基于核磁共振的代谢组学在危重患者中异常代谢物的鉴定与定量

我们的研究采用基于核磁共振（NMR）的代谢组学方法，鉴定在重症监护病房（ICU）危重患者中发生异常的代谢物及生化通路，并纳入了急性呼吸窘迫综合征（ARDS）患者，这是一种严重的肺部疾病。通过分析并比较代谢特征谱，我们旨在揭示与疾病进展相关的生化紊乱，并据此定制治疗方案以改善患者预后。实际上，我们正致力于填补对各类ARDS患者（包括轻度、中度和重度ARDS患者）代谢失调机制认知上的空白。

为了加深对疾病及其进展的理解，最终通过提供精准医疗和个性化医疗来改善患者的治疗效果。核磁共振（NMR）技术具有样品制备简便的优点，可保持血清的完整性以供重新分析，并且无需化学衍生化即可检测已知和未知的代谢物。该技术可提供可重复的定量数据，确保代谢物测量结果的可靠性。

与靶向方法不同，核磁共振（NMR）能够灵敏且无偏倚地探索代谢变化，非常适合用于发现疾病进展过程中的特征性标志物和通路。我们的研究发现将通过揭示在不同阶段中尚未被充分研究的代谢变化，推动急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的研究。利用基于核磁共振的代谢组学方法，我们旨在鉴定出异常的代谢物和代谢通路，从而为早期诊断、预后评估、更及时的预测及治疗提供潜在的生物标志物。

该方法推进了个体化管理，并加深了对多状态代谢谱分析的认识。我们的研究结果为提出新的科学问题奠定了基础，例如：在ARDS不同阶段鉴定出的特定代谢物如何影响疾病的进展？这些失调的通路能否作为早期治疗干预的靶点？

此外，这些代谢变化在其他呼吸系统或炎症性疾病中如何差异？首先，使用无菌针头，从诊断为轻度或中度急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的患者的动脉中采集两毫升血液。将血液转移至无菌小瓶中，并在室温下静置30分钟使其凝固。

将凝固的血液在3,100 G条件下离心15分钟，以分离血清。将血清转移至无菌微量离心管中，每管分装400至500微升。用患者信息标记各管，并于-80摄氏度保存。

进行核磁共振（NMR）实验时，将250微升血清等分试样与250微升磷酸盐生理盐水缓冲液混合，以最小化pH值变化。涡旋混合约15秒，确保均匀混合。将制备好的样品转移至洁净的NMR管中，NMR管内含同轴插入件，插入件中含有浓度为0.05毫摩尔的TSP。

接下来，将核磁共振管放入磁体中。输入 WRPA 并选择适当的实验编号，以使用 CPMG 脉冲程序设置质子实验。点击“标题”选项，输入患者姓名及其他必要信息。

输入锁定指令并按回车键以锁定磁场。然后，选择 90% 水和 10% 氘代氧化氘的选项。接着，输入 ATMM 并按回车键，以对探头进行调谐和匹配。

接下来，从“采集参数”选项中选择参数，设置为在 128 次扫描中采集 64,000 个数据点以收集优化数据。设置弛豫延迟为 5 秒，谱扫描宽度为 12 PPM，回波时间为 200 微秒，重复 300 次。使用指数窗函数应用 0.3 赫兹的线宽展宽。

接下来，使用核磁共振（NMR）处理与分析工具采集NMR谱图。获得最终谱图后，输入APK和ABSN分别进行相位校正和基线校正。然后，点击上方面板中的“校准轴”（Calibrate Axis）选项，将TSP峰校准至0 PPM，可选择自动或手动方式进行校准。

最后，将NMR系统中获取的数据转移至工作站以进行进一步分析。在获取被诊断为轻度或中度ARDS患者的NMR谱图后，打开NMR代谢物定量软件进行数据处理。为使用Whitaker方法进行手动基线校正，请在NMR代谢物定量软件的处理器模块中打开谱图文件。

选择基线校正，然后选择Whitaker方法。在整个光谱范围内，在峰的基部放置点。完成后，将经过基线校正的光谱文件保存到同一个文件夹中。

接下来，使用 Profiler 模块进行光谱分箱，依次选择工具（Tools）、批量处理（Batch Process），然后选择光谱分箱（Spectral Binning）。为生成用于统计分析的最终分箱数据表，请选择包含所有基线校正后光谱文件的文件夹。将光谱划分为等宽的区间，每个区间的光谱宽度设定在每百万分之0.01至0.04之间。

设置桶大小以及起始和终止的 PPM 值。选择一个文件夹以保存输出的分箱表格。排除对应于水和溶剂 TSP 的化学位移区域，以防止谱图干扰。

最终的电子表格将在一行中显示样本名称，其他行则显示对应 PPM 的区段值。在进行统计分析之前，需使用某种归一化方法、对数转换和帕累托缩放对数据进行标准化。对于多变量分析，应进行主成分分析、偏最小二乘判别分析以及正交偏最小二乘判别分析，以观察组间的差异，并获得每个对代谢谱差异有贡献的代谢物的投影变量重要性得分。

采用学生t检验（Student's t-test）筛选显著性代谢物，p值阈值设为小于0.05。t检验生成箱须图，用于展示代谢物浓度的差异。随后进行生物标志物分析，绘制受试者工作特征曲线下面积（ROC曲线下面积）图。

根据投影变量重要性得分大于1、经Bonferroni校正后的p值小于0.05，以及曲线下面积大于0.8的标准，筛选出显著性代谢物的最终列表。利用人类代谢组数据库（Human Metabolome Database）鉴定对应特定PPM值的代谢物。在开始定量分析之前，使用处理器模块对本研究选定的参考化合物进行校准。

单击“校准化学位移指示器”选项，并输入参考化合物的浓度。将软件峰拖动至谱图参考峰位置，并调整其高度和宽度。当谱图参考峰与软件峰对齐后，单击“接受”。

接下来，在 Profiler 模块中打开所需谱图，并选择适合研究的化合物库。屏幕底部将显示代谢物列表。从列表中选择感兴趣的代谢物。

单击屏幕角落处的 PPM 数值。将谱图缩放至目标代谢物的特定 PPM 范围。此时屏幕上会出现两个峰，其中一个表示记录的数据，另一个以虚线显示，代表软件模拟的峰。

拖动软件峰，使其与记录的峰对齐，并调整峰的高度和位置以匹配。当峰正确对齐后，从“浓度（毫摩尔）”标题下显示的数值读取代谢物的浓度。要生成输出文件，请在“工具”菜单下点击“批处理操作”选项，并指定用于保存输出文件的目标文件夹。

主成分分析显示轻度与中度急性呼吸窘迫综合征（ARDS）患者组之间存在明显的聚类分离。正交偏最小二乘判别分析揭示了轻度与中度ARDS组之间的清晰区分，突出了代谢差异。t检验与生物标志物分析揭示了轻度与中度ARDS之间关键的失调代谢物。

乳酸和异亮氨酸被确定为与急性呼吸窘迫综合征（ARDS）严重程度显著相关的代谢失调代谢物。