从成年小鼠海马体中分离小胶质细胞并进行全细胞膜片钳记录

我们的研究重点是急性分离小胶质细胞以进行全细胞记录，包括记录钾电流，从而了解离子通道活性。该方案还可适用于从不同脑区分离小胶质细胞，为多种神经系统疾病状态下的小胶质细胞功能提供研究依据。

我们研究领域的最新进展包括采用传统的胰腺炎酶消化方法，并结合荧光激活细胞分选技术进行小胶质细胞纯化。这些进步提高了分离特定小胶质细胞群体的准确性和效率，为进一步研究提供了支持。

本方案直接研究成年小鼠海马区小胶质细胞的电生理特性，而非依赖原代培养的小胶质细胞。该方法能够更准确地分析小胶质细胞在其原生环境中的功能。

我们的研究结果为探索小胶质细胞在生理和疾病状态下的生物化学特性及功能特性提出了新的科学问题，为研究人员进一步探究这些方面提供了宝贵指导。

[Presenter] 首先，将麻醉后的动物仰卧位固定于解剖台上，并用针固定四肢。暴露胸部，用冰浴、无菌的磷酸盐缓冲液（PBS）灌注心脏，以清除血管内循环的血细胞。然后固定头部，用剪刀沿脑中线剪开皮肤，暴露颅骨。接着用小剪刀在颅骨后部两侧以及两眼眶之间进行剪切。沿矢状缝剪开颅骨，并用镊子移除颅骨。随后迅速取出脑组织。现在，将脑组织置于含有冰浴 PBS 的 10 厘米培养皿中。用镊子分离双侧大脑皮层。分离海马组织并将其切成更小的碎片。将碎片转移至 15 毫升离心管中。然后用 2 毫升冰浴的汉克氏平衡盐溶液（Hanks' Balanced Salt Solution，HBSS）重悬海马组织小块。在室温下以 300 ×g 离心 3 分钟。弃去上清液后，向含有海马组织碎片的 15 毫升离心管中加入 1,950 微升酶混合液一。将离心管置于 37°C 水浴中持续震荡 5 分钟。接着，向 15 毫升离心管中加入 30 微升新鲜配制的酶混合液二。用 1 毫升移液枪头将组织碎片上下吹打 20 次，并在 37°C 水浴中持续震荡孵育 5 分钟。取出离心管后，用 1 毫升移液枪头反复吹打悬液多次，直至无大块组织残留。然后将细胞悬液通过 70 微米细胞筛网过滤，滤液收集至洁净的 50 毫升离心管中。将滤液转移至新的 15 毫升离心管，于 4°C 下以 300 ×g 离心 10 分钟。用 1 毫升移液器弃去上清液。现在，用 15 毫升 HBSS 将细胞悬液上下吹打 20 次以洗涤细胞，随后于 4°C 下以 300 ×g 离心 10 分钟。弃去上清液后，用 1 毫升磁珠激活细胞分选缓冲液重悬细胞沉淀。首先，将 1 毫升制备好的单细胞悬液转移至 2 毫升微量离心管中，于 4°C 下以 300 ×g 离心 3 分钟。去除上清液后，用 90 微升磁珠激活细胞分选缓冲液（或 max buffer）重悬单细胞沉淀。加入 10 微升 CD11b/c 磁珠，于 4°C 在水平摇床上孵育 15 分钟。然后直接向管中加入 1 毫升 max 缓冲液以洗涤单细胞悬液。离心后，用 500 微升 max 缓冲液重悬细胞沉淀。使用 1 毫升移液器将重悬的细胞悬液转移至置于磁场中的分选柱。在保持磁场状态下，用 500 微升 max 缓冲液洗涤分选柱三次。随后将分选柱移出磁场。向分选柱中加入 1 毫升 max 缓冲液，并用活塞缓慢推过柱体，收集流出液。现在，将分选出的细胞接种至含有经多聚-L-赖氨酸包被的盖玻片的 24 孔板中。加入 200 微升培养基，在 37°C、95% 氧气、5% 二氧化碳及 60% 至 80% 湿度的培养箱中孵育 20 分钟。首先，取自小鼠脑组织分离培养的小胶质细胞。在水镜下使用 40 倍物镜定位球形的小胶质细胞。接着，用细胞内液填充电极，并将其连接至膜片钳系统的放大器头部。施加正压。切换至 4 倍物镜并定位电极。然后将电极缓慢下降至浴液中。将放大器设置为电压钳模式，在浴液模式下进行膜测试。之后，切换回 40 倍物镜，并将电极尖端移近小胶质细胞。接下来，施加微弱的负压以吸附细胞。当电阻达到 100 兆欧时，在膜测试中由浴液模式切换至封接模式。当电阻达到 300 兆欧时，释放负压。当电阻显示电极与小胶质细胞膜之间已形成吉欧姆级封接时，在膜测试中由封接模式切换至细胞模式。随后施加轻微吸力并启动电击以击穿膜。之后切换至电压钳模式，打开记录程序，记录 200 毫秒的钾离子电流。