使用两种贴壁细胞系的共培养模型

正如我们机构名称“母胎医学研究所”所表明的，我们的研究主要聚焦于女性生殖生物学。我们的目标是阐明生殖障碍的机制，并确定潜在的治疗靶点。这种方法的一个关键优势在于，与商业化的共培养系统相比，可显著减少时间和经费支出。

该自制支架由 readily available 的材料构建而成，显著降低了实验装置的成本。这种多细胞体外模型能更好地模拟植入区域复杂的体内解剖结构。未来，我们实验室将在这一混合接种的多细胞体外模型中引入其他细胞类型，并进一步研究胚胎植入过程以及子宫功能在子宫内膜损伤和宫腔粘连等疾病发病机制中的作用。

首先，获取用于模型构建的3D打印支架。进行细胞培养时，将一块洁净且无菌的18毫米方形盖玻片置于12孔板底部。用200微升浓度为200至300微克/毫升的细胞外基质溶液包被盖玻片。

将培养板置于 37 摄氏度环境中一小时。随后从培养板中移除细胞外基质。接着，在显微镜下检查先前培养的人胚胎干细胞和 Ishikawa 细胞，以确认其汇合度适当。

然后从孔中移除用过的培养基，并用三毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次。现在加入两毫升消化酶，在37摄氏度下孵育两分钟以使细胞脱落。使用完全培养基中和反应。

然后通过反复吹打制备单细胞悬液。取100 µL细胞悬液与台盼蓝混合，保持两倍稀释系数。然后将盖玻片覆盖在血细胞计数板的计数室上。

将细胞悬液与台盼蓝混合后，加入两侧腔室。在20倍显微镜下计数两侧方格内的细胞数量，并根据计数结果计算细胞密度。随后，将人胚胎干细胞以每毫升10的5次方个细胞的浓度接种至含有新鲜培养基的预处理培养板中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养24小时。

对于 Ishikawa 细胞系，次日将细胞接种至无盖玻片的孔中。将支架用乙醇和双蒸水充分浸泡两天。浸泡后，移除双蒸水并密封金属罐。

然后使用高压灭菌器在121摄氏度下对支架进行灭菌。之后让其自然干燥。向含有Ishikawa细胞的孔中加入约2毫升的完全培养基。

将附着有人胚胎干细胞的盖玻片转移至支架上，使细胞面朝下。将支架插入含有Ishikawa细胞的孔中。对于第二种设置，将带有Ishikawa细胞的盖玻片放置在支架上，并将其插入含有胚胎干细胞的孔中。

将共培养体系置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。小心移除孔中的培养基，并用无菌PBS轻柔冲洗细胞。使用精细镊子或镊子，从培养皿中取出附着有细胞的盖玻片。

可选步骤：将盖玻片放入盛有 PBS 的新培养皿中，以在转移过程中保持其湿润。在干净的显微镜载玻片上滴加一滴 PBS，然后轻柔地将带有细胞的盖玻片转移至液滴上，确保细胞面朝下贴附于载玻片。将制备好的载玻片置于倒置显微镜的载物台上。

选择合适的物镜，并使用粗调和微调焦旋钮调节焦距。设置显微镜参数，包括照明强度和相机设置。使用显微镜软件在所需放大倍数和视野下采集图像。

两种细胞在共培养条件下培养72小时后密度均保持较低水平，而单独培养的细胞密度则显著增加。共培养的人胚胎干细胞长度短于单独培养的细胞。