置，以及冠状缝右侧距中线3 mm、人字缝稍上方的位置。（C）头杆应沿冠状缝放置。（D）在头杆植入物上涂抹牙科水泥。（E）涂抹牙科水泥后头杆的实际外观。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67312/67312fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用堆叠容器和胶带演示静态平衡的培养皿装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67312/67312fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：使用培养皿喷泉法的供水系统。将一个 60 mm × 15 mm 的培养皿凹面朝下固定在笼底。在一个较大的培养皿中央放置一个较小的 35 mm × 10 mm 培养皿，并在上方再倒置放置另一个 60 mm × 15 mm 的培养皿作为储水槽。该装置可确保水不被垫料污染，同时便于小鼠接触饮水。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67312/67312fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="小鼠行为研究装置；球形跑步机、奖励管；实验示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67312/67312fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：系统硬件及小鼠定位示意图。（A）显示所使用的虚拟现实（VR）装置。采用六屏幕设置，球形跑步机置于中央。（B）小鼠在球形跑步机上理想位置的侧视图。小鼠头部处于自然位置，四肢均位于球形跑步机上。（C）从小鼠头杆角度观察，正确与错误放置方式的俯视图。正确放置时，应以小鼠的正中矢状面为中心，而非头杆本身。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67312/67312fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="行为实验结果；奖励阈值、各试验日的速度分析、图表比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67312/67312fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：线性轨道实验数据。（A）所示数据为每只小鼠在每次30分钟试验期间每日获得的奖励数量。当小鼠连续两天平均达到每分钟2次奖励（总计60次奖励，即达到阈值）时，即进入更长轨道长度的阶段。（B）随着小鼠对该任务熟练度的提高，其运动速度逐渐增加，表明奖励强化具有显著效果。该图显示了每只小鼠在轨道上每日平均速度（单位：cm/s），反映出学习行为的线性进展。（C）该柱状图展示了每只小鼠在不同轨道长度下达到熟练所需的时间，并标出了各轨道长度对应的均值及标准误差。（D）该柱状图展示了每只小鼠在不同轨道长度下每日平均速度的均值及标准误差。近乎线性的增长趋势表明小鼠的奔跑速度通过学习得到了提升。（E）此图说明了线性轨道任务的递进规则：必须连续两天获得60次奖励，方可进入更长版本的迷宫任务。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67312/67312fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Y迷宫实验示意图，包含不同试验天数和迷宫类型的奖励百分比图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67312/67312fig05v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：Y迷宫实验数据。（A）显示了在Y迷宫训练不同阶段获得奖励的分布情况。该分析仅针对完成了线性轨道所有阶段的四只小鼠的子集，从而确保雄性和雌性参与者均得到公平代表。（B）此图示展示了Y迷宫任务的各个阶段，小鼠在连续两天达到70%的正确选择后进入下一阶段。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67312/67312fig05largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文描述了在小鼠中常用线性轨道虚拟现实（VR）范式的实验操作流程，并通过测试Y形信号辨别任务，验证了执行复杂VR任务的可行性。

虚拟现实（VR）结合头部固定技术正越来越多地应用于行为神经科学研究中，因为它能够实现复杂的动物行为检测……

本研究探讨了在虚拟现实环境中训练小鼠的详细方法，重点聚焦于线性轨道导航和复杂的Y迷宫任务。旨在解决现有虚拟现实训练方案中的空白，并评估小鼠在虚拟现实中执行复杂决策行为的能力。该方案弥补了小鼠虚拟现实训练方法在细节上的不足，包括手术操作、液体限制以及系统设置的整合。同时，它还提供了一个实施复杂行为任务的框架，有助于提高实验的一致性，并推动虚拟现实在小鼠精细行为与认知研究中的广泛应用。该虚拟现实（VR）方案可精确控制实验条件，并最大限度减少与运动相关的噪声，从而实现对头部固定小鼠的详细行为分析和神经生理记录。此外，该方案支持任务复杂度的逐步提升，有助于研究其他方法可能无法有效捕捉的复杂行为和认知过程。[旁白] 首先，在小鼠头部植入头杆手术后一周，建立其基础体重。在第1、2、3天，分别给予小鼠每100克体重15、10和5毫升的水。开始让小鼠适应球形跑步机，同时引入液体调控，通过正确时机的生理动机，使其将舔管与奖励联系起来。在第一天，称重后用手操作小鼠5分钟。当小鼠在笼内时，轻轻抓握其头杆植入物，使其熟悉这一操作。将小鼠带入安置虚拟现实系统的区域，使其提前熟悉实验试次将进行的空间环境。在第二天，再次用手操作小鼠5分钟。将头杆固定于支架上，让小鼠在球形跑步机上适应5至20分钟，可选择在无限循环的轨道上运行，或在未启动软件程序的情况下进行。在第三天，操作小鼠5分钟后，将其牢固地固定在气垫式球形跑步机上，并通过奖励管引入液体奖励。在放置小鼠前，将居中的奖励管伸出，并在其尖端附上一小滴奖励液。将奖励管抬高至球形跑步机上方5至15毫米，使小鼠舔舐吸嘴时头部保持自然前倾姿势。固定小鼠头部时，将小鼠置于操作者惯用手一侧的球形跑步机上。用操作者的惯用手通过头杆将小鼠拉向头部固定平台，然后将头杆插入固定槽中，并用非惯用手将其卡紧。随后，使小鼠的正中矢状面与球形跑步机的中心对齐。确保小鼠后肢距球形跑步机顶点不超过11厘米，且头部位于顶点之后。确认小鼠四肢均接触跑步机表面，且在静止状态下腹部可触及跑步机。同时，确保观察到的任何侧向偏好并非由小鼠在球体上安装的不对称性所致。为引导小鼠接近伸出的舔管，可采用“轻触法”（kiss-it method），即轻柔地移动小鼠，使其口部几乎接触吸嘴尖端。当小鼠获得奖励时，将奖励管伸出的持续时间设为1秒。一旦小鼠适应了实验范式，即可进行每日30分钟的训练，期间小鼠在一条线性虚拟走廊中移动，初始长度为1米。当小鼠到达走廊末端并获得糖滴奖励后，将其传送回起点。每日记录带有时间戳的数据，包括奖励获取情况及小鼠在球形跑步机上行进的距离，以供后续分析。在Y迷宫范式中，确保小鼠向选择点移动，该点两侧各延伸出一条呈45度角的臂，形成Y形结构。从迷宫起点至选择点期间，关闭旋转功能，此时两条臂具有不同的视觉特征。进入决策区域后，重新激活旋转功能，使小鼠能够转向其选择的方向。当小鼠进入通向奖励区的臂后，再次关闭旋转功能。训练小鼠朝向黑色臂移动以获得糖奖励，每次试次结束后将小鼠传送回起始位置。随机切换左右两侧的奖励位置，以确保小鼠将奖励与视觉线索而非特定侧向位置相关联。在虚拟现实任务中，随着不同轨道长度的学习进程，小鼠获得的奖励数量逐步增加，且随着轨道长度增加，观察到运动速度加快。随着轨道长度增加，平均速度也表现出明显上升。Y迷宫任务中，小鼠的表现随天数推移优于随机水平。然而，仅有一部分小鼠成功进入更难的辨别阶段。

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