Name: 使用两种贴壁细胞系的共培养模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: 了解使用人胚胎干细胞与Ishikawa细胞系构建的共培养模型，该模型采用3D打印支架技术，为研究女性生殖生物学及着床相关疾病提供经济高效的体外实验平台。

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我们感谢所有参与本研究的受试者。同时感谢深圳光创新技术有限公司提供的影像技术支持。本研究得到了国家自然科学基金（资助号：82201851）、深圳市科技计划项目（资助号：JCYJ20210324141403009、RCYX20210609104608036）、深圳市重点医学学科建设基金（资助号：SZXK028）以及深圳市宝安区妇女儿童医院（资助号：BAFY 2023003）的资助。

注意：本方案中使用的所有试剂均可在材料表中找到。除非另有说明，所有培养基在使用前均需预先平衡至 37 °C。
1. 支架的3D&#160;打印与模型构建
注意：此处的步骤是根据商用 3D 金属打印设备的说明书进行操作的。以下简要描述了这些步骤（补充文件 1）。
<ol>
	<li>打印平台调平
	<ol>
		<li>点击控制面板上的 菜单 图标，进入“工具”选项，选择 平台调平 以启动调平程序。</li>
		<li>从打印平台上取下打印片，并选择 完成。打印平台将升至最高位置，为调平做准备。当进度条达到 100% 后，按下 开始。</li>
		<li>如果 Metal X 打印机此前未进行过调平，请选择 重置；若已调平过，则选择 跳过，并直接进入第 1.1.5 步（16 点扫描）。</li>
		<li>使用 2.5 mm 六角扳手将三个平台调平螺钉顺时针旋转直至拧紧，然后逆时针旋转两整圈，使螺钉处于中间高度位置。按下 完成 继续操作。</li>
		<li>打印机将在 16 个指定位置对平台进行扫描。在此过程中请勿触碰平台或机架。当进度达到 100% 后，按下 下一步。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>打印片安装
	<ol>
		<li>清除平台上残留的金属或支撑物碎屑。将真空开关切换至 开启 状态。</li>
		<li>等待平台下降并加热后，点击 下一步。将打印片覆盖在真空网格上，然后点击 下一步。</li>
		<li>将压片装置放置在打印片上方，并与腔室后部的 Z 轴导轨对齐。</li>
		<li>等待真空启动并形成稳定密封。真空启动后，点击 完成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>金属丝材装载
	<ol>
		<li>手动将打印头移至打印区域中央。向上滑动并取下打印头盖，使其脱离安装螺钉。</li>
		<li>点击操作面板上的 菜单 图标，从选项中选择 材料。</li>
		<li>选择 装载金属 以启动装载程序，然后选择 快速装载。</li>
		<li>选择要装载的具体金属材料类型（例如，Aluminum 6061-T6 | 3.3211 | 65028 | AlMg1SiCu）。</li>
		<li>将线轴安装到支架上，点击 下一步。关闭舱门，等待线轴预热后，点击 下一步。</li>
		<li>将材料插入打印头前端的进料口（标记为 M），直至挤出机开始将其拉入。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>金属零件打印
	<ol>
		<li>在“打印设置”面板中，点击 导出构建。将文件保存至格式化为 FAT32 的 U 盘，并插入打印机。</li>
		<li>点击面板上的 菜单 图标，进入“存储”选项，选择 从存储设备打印，然后选择零件文件以开始打印。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>金属零件取下
	<ol>
		<li>小心地将打印片及打印完成的零件从打印平台上滑下。轻轻将零件从打印片上分离。柔性打印片应可轻松剥离。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 三维模型中细胞共培养的准备工作
注意：建议使用耐高温材料作为3D打印细胞盖玻片支架支撑物的耗材，以便在每次细胞培养实验前进行高压灭菌消毒。本研究使用了永生化的人子宫内膜基质细胞（HESC）和人子宫内膜上皮细胞（Ishikawa）。这些细胞系的表征此前已有报道5,6。
<ol>
	<li>细胞培养与传代
	<ol>
		<li>通过添加DMEM/F12培养基 + 2 mM L-谷氨酰胺 + 10% 去炭处理胎牛血清（FBS）+ 1% 青霉素/链霉素溶液，配制50 mL hESC完全培养基。</li>
		<li>通过添加DMEM高糖培养基 + 10% FBS + 1% 青霉素/链霉素溶液，配制50 mL Ishikawa完全培养基。</li>
		<li>细胞复苏 
		注：购买的细胞系以干冰运输并处于冷冻状态，应保存于液氮气相或低于-130 °C的环境中。
		<ol>
			<li>准备好所有必要的无菌设备和消化酶，并将完全培养基预热至37 °C。</li>
			<li>在37 °C水浴中快速融化细胞，期间轻轻摇动。将细胞悬液转移至含有5 mL基础培养基的离心管中，在200 × g 条件下离心5分钟。</li>
			<li>小心吸除上清液。将细胞沉淀重悬于5 mL已配制的完全培养基中，并接种至两个T25培养瓶中。将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>带盖玻片的细胞制备
	<ol>
		<li>使用18 mm方形盖玻片作为细胞培养表面；确保盖玻片清洁且无菌。</li>
		<li>在12孔板的每个孔底部加入200 µL浓度为200–300 µg/mL的细胞外基质（ECM），置于37 °C孵育1小时。</li>
		<li>移除ECM。检查细胞融合度是否合适，并确保两种细胞系的密度均约为70%–80%。</li>
		<li>吸弃旧培养基，用3 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次。</li>
		<li>加入2 mL消化酶，在37 °C孵育2分钟以使细胞脱落。</li>
		<li>用完全培养基中和，并通过吹打形成单细胞悬液。</li>
		<li>取100 µL细胞悬液与台盼蓝混合（稀释倍数=2）。</li>
		<li>将盖玻片覆盖在血细胞计数板的计数室上，将含台盼蓝的细胞悬液分别加入两侧计数室。</li>
		<li>在20倍显微镜下计数两侧方格内的细胞数量，并计算细胞密度。</li>
		<li>将细胞接种至已准备好的培养板中，加入新鲜培养基，在37 °C、5% CO2条件下培养。hESC接种密度为1 × 105 个细胞/mL，培养24小时。</li>
		<li>对于Ishikawa细胞系，次日将细胞接种至不含盖玻片的孔中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 共培养模型的组装
<ol>
	<li>将支架用乙醇和双蒸水（ddw）充分浸泡2天。在121 °C条件下使用高压灭菌器对支架进行灭菌，并将其干燥。</li>
	<li>向培养Ishikawa细胞系的孔中加入约2 mL完全培养基，确保液面覆盖盖玻片。</li>
	<li>将带有hESC的盖玻片转移至支架上，并使细胞面朝下。将支架插入培养Ishikawa细胞的孔中。对于第二组实验，将带有Ishikawa细胞的盖玻片转移至支架上，并将支架插入培养hESC的孔中，即颠倒上述设置。未使用支架的细胞用于独立的细胞生长分析。</li>
	<li>将共培养系统置于37 °C、5% CO2条件下孵育。共培养时间可根据实验设计而变化，通常为24–72小时。</li>
</ol>
4. 图像采集
<ol>
	<li>小心吸除培养基，并用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻冲洗细胞。</li>
	<li>使用精细镊子从培养皿中取出带细胞的盖玻片。可选择将盖玻片放入盛有 PBS 的新培养皿中，以防止转移过程中干燥。</li>
	<li>取一张洁净的显微镜载玻片，滴加一滴 PBS。将带有细胞的盖玻片轻轻转移至封片剂液滴上，确保细胞面朝下贴附于载玻片。</li>
	<li>将制备好的载玻片置于倒置显微镜载物台上。选择合适的物镜（如 10x、20x），并使用粗调和微调焦旋钮调节焦距。</li>
	<li>设置显微镜参数，如照明强度和相机设置。通过显微镜软件，在所需放大倍数和视野下采集细胞图像。调整曝光时间及其他成像参数以优化图像质量。</li>
</ol>
5. 图像处理
<ol>
	<li>点击 打开 以打开图像，点击 处理 &#62; 滤镜 &#62; 增强顺序 &#62; 选择局部均衡化，然后点击 应用。</li>
	<li>点击 编辑 &#62; 转换为 &#62; 8位灰度图。点击 增强，选择 应用对比度。</li>
	<li>点击 计数 并测量目标。点击 手动，选择一个范围，并调整直方图以确保覆盖所有细胞。</li>
	<li>点击 应用掩膜，关闭当前窗口，点击 自动亮目标 &#62; 测量，选择 测量参数，并勾选 面积、树突、密度和大小。</li>
	<li>点击 自动亮目标，然后点击 计数。点击 导出数据 将测量数据导出至电子表格。</li>
</ol>
6. 细胞收获
<ol>
	<li>从显微镜载玻片上取下盖玻片，并将其转移至一个洁净干燥的孔中。</li>
	<li>使用RNA提取试剂收集Ishikawa细胞，用于转录组学研究，或使用Ripa裂解试剂用于蛋白质组学研究。 
	注意：对于人胚胎干细胞（hESC），在免疫染色后，采用盖玻片培养法更有利于图像采集。 alternatively，也可使用RNA提取试剂或Ripa裂解试剂收集hESC。培养在盖玻片上或培养板表面的细胞系可相互替换；然而，我们建议用于成像分析的细胞应接种在盖玻片上。</li>
</ol>

3D-Printed Scaffold Model to Investigate Embryo Implantation Mechanisms

<ol><li>Iske, J., Elkhal, A., Tullius, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fetal-maternal+immune+interface+in+uterus+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+Immunol%22%5BJournal%5D)">The fetal-maternal immune interface in uterus transplantation.</a> Trend Immunol. 41 (3), 213-224 (2020).</li>
<li>Dey, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cues+to+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular cues to implantation.</a> Endocrine Rev. 25 (3), 341-373 (2004).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+models+of+human+endometrium+for+studying+trophoblast-endometrium+interaction+during+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture models of human endometrium for studying trophoblast-endometrium interaction during implantation.</a> Reprod Biol Endocrinol. 20 (1), 120(2022).</li>
<li>Goss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mod3d%3A+A+low-cost%2C+flexible+modular+system+of+live-cell+microscopy+chambers+and+holders%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mod3d: A low-cost, flexible modular system of live-cell microscopy chambers and holders.</a> PLoS One. 17 (6), e0269345(2021).</li>
<li>Zheng, J., Liu, L., Wang, S., Huang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sumo-1+promotes+Ishikawa+cell+proliferation+and+apoptosis+in+endometrial+cancer+by+increasing+sumoylation+of+histone+h4%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Gynecol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Sumo-1 promotes Ishikawa cell proliferation and apoptosis in endometrial cancer by increasing sumoylation of histone h4.</a> Int J Gynecol Cancer. 25 (8), 1364-1368 (2015).</li>
<li>Damdimopoulou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Pract+Res+Clin+Obst+Gynaecol%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells.</a> Best Pract Res Clin Obst Gynaecol. 31, 2-12 (2016).</li>
<li>Gargett, C. E., Schwab, K. E., Deane, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endometrial+stem%2Fprogenitor+cells%3A+The+first+10+years%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Update%22%5BJournal%5D)">Endometrial stem/progenitor cells: The first 10 years.</a> Hum Reprod Update. 22 (2), 137-163 (2015).</li>
<li>Lerman, M. J., Lembong, J., Gillen, G., Fisher, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3d+printing+in+cell+culture+systems+and+medical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Phys+Rev%22%5BJournal%5D)">3d printing in cell culture systems and medical applications.</a> Appl Phys Rev. 5 (4), 041109(2018).</li>
<li>Palmara, G., Frascella, F., Roppolo, I., Chiappone, A., Chiadò, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+3d+printing%3A+Approaches+and+bioapplications%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Functional 3d printing: Approaches and bioapplications.</a> Biosens Bioelectron. 175, 112849(2021).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiscale+architecture+design+of+3d+printed+biodegradable+zn-based+porous+scaffolds+for+immunomodulatory+osteogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Multiscale architecture design of 3d printed biodegradable zn-based porous scaffolds for immunomodulatory osteogenesis.</a> Nat Comm. 15 (1), 3131(2024).</li>
<li>Arnold, J. T., Lessey, B. A., Seppälä, M., Kaufman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+normal+endometrial+stroma+on+growth+and+differentiation+in+Ishikawa+endometrial+adenocarcinoma+cells1%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of normal endometrial stroma on growth and differentiation in Ishikawa endometrial adenocarcinoma cells1.</a> Cancer Res. 62 (1), 79-88 (2002).</li>
<li>Casper, R. F., Yanushpolsky, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+endometrial+preparation+for+frozen+embryo+transfer+cycles%3A+Window+of+implantation+and+progesterone+support%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">Optimal endometrial preparation for frozen embryo transfer cycles: Window of implantation and progesterone support.</a> Fertil Steril. 105 (4), 867-872 (2016).</li>
<li>Cooke, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+estrogen+receptors+mediate+mitogenic+effects+of+estradiol+on+uterine+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+Am%22%5BJournal%5D)">Stromal estrogen receptors mediate mitogenic effects of estradiol on uterine epithelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S Am. 94 (12), 6535-6540 (1997).</li>
<li>Owusu-Akyaw, A., Krishnamoorthy, K., Goldsmith, L. T., Morelli, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mesenchymal-epithelial+transition+in+endometrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Update%22%5BJournal%5D)">The role of mesenchymal-epithelial transition in endometrial function.</a> Hum Reprod Update. 25 (1), 114-133 (2019).</li>
<li>Evans, J., Hutchison, J., Salamonsen, L. A., Azlan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endometrial+inflammasome+activation+accompanies+menstruation+and+may+have+implications+for+systemic+inflammatory+events+of+the+menstrual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Endometrial inflammasome activation accompanies menstruation and may have implications for systemic inflammatory events of the menstrual cycle.</a> Hum Reprod. 35 (6), 1363-1376 (2020).</li>
<li>Gołąbek-Grenda, A., Olejnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+modeling+of+endometriosis+and+endometriotic+microenvironment+-+challenges+and+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signal%22%5BJournal%5D)">In vitro modeling of endometriosis and endometriotic microenvironment - challenges and recent advances.</a> Cellular Signal. 97, 110375(2022).</li>
<li>Berger, C., Boggavarapu, N. R., Menezes, J., Lalitkumar, P. G. L., Gemzell-Danielsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+ulipristal+acetate+on+human+embryo+attachment+and+endometrial+cell+gene+expression+in+an+in+vitro+co-culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effects of ulipristal acetate on human embryo attachment and endometrial cell gene expression in an in vitro co-culture system.</a> Hum Reprod. 30 (4), 800-811 (2015).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

本文描述了一种简化且经济高效的子宫内膜基质细胞与上皮细胞间接共培养方案。该方法采用一种自制的细胞爬片支架，其由一个可固定于标准12孔细胞培养板的上部支撑环和一个带有四个L形杆状结构的底部细胞爬片支架组成。该装置可在分离子宫内膜基质细胞与上皮细胞的同时，允许细胞通过培养基中信号分子的交换实现相互作用。与市售的共培养系统相比，该方法的主要优势之一是显著节省了时间和成本11。该自制支架由易于获取的材料制成，大幅降低了实验成本。此外，其结构设计简单，研究人员可轻松完成组装与拆卸，从而节约实验室操作的时间与人力。同时，该自制支架可清洗并灭菌后重复使用，为持续性研究提供了可持续且经济的选择。这一特性对于需要获得稳定且可靠结果的长期研究尤为有利。
子宫内膜基质细胞和上皮细胞在促进胚胎成功着床过程中发挥关键作用。在生理条件下，子宫内膜中的上皮细胞与基质细胞通常并不直接接触。关于人类子宫内膜基质细胞蜕膜化的研究已证实，上皮细胞可通过旁分泌方式影响蜕膜化过程。上皮细胞与基质细胞之间的紧密空间关系使得它们能够通过旁分泌信号通路实现有效通讯12。这种细胞间相互作用对于协调子宫内膜的周期性变化至关重要，包括为胚胎着床做准备，以及在未发生着床时启动后续的组织脱落过程11。上皮细胞和基质细胞均表达雌激素和孕激素受体，这些激素调控细胞的增殖、分化及分泌活动。上皮-基质间的交互对话确保了这些生物学反应的协调一致13。因此，这两类细胞之间复杂的相互作用仍是当前研究的关键领域，深入理解这些过程对于阐明子宫内膜容受性及胚胎着床的精细机制具有重要意义14。尽管生殖生物学领域已取得显著进展，但在胚胎着床期间这些细胞类型之间通讯的具体机制仍尚未完全阐明15。
该支架为两种贴壁细胞的共培养提供了便捷的方法。然而，在长期共培养过程中，盖玻片上的细胞会持续生长并不断更新，死亡的细胞可能脱落并与下层细胞接触，从而影响下层细胞的状态。此外，接种在盖玻片上的细胞是倒置放置在支架上的，重力是否会对细胞状态产生影响尚不清楚。本研究以hESC和Ishikawa两种细胞系为例进行了验证。该支架可广泛应用于不同类型贴壁细胞系之间的共培养。此外，该支架还可作为其他化合物或药物释放介质的平台，以及发光、加热和电极等各类装置的安装平台。
在此，我们介绍一种可靠且稳健的方法 体外 利用特定支架的细胞培养系统，是进一步研究胚胎-母体子宫细胞相互作用分子机制的有用且便捷的工具。此外，我们已表征了所建立支架作为囊胚/滋养层细胞研究模型的可行性。本方案可通过3D打印技术构建合适的支架，并在小体积（12孔板）中作为细胞迁移或侵袭的三维结构平台，结合成像定量系统对不同影响因素进行评估。
使用细胞系可实现模型的标准化，从而比较不同条件，而使用新鲜的原代绒毛组织则无法做到这一点。然而，细胞系中的任何组分均可替换为原代培养以进行验证。通过引入来自特定患者的细胞和组织，该模型有望促进对已知导致不孕和妊娠失败的各类疾病的展示与建模。
关键步骤 
首先，Ishikawa 细胞共培养时的密度应加以控制，融合度约为 60%–70%。其次，应将带有细胞的盖玻片朝下放置。第三，ECM 的浓度应低于 3 mg/mL，以避免形成凝胶。第四，共培养体系中的培养基液面应覆盖盖玻片。
局限性 
上述模型包含子宫内膜上皮细胞和间质细胞；本研究的一个局限性在于使用腺癌Ishikawa细胞作为上皮细胞的替代物，而非原代细胞。若能整合来自同一患者的原代上皮细胞和间质细胞，则可更真实地模拟人类子宫内膜的生理条件。在某些实验应用中，可能的局限性在于缺乏其他细胞类型，例如内皮细胞和免疫细胞，并且该模型中未对腺体结构进行表征，因而无法评估子宫内膜腺体对其他子宫内膜细胞类型的相互作用影响。然而，在生理条件下，上皮细胞具有极性，而在缺乏子宫腔环境的情况下，这种特性在体外极难模拟。in vitro条件下难以模拟上皮细胞的极性特征。子宫内膜间质细胞在月经周期中经历蜕膜化过程16,17。然而，蜕膜化的分子机制仍不明确。包括免疫细胞和内皮细胞在内的多种因素可能参与调控蜕膜化过程。该模型仅能有限地研究蜕膜化过程中间质细胞与上皮细胞之间的间接相互作用。此外，蜕膜化过程中生物学标志物的表达水平及其功能作用仍不清楚，有待进一步探索

尽管对人类妊娠已开展大量研究，但着床期及早期妊娠期间母胎界面的分子机制仍远未明确1人类子宫内膜主要由两种细胞类型组成：子宫内膜上皮细胞（EECs）和子宫内膜基质细胞（ESCs）。着床过程分为三个阶段：定位、黏附和侵入，这些阶段共同促进具有发育潜能的胚胎与容受性子宫内膜的形成2考虑到伦理方面的限制 体内 涉及人类受试者的研究，以及在动物中完全模拟人类状况所面临的困难，因此构建 体外 人类子宫内膜培养模型已成为模拟胚胎着床和早期妊娠过程的有效手段3这些模型在研究正常和病理妊娠方面具有重要价值，并为转化医学中治疗干预措施的初步测试和验证提供了基础平台。
商用腔室已广泛应用于细胞生物学研究。这些腔室可为细胞迁移以及不同类型细胞之间的相互作用提供有价值的见解。然而，商用腔室通常为一次性使用，且成本较高4。
大量 体外 由子宫内膜和胚泡或胚泡替代物组成的人类体外培养模型已被开发，以更深入地理解着床过程的详细机制。然而，这些模型目前仍处于应用的初期阶段，因为三维结构实验体系极为复杂，且某些特定的分化培养基成本较高5,6,7.
使用价格合理的3D打印设备以及相对较短的制造周期，使得能够针对不同的实验目的定制结构。3D打印技术有助于降低时间成本，并实现复杂且个性化的结构制造。该技术显著加快了原型设计与迭代过程，成为各领域研究人员的有力工具，使其能够更高效地完成工作8,9,10。
本文介绍了一种可行且经济的实验方案，用于构建三维结构并将其用作细胞培养系统，以模拟胚胎着床过程中子宫内膜间质细胞与上皮细胞之间的相互作用，从而研究子宫内膜容受性。该方法为商用一次性材料提供了一种可定制且低成本的替代方案。

<table><tbody><tr><td>10x Hanks&amp;prime; 平衡盐溶液</td><td>Solarbio</td><td>H1046</td><td>1/10</td></tr><tr><td>12孔透明TC处理培养板</td><td>Corning</td><td>3513</td><td>-</td></tr><tr><td>25 cm&amp;sup2; 细胞培养瓶</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>-</td></tr><tr><td>铝材</td><td>Markforged</td><td>6061-T6</td><td>-</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D2906</td><td>-</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良Eagle培养基&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10099141C</td><td>1/10</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>10099141C</td><td></td></tr><tr><td>ITS预混液</td><td>Biocoat</td><td>354350</td><td>1/100</td></tr><tr><td>Matrigel基质</td><td>Corning</td><td>354248</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Metal X</td><td>Markforged</td><td>M F-PR-5000</td><td>-</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>1/100</td></tr><tr><td>圆形盖玻片</td><td>Biosharp</td><td>BS-18-RC</td><td>-</td></tr><tr><td>TrypLE Select (10X)</td><td>Gibco</td><td>A1217701</td><td>解离酶</td></tr></tbody></table>

使用两种贴壁细胞系的共培养模型

Co-culture Model Using Two Types of Adherent Cell Lines

胚胎植入受到母体-胚胎界面中不同类型细胞之间相互作用的影响。蜕膜内各种细胞类型之间的直接和间接通讯对于调控子宫内膜容受性至关重要；然而，介导这种相互作用的分子机制仍不明确。因此，需要建立一个研究植入过程的模型，以全面解析这一复杂生物学事件的机制。 体外 一种能够重现子宫内膜上皮-间质相互作用生物学特性的模型。该模型由常规细胞培养板和一个匹配的支架构成，支架由低成本材料通过三维（3D）打印技术制备而成。本文详细描述了模型构建、细胞准备、细胞接种、细胞培养、观察与评估的一系列实验方案。此外，我们还展示了显微镜下细胞生长状态良好的代表性结果。本研究旨在开发 体外 模拟子宫内膜间质细胞与上皮细胞之间，以及滋养层细胞与子宫内膜细胞之间相互作用的模型。

图1 展示了本实验所用细胞爬片的自制支架，该支架包含一个上部支撑环，专为适配标准的12孔细胞培养板而设计，底部则配有一个细胞爬片 holder，其具有四个L形杆状结构。
根据图2，在共培养条件下（图2A、B），两种细胞类型的密度在共培养72小时后仍保持较低水平；然而，单独培养的两种细胞类型密度显著增加（图2C、D）。此外，与单独培养的hESC相比，共培养的hESC长度更短（图2E–G）。
Ishikawa细胞与hESC细胞的特征表明这两种细胞之间存在相互作用。同时，该系统使我们能够继续对分离的细胞系进行后续实验，包括免疫化学染色和蛋白质印迹（western blot）。
<img alt="实验装置示意图，镊子正在处理烧杯中用于实验室测试的圆形支架。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67314/67314fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：实验方案中使用的3D打印盖玻片支架。（A）单体形式的支架。（B）二元形式的支架。（C）盖玻片在支架上放置方式的示意图。（D）支架置于标准12孔板中的示意图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67314/67314fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细胞培养显微镜比较；图E-G显示细胞密度分析和实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67314/67314fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：经不同条件处理3天的hESC和Ishikawa细胞系的特征分析。（A）在盖玻片上接种的Ishikawa细胞通过支架与hESC共培养（比例尺=200 µm）。（B）在盖玻片上接种的hESC通过支架与Ishikawa细胞共培养。（C）Ishikawa细胞在含10% FBS的完全培养基中培养。（D）hESC细胞在含10% FBS的完全培养基中培养。（E）在共培养条件下，hESC的细胞密度显著低于独立培养条件下的细胞密度。（F）在共培养条件下，Ishikawa细胞的细胞密度显著低于独立培养条件下的细胞密度。（G）在共培养条件下，hESC的长度显著缩短。N=3；***，p&lt;0.05，误差条表示标准误差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67314/67314fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
补充文件1：3D打印编码文件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67314/3D-print.stl" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

该方案展示了一种新型的体外实验模型，可通过三维（3D）打印支架重现两种贴壁细胞系的生物学特性。文中详细描述了从细胞制备、细胞培养到分析与评估的模型构建及操作流程。

胚胎植入受到母体-胚胎界面中不同类型细胞之间相互作用的影响。细胞间的直接与间接通讯……

正如我们机构名称“母胎医学研究所”所表明的，我们的研究主要聚焦于女性生殖生物学。我们的目标是阐明生殖障碍的机制，并确定潜在的治疗靶点。这种方法的一个关键优势在于，与商业化的共培养系统相比，可显著减少时间和经费支出。该自制支架由 readily available 的材料构建而成，显著降低了实验装置的成本。这种多细胞体外模型能更好地模拟植入区域复杂的体内解剖结构。未来，我们实验室将在这一混合接种的多细胞体外模型中引入其他细胞类型，并进一步研究胚胎植入过程以及子宫功能在子宫内膜损伤和宫腔粘连等疾病发病机制中的作用。首先，获取用于模型构建的3D打印支架。进行细胞培养时，将一块洁净且无菌的18毫米方形盖玻片置于12孔板底部。用200微升浓度为200至300微克/毫升的细胞外基质溶液包被盖玻片。将培养板置于 37 摄氏度环境中一小时。随后从培养板中移除细胞外基质。接着，在显微镜下检查先前培养的人胚胎干细胞和 Ishikawa 细胞，以确认其汇合度适当。然后从孔中移除用过的培养基，并用三毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次。现在加入两毫升消化酶，在37摄氏度下孵育两分钟以使细胞脱落。使用完全培养基中和反应。然后通过反复吹打制备单细胞悬液。取100 µL细胞悬液与台盼蓝混合，保持两倍稀释系数。然后将盖玻片覆盖在血细胞计数板的计数室上。将细胞悬液与台盼蓝混合后，加入两侧腔室。在20倍显微镜下计数两侧方格内的细胞数量，并根据计数结果计算细胞密度。随后，将人胚胎干细胞以每毫升10的5次方个细胞的浓度接种至含有新鲜培养基的预处理培养板中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养24小时。对于 Ishikawa 细胞系，次日将细胞接种至无盖玻片的孔中。将支架用乙醇和双蒸水充分浸泡两天。浸泡后，移除双蒸水并密封金属罐。然后使用高压灭菌器在121摄氏度下对支架进行灭菌。之后让其自然干燥。向含有Ishikawa细胞的孔中加入约2毫升的完全培养基。将附着有人胚胎干细胞的盖玻片转移至支架上，使细胞面朝下。将支架插入含有Ishikawa细胞的孔中。对于第二种设置，将带有Ishikawa细胞的盖玻片放置在支架上，并将其插入含有胚胎干细胞的孔中。将共培养体系置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。小心移除孔中的培养基，并用无菌PBS轻柔冲洗细胞。使用精细镊子或镊子，从培养皿中取出附着有细胞的盖玻片。可选步骤：将盖玻片放入盛有 PBS 的新培养皿中，以在转移过程中保持其湿润。在干净的显微镜载玻片上滴加一滴 PBS，然后轻柔地将带有细胞的盖玻片转移至液滴上，确保细胞面朝下贴附于载玻片。将制备好的载玻片置于倒置显微镜的载物台上。 选择合适的物镜，并使用粗调和微调焦旋钮调节焦距。设置显微镜参数，包括照明强度和相机设置。使用显微镜软件在所需放大倍数和视野下采集图像。两种细胞在共培养条件下培养72小时后密度均保持较低水平，而单独培养的细胞密度则显著增加。共培养的人胚胎干细胞长度短于单独培养的细胞。

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生物学

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使用两种贴壁细胞系的共培养模型

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