低成本聚对苯二甲酸乙二醇酯层压微流控设计用于多重斑马鱼成像

本实验室致力于研究中性粒细胞在组织损伤、感染和癌症中迁移与活化的调控机制，重点关注伤口愈合过程中细胞内钙信号的特征及其生物学意义。

[Shelly] 传统的微流控设计方法成本高昂且复杂，因而限制了发育生物学等领域的发展，这些领域需要多种多样的实验环境。我们发现了一种更快速、更高效的方法，可用于开发和测试个体设计。该构建方法相比其他同样简单的方案，提供了更高的设计灵活性和空间分辨率，同时比标准的PDMS器件实现了更快、更便捷的迭代。利用该方法，我们开发了RADISH装置，可在单个视野内同时对多个斑马鱼胚胎进行成像。

利用这种支持高分辨率活体成像的包埋装置，我们将能够深入理解包括化学信号和机械刺激在内的多种信号如何整合，以协调炎症反应和伤口愈合过程。

[讲师] 首先，使用选定的软件设计装置的图案。根据胚胎的发育阶段和大小，调整通道的宽度以及中央成像室的尺寸，以获得最佳适配效果。将每一层保存为具有相同尺寸的独立图像文件。现在，按照制造商的说明初始化切割机。在设计工作区中，选择新上传的设计图案。将适用于相同厚度PET薄膜的图案归为一组，进行同一次切割。确认切割图案的数量和类型，然后选择切割材料。接下来，将相应厚度的PET薄膜牢固地贴附在切割垫板上，用力按压以去除气泡，然后将垫板装入切割机。按照屏幕提示，启动切割机开始切割。随后，从切割垫板上取下已完成的切割件。现在，将各层在盖玻片上对齐，可借助预切的定位标记或徒手完成。使用办公胶带固定各层，以防止在覆膜过程中发生移位。根据装置尺寸和覆膜机的容量，可将较小的设计用更多胶带固定在较大的背衬上，以避免堵塞或卡住覆膜机进料口。之后，打开覆膜机，并按照制造商的说明进行覆膜。在对齐下一层之前，移除办公胶带。使用氰基丙烯酸酯胶水，将装置固定在一个直径35毫米、并钻有3/4英寸圆孔的培养皿上。然后，用氰基丙烯酸酯胶水充分涂覆装置外缘，对覆膜结构进行防水密封。胶水用量应足以完全覆盖外边缘，不得留有缝隙。首先，将斑马鱼胚胎在E3或其他适宜的胚胎培养液中培养至受精后至少两天。然后，使用164毫克/升的MS-222对胚胎进行麻醉。接下来，向装有装置的培养皿中加入5毫升含有164毫克/升MS-222的E3或其他胚胎培养液。使用移液器将一个麻醉后的胚胎放入装置的每个固定腔中。然后，使用毛发环将胚胎调整至尾部伸入中央成像室、卵黄囊固定在楔形通道中的位置。如需要，可通过微量移液器向固定腔中加入1.5%低熔点琼脂糖，以固定胚胎头部。最后，将带有胚胎的装置转移至选定的成像系统，开始成像。根据实验需求选择合适的成像系统和物镜。调节样品焦距及成像参数，以获得最佳的信噪比和采集速度。若需通过手动横切造成胚胎损伤，可在体视显微镜下，用手术刀片在脊索末端处的尾鳍组织上施加压力进行切割。然后，将装置放回载物台。若需通过激光刺激造成损伤，可在尾鳍褶边缘附近定义感兴趣区域，并根据可用激光功率进行刺激。在室温下使用GFP和RFP通道对胚胎进行成像，帧间隔为1分钟，总时长为1小时。如有必要，成像结束后可通过移液器在胚胎头部附近轻柔抽吸，或轻轻旋转培养皿以释放胚胎。