Name: 使用基于 NMR 的代谢组学鉴定和定量危重患者紊乱的代谢物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T14:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: 了解基于核磁共振的代谢组学方法，用于识别和定量急性呼吸窘迫综合征危重患者体内紊乱的代谢物，揭示疾病进展相关的生物化学变化，为精准医学和个性化治疗提供重要依据。

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AS 感谢科学与创新研究学院（AcSIR）提供的注册支持（注册号：10BB22A71002）。AS 还感谢国防研究与发展组织（DRDO）提供的奖学金。我们感谢生物医学研究中心（CBMR）提供 800 MHz 核磁共振波谱仪设施，并通过院内项目（CBMR/IMR/0008/2021）提供资金支持。我们还感谢 SGPGIMS 重症监护医学科（CCM）的持续支持。我们感谢许多护士的帮助，以及最重要的是参与本研究的患者。本研究由生物医学研究中心（CBMR）的院内项目（CBMR/IMR/0008/2021）和国防研究与发展组织（DRDO）的院外项目（编号：LSRB/01/15001/LSRB-404/PEE&amp;#38;BS/2023）资助。

本研究已获得卢克诺桑贾伊·甘地医学研究生院（SGPGIMS）机构伦理委员会（IEC 代码：2022-71-PhD-126）的伦理批准。已获取患者或其亲属签署的书面知情同意书，以开展本研究并出于科研目的发表相关数据。此外，本研究遵循了机构制定的相关指南。
1. 研究设计与伦理审批
<ol>
	<li>确定每组的样本量。仔细审查并建立受试者的选择标准。此外，若研究设计需要纳入人类或动物样本，则在开始样本采集前，须从相应的机构伦理委员会（IEC）获得伦理审批。</li>
	<li>根据2012年柏林定义中基于动脉血氧分压（PaO₂）与吸入氧浓度（FiO₂）比值（P/F比值）的诊断标准，选择被分类为轻度、中度和重度的急性呼吸窘迫综合征（ARDS）患者。其中，P/F比值在300-200之间的ARDS患者视为轻度，100-200之间为中度，低于100为重度。38. 此处，我们重点关注了两组患者：轻度和中度急性呼吸窘迫综合征患者（见 表1). 
	注意：本研究使用从血液样本中获得的血清进行基于核磁共振（NMR）的代谢组学分析。本研究纳入的参考参与者平均年龄为42岁（±10.9岁），性别分布为2名男性和6名女性。</li>
</ol>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>分类</td>
			<td>P/F 比值</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>轻度</td>
			<td>300-200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>中度</td>
			<td>200-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>重度</td>
			<td>100-0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：急性呼吸窘迫综合征（ARDS）患者的分类。
2. 样本选择、采集与处理
<ol>
	<li>按照以下步骤进行血清分离。
	<ol>
		<li>实验时，使用无菌针头从动脉采集2 mL血液样本至无添加剂的无菌试管中。将样本在室温下静置30分钟使其凝固。本研究中选取了4名诊断为轻度急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的患者和4名中度ARDS患者。</li>
		<li>以3100 × g 离心15分钟，分离血清25。将血清转移至无菌微量离心管中，分装成较小体积（即400–500 µL），并做好适当标记（患者姓名、CR编号、采样时间点等），随后于-80 °C保存，以备后续分析。 
		注意：此时实验可暂停，并在合适时间继续进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在进行核磁共振（NMR）实验前，按以下步骤处理血清样本。
	<ol>
		<li>在进行NMR实验前将样本解冻。取250 µL血清分装样本与250 µL磷酸盐缓冲生理盐水溶液（含100% D2O、0.9% NaCl、50 mM磷酸钠缓冲液，pH 7.4）混合，以尽量减少pH变化。</li>
		<li>涡旋振荡混合物数秒（约15秒），确保均匀混合。最后将制备好的样本转移至洁净的NMR管中，NMR管内含同轴插入件，其中含有浓度为0.05 mM的三甲基硅丙酸（TSP），作为校准和定量的外标41。 
		注意：作为参考，应使用一种惰性且不具反应性的化合物，不与待测物发生相互作用。其他常用参考化合物包括四甲基硅烷（TMS）和三甲基硅丙磺酸钠（DSS）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 核磁共振实验
注意：本研究重点在于鉴定血清样品中的小分子，因此采用了抑制大分子信号的 Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）脉冲序列。本研究中所有血清样品均使用配备低温冷却三共振TCI 5 mm宽带反向探头及屏蔽z梯度的800 MHz核磁共振波谱仪进行检测。
<ol>
	<li>将样品放入磁体中。输入命令 wrpa（注明实验编号），然后按回车键，以 cpmg 脉冲程序设置质子实验。通过点击 标题 选项，注明患者姓名及其他必要信息。</li>
	<li>通过输入命令Lock并按回车键锁定磁场，随后选择90% H2O 和 10% D2O选项。通过ATMM手动调节和匹配探头，以优化射频脉冲效率并最大化灵敏度。通过点击topshim执行一维梯度匀场。</li>
	<li>设置以下采集参数：弛豫延迟为 5 s，谱宽为 12 ppm，回波时间为 300 µs。所有这些参数均可通过上方面板中的采集参数选项轻松修改。</li>
	<li>使用指数窗函数施加 0.3 Hz 的线宽展宽，共采集 128 次扫描，数据点数为 64,000。这些参数同样可通过上方面板中的采集参数选项进行修改。点击采集参数后，将显示参数列表，可在优化过程中修改所述属性及其他参数。</li>
	<li>使用核磁共振处理与分析工具采集 NMR 谱图。获得最终谱图后，输入命令apk和absn，并分别按回车键进行相位校正和基线校正。点击上方面板中的校准坐标轴选项，然后自动或手动将 TSP 峰校准至 0 ppm。</li>
	<li>将采集的数据从系统传输至工作站，以进行后续处理与分析。 
	注意：实验阶段现已完成，可暂停操作。数据预处理、分析与解释可随后方便地进行。</li>
</ol>
4. 数据预处理
<ol>
	<li>使用核磁共振（NMR）处理与分析工具以及NMR代谢物定量软件进行数据预处理。
	<ol>
		<li>有时仅靠自动校正并不足够，此时还需进行手动校正。要手动进行相位校正，请点击NMR处理与分析工具顶部菜单栏中的Process选项，然后点击Adjust Phase，拖动鼠标并观察，直至谱图完成相位校正。完成后，点击同一菜单栏中以图标形式呈现的Save and Return选项。</li>
		<li>要进行手动基线校正（Whittaker方法），请在NMR代谢物定量软件的处理器模块中打开谱图文件。选择Baseline Correction选项，然后选择Whittaker Method。接着在整个谱图范围内（通常血清样本为0.0至10 ppm，或根据谱图中代谢物的实际情况）在峰的基部放置若干点，以调整基线。所有谱图文件完成基线校正后，将其保存至同一文件夹中。后续处理可使用该软件的处理器或分析模块，基于保存为特定格式的同一文件进行。</li>
		<li>使用该软件的分析模块进行分段处理（binning）。选择Tools，然后选择Batch Process，再选择Spectral Binning。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点击Spectral binning后，选择包含所有已完成基线校正的谱图文件的文件夹，以生成用于统计分析的最终分段表格。</li>
	<li>将谱图划分为若干个等宽的区间，每个区间的谱宽设定为0.01至0.04 ppm（可根据具体研究优化）。该过程可简化并整理谱图数据，便于更一致的分析。需指定分段大小（bucket size）以及起始和终止的ppm值，并指定输出分段表格的保存文件夹。</li>
	<li>排除对应于水和溶剂TSP的化学位移区域（4.8–5.2 ppm和0.0–0.7 ppm），以避免谱图干扰42,43,44。</li>
	<li>该电子表格中，一行包含样本名称，其余行包含不同分段的数值及其对应的ppm值。在用于统计分析前，需对该表格进行修改：将样本按分析组别进行归类，并仅以逗号分隔（CSV）格式保存。 
	注意：例如，在比较急性呼吸窘迫综合征（ARDS）患者轻度组与中度组时，我们将数据按“轻度”和“中度”标签排列，添加序列号，并将文件保存为CSV格式。</li>
</ol>
5. 统计学分析
注意：上一步获得的分箱表格将作为统计分析的输入文件。本研究中使用了代谢组学统计分析软件中的单因素统计分析模块。
<ol>
	<li>在进行统计分析之前，使用总和、对数和帕累托方法进行归一化处理，但不同研究之间可能有所差异45.</li>
	<li>进行单变量和多变量分析，以区分不同组别并确定所鉴定代谢物的准确性。
	<ol>
		<li>进行主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），以观察组间差异，并获得每个对代谢谱差异有贡献的代谢物的投影变量重要性（VIP）得分。</li>
		<li>采用单变量方法，例如学生 t 检验和方差分析（ANOVA），根据 p 值小于 0.05 的标准筛选显著性代谢物。这两种检验均可生成箱须图，展示代谢物相对浓度的差异。</li>
		<li>进行生物标志物分析，得到受试者工作特征曲线（AUROC）下的面积。曲线下面积（AUC）值 &gt; 0.8 被认为具有显著性46.</li>
		<li>使用 VIP 评分标准筛选出显著性代谢物的最终列表&gt;1，经Bonferroni校正的p值&lt;0.0544，以及 AUC &gt; 0.846.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照下述方法鉴定代谢物。
	<ol>
		<li>分箱以 ppm 值的形式提供显著代谢物，而非代谢物名称。利用生物磁共振数据库（Biological Magnetic Resonance Bank, BMRB）等数据库，鉴定对应于特定 ppm 值的代谢物。47以及人类代谢组数据库（HMDB）。</li>
		<li>除上述内容外，使用已发表的文献42,44 用于鉴定与验证。</li>
		<li>使用核磁共振代谢物定量软件中的分析模块，根据化学位移（ppm）值确认所鉴定的代谢物。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 使用核磁共振代谢物定量软件对代谢物进行定量
注意：该软件的分析模块被广泛用于对已鉴定的代谢物进行定量分析。
<ol>
	<li>开始定量分析之前，使用处理器模块对所选的参考化合物（本研究中使用的是 tsp）进行校准。点击 校准 CSI（化学形状指示剂） 选项，输入参考化合物的浓度（本研究为 0.05 mM）。然后将软件中的峰拖动至谱图中的参考峰位置，并适当调整其高度和宽度。当谱图中的参考峰与软件峰完全匹配后，点击 确定。</li>
	<li>在分析模块中打开目标谱图，并选择适用于本研究的化合物谱库。</li>
	<li>屏幕底部将显示代谢物列表。从该列表中选择感兴趣的代谢物。选定后，该代谢物可能的 ppm 值将显示在谱图的右上角。</li>
	<li>点击右上角的 ppm 值，并对谱图进行放大，以查看该代谢物特定的 ppm 范围。</li>
	<li>此时屏幕上将出现两个峰：一个代表实际记录的数据，另一个以虚线显示，代表软件生成的峰。对齐这两个峰，通过拖动软件峰并调整其高度和位置，使其与样品中的峰完全匹配。</li>
	<li>完成准确对齐后，可在该代谢物对应的“浓度”（单位：mM）标题下显示的数值中读取其浓度（图 1）。</li>
	<li>对所有代谢物和样品重复上述步骤，并将定量结果导出为电子表格文件。为生成输出文件，请点击 工具 菜单下的 批量操作 选项，并指定用于保存输出文件的目标文件夹。</li>
</ol>
7. 通路分析
注意：分析后鉴定出的显著代谢物可用于确定直接影响疾病组结果的主要通路。通常使用代谢组学统计分析软件的通路分析模块以及KEGG数据库来实现此目的。
<ol>
	<li>将获得的显著代谢物列表输入该模块，将生成包含通路名称的列表。</li>
	<li>根据影响因子大于 0.1 的标准筛选最终通路。显著的影响值表明与疾病相关的通路30。</li>
	<li>深入分析所得通路，以阐明与疾病严重程度相关的失调机制。该方法的一个缺点是，当显著代谢物少于 3 个时，难以有效识别失调通路。</li>
	<li>为应对这一问题，还可通过查阅已发表的文献来确定所鉴定代谢物及其与疾病严重程度的相关性。进行系统的文献调研，并观察所鉴定的代谢物是否与您关注的趋势一致。</li>
</ol>
<img alt="核磁共振波谱工作流程图：从样品到重要代谢物的鉴定与相关性分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67319/67319fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：基于核磁共振的代谢组学基本步骤。 该图展示了基于核磁共振（NMR）的代谢组学中的关键步骤：样品采集与制备、核磁共振波谱检测、数据预处理、统计分析、代谢物的鉴定与定量，以及生物学意义的解读。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67319/67319fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

Metabolomics Using NMR Spectroscopy to Identify Dysregulated Metabolites

作者声明不存在竞争性财务利益。

代谢组学能够高效地鉴定和定量代谢物，针对疾病过程中发生紊乱的代谢循环。结果的质量取决于代谢组学方法中每一步操作的严谨性。从样本选择与采集到通路鉴定的每一个阶段，对于准确识别导致疾病的主因都至关重要。在开展代谢组学研究之前，必须全面回顾相关文献，并在每个阶段都给予仔细关注。
在设计代谢组学研究时，样本的选择对于提取有意义的信息以及确保理想的样本制备至关重要，无论研究目的是针对特定代谢物还是对所关注的临床状况进行非靶向代谢指纹分析。正确的初始样本处理非常关键，整个研究过程中应对所有样本始终如一地遵循标准操作流程49。处理临床样本时需格外谨慎。基于核磁共振（NMR）的代谢组学研究中常用的样本包括生物流体、细胞提取物和组织提取物50,51。脑脊液（CSF）和尿液通常需要极少的预处理，常被用于肾脏相关疾病、神经退行性疾病及药物毒性等研究场景。全血、血浆和血清能够为多种重大疾病提供全面的信息，且因其采集方便而被广泛采用。其他多种生物流体，如精液、唾液、胆汁、透析液、羊水、呼出气冷凝液、肺部抽吸物、滑膜液以及微型支气管肺泡灌洗液（mBALF），也已通过NMR技术被广泛应用于研究，因其具有高度的特异性和准确性52,53,54。每种生物流体在采集、可获得性及信息含量方面各有优势与挑战，具体取决于研究目的或实验设计55。本研究聚焦于急性呼吸窘迫综合征（ARDS）患者的血清样本，因为血液样本通常能反映全身水平的代谢状态，且不易受到极端日常波动的影响。相比之下，尿液样本易受多种因素波动影响，可能受到饮食、生活方式、药物及环境因素的干扰27。适当的样本储存也至关重要，以避免酶活性或微生物降解。样本通常应于-80 °C冷冻保存，并尽量减少冻融循环，以防止代谢物降解并维持样本稳定性。样本可在-80 °C长期保存，便于灵活安排NMR实验。然而，为获得最佳结果，建议尽早规划并开展实验。
本研究采用800 MHz核磁共振波谱仪进行数据采集，可获得高分辨率的谱图数据。本实验遵循上述相同的采集参数。但需要注意的是，本方案中所述的采集参数同样适用于其他磁场强度的核磁共振波谱仪。在较低磁场强度下运行时，可通过增加扫描次数来提高分辨率。尽管更高的磁场强度可能提供更优的分辨率，但采集过程中的核心参数，如脉冲序列、弛豫延迟和温度控制，在不同仪器之间保持一致，从而确保实验结果的可重复性和可靠性。
遵循标准化操作流程对于保持实验的可重复性和客观性至关重要，因为任何偏差都可能妨碍后续的数据分析与评估。核磁共振（NMR）实验的每一步都必须仔细执行，因为谱图质量取决于这些操作。应特别关注匀场（shimming），因为它决定了峰形；同时应根据样品和研究设计优化采集参数。对于样品中代谢物浓度较低的情况，可增加扫描次数。NMR数据采集涉及针对样品类型及所需特定信息，对一维（1D）和二维（2D）实验进行标准优化。已有多种NMR实验被优化，用于从生物流体中获得高质量谱图，并最大限度减少不希望的生物大分子的干扰。对于血清、血浆或脑脊液等样品，优先选用CPMG脉冲序列56。该技术可抑制来自脂质和蛋白质等大分子的宽信号，这些大分子具有较长的横向弛豫时间，可能掩盖低分子量代谢物的共振信号。
数据预处理包括用于确保数据分析及其解释具有一致性和同质性的中间方法。该过程涉及避免不希望出现的信号或易产生不一致的谱图区域，并校正峰位移。在生物流体中，排除不需要的区域通常意味着去除占主导地位的信号，例如在4.6 ppm至5 ppm范围内来自水的信号。峰位移由pH值、温度、盐浓度、稀释倍数和离子组成的变化引起，可通过使用维持稳态pH值的缓冲液来减小。此外，使用标准参考化合物、峰对齐和分箱（binning）方法也有助于减少峰位移。峰对齐对于关联在相同条件下获取的不同谱图中的模式至关重要。
光谱处理必须正确进行，以确保后续分析中准确的谱峰归一化。所有光谱均应进行统一的校准和对齐，基线校正和相位校正可手动或自动完成。正确的相位校正、基线校正以及校准至关重要。进行基线校正是必要的，以避免可能影响代谢物鉴定与定量的失真。57相位校正对于确保结果解读不受畸变或倒置峰的影响至关重要。应谨慎确定显著性代谢物的筛选标准，并据此对结果进行过滤。由于分箱处理以 ppm 值形式提供结果，需利用本方案中提及的多种资源准确鉴定代谢物名称。若在同一 ppm 值处存在多个代谢物，应通过峰形特征加以区分。
在进行统计分析之前，需对数据集进行归一化处理，以减少由于代谢物浓度在数量级和波动幅度上的差异所引起的变异，无论这些变异是否由实验因素诱导产生。该过程根据数据的分布特征和变异性，采用不同的中心化、缩放和转换方法。其目标是在保留感兴趣的生物学因素的同时，最大限度地降低非预期的系统性偏差。采用多元统计方法，包括主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），筛选变量重要性投影（VIP）值大于1的差异代谢物。模型的可预测性和交叉验证结果通过R²（拟合优度）和Q²（预测优度）值进行评估，同时利用置换检验的统计结果对模型进行验证。基于皮尔逊相关性的热图用于评估模型的稳健性，通过统计亚表型及由此产生的内表型中上调和下调的代谢物数量来实现。
单变量方法，例如学生t检验和方差分析（ANOVA），以及如Bonferroni校正或FDR（假阳性发现率）最小化和Benjamini-Hochberg方法，被用于降低假阳性的概率。这些方法提供了对潜在重要特征的粗略评估，而不考虑这些特征在分子内或分子间以及其他混杂因素中的相关性。显著性代谢物根据p值小于0.05来确定，随后用于支持结果亚组中的代谢内型45。
采用单个箱线图和AUROC来评估内型在不同结局亚组中的特异性和敏感性。将临床评分与模型结合进行AUROC分析，以验证模型的准确性。AUC值&#62;0.8被认为具有显著性46。此外，还可通过多种在线方法检验所识别代谢物的判别准确性和有效性，例如随机森林分类、热图、相关性分析等45。
定量重要代谢物的方法有多种，包括峰面积积分法，由于该方法技术要求较高，初学者可能难以掌握。通过查阅各代谢物的化学位移值，确定其特征峰以实现精确定性。将这些特征峰的面积与参考物质三甲基丙酸钠（TSP）峰面积进行比较。计算代谢物的绝对浓度（Cm）时，使用以下公式：
Cm = Im.nr.Cr/Ir.nm
其中，Cr 为溶液中参考化合物（TSP）的浓度，Im 和 Ir 分别为代谢物和参考物（TSP）的积分峰面积（可通过核磁共振谱图处理与分析工具获得），nm 和 nr 分别代表代谢物和参考物峰所对应的质子数目24。
或者，可使用自动化的核磁共振（NMR）代谢物定量软件，基于参考标准物三甲基丙酸钠（TSP）的浓度，对单个或多个谱图进行代谢物浓度测定。使用软件进行定量可简化操作流程，并相较于其他方法降低出错的可能性。尽管本研究论文重点介绍了利用软件进行代谢物定量的方法，但如果目标代谢物未包含在软件数据库中，则可能存在问题。此外，该软件为付费使用，仅持有授权许可的研究人员方可使用。
代谢组学通过鉴定导致疾病严重程度的失调代谢循环，在揭示多种疾病的复杂性方面已证明具有重要作用。然而，将这些发现转化为临床实践一直面临挑战。目前医学界正强调采用个体化医疗的方法以改善疾病预后。过去，仅识别失调的代谢物已足够，而当前的研究重点已转向精确定量，以定义疾病特异性的参考范围。这些信息对于临床医生定制治疗策略具有重要价值。定量技术的进步推动了研究工作的开展，全球众多研究团队已成功利用专用软件应用这些方法。
这一进展凸显了代谢组学在显著影响个体化医疗和改善临床结局方面的潜力。此外，将代谢组学数据与其他组学数据（如基因组学和蛋白质组学）相结合，有望更全面地理解疾病机制，并进一步优化治疗干预措施。随着技术的持续发展，代谢组学在临床环境中的精确性和实用性有望不断提升，为更有效、更个性化的医疗解决方案铺平道路。

尽管全球范围内持续努力以提供高效的疾病诊断，靶向治疗仍未充分发挥其真正潜力。转录组学、蛋白质组学等多种方法已鉴定出若干生物标志物，但由于缺乏足够的灵敏度和特异性，这些标志物在临床上的应用价值有限1,2。在某些多因素疾病中，靶向治疗仍面临巨大挑战，最终导致较高的死亡率。对于具有广泛异质性的复杂疾病，亟需更深入地理解其潜在机制和病理生理过程。在此背景下，代谢组学的发展已彻底改变了治疗策略的研发，未来有望为急性呼吸窘迫综合征（ARDS）、脓毒症和重症急性胰腺炎（SAP）等各类危重疾病提供个体化的治疗方案。
代谢组学是一种综合性方法，旨在鉴定和定量各种生物流体、细胞或组织提取物中的小分子量物质（如氨基酸、脂质、肽类、有机酸和维生素等代谢物）。这些分子量通常小于1500 Da的代谢物在生物化学过程中发挥着积极作用，反映了生物体生物学状态的动态变化。它们包括关键酶促反应的底物、生物通路中的中间产物以及细胞代谢的副产物。因此，代谢组学能够捕捉到饮食影响、药物相互作用和疾病状态的详细特征。代谢物的变化是代谢活动和生物通路的高度敏感指标，可用于关联表型表达及由此产生的病理生理异常3,4。代谢物的初始变化可作为疾病严重程度的早期指标，而随时间推移的变化则有助于监测治疗效果、疾病进展和临床结局5,6,7。因此，代谢组学通过临床、生理和生化终点重新定义疾病，从而增强了临床检测及其他多种组学方法的应用价值8,9,10,11,12,13。代谢组学的分析能力被用于通过检测代谢物浓度的改变来监测和确定疾病易感性14,15。
在此背景下，质谱法（MS）和核磁共振（NMR）波谱法已成为生物样本中代谢物分析的主要技术平台。这些方法可用于靶向和非靶向的代谢物鉴定与定量16,17,18。每种技术平台均有其优势与局限性，但NMR具有非破坏性特点，因此在多种活体（in vivo）研究以及未知化合物结构表征中更具优势，尤其适用于代谢组学研究的初期阶段。质谱分析前所需的样品分馏、衍生化和电离过程可能引入偏差，且常导致样品损失，从而影响对代谢物动态特征的准确捕捉；而NMR波谱法通常无需或仅需极少的样品前处理即可实现此类检测。NMR的主要局限在于其灵敏度低于MS，检测限较高，因而难以检测丰度较低的代谢物19。然而，随着高分辨率超导磁体、低温冷却NMR探头以及多种提升灵敏度技术的发展，这一局限已得到显著改善20,21,22。作为基因组学和蛋白质组学的补充手段，基于NMR波谱法的代谢谱分析正日益成为一种备受青睐的技术23,24,25。尽管存在灵敏度方面的挑战，NMR因其样品前处理简便、结果可重复性高，仍是一种有效捕捉代谢物内在动态特征的重要工具26。
多个研究团队已成功开展了代谢组学研究，确定了多种疾病患者的代谢失调特征27，例如急性呼吸窘迫综合征（ARDS）28,29,30,31,32,33、肺炎34、脓毒症7、胆结石35和胰腺炎36。基于核磁共振（NMR）的代谢组学研究在危重患者中发挥了重要作用，可用于追踪从全身炎症反应综合征（SIRS）进展至多器官功能障碍综合征（MODS）的过程，后者是重症监护病房（ICU）患者死亡和发病的主要原因37。在Stringer等人的一项研究中，利用血浆样本分析了脓毒症所致急性肺损伤（ALI）患者与对照组患者之间的代谢变化38。该初步研究中发现的关键代谢物水平升高反映了所涉及的代谢通路及其与临床评分的关联。该研究进一步扩展至血清代谢组学，以区分脓毒症与ARDS中肺损伤机制的早期阶段32。此外，另一项针对ARDS的研究鉴定出强有力的血清生物标志物，可明确区分急性肺损伤/ARDS患者与健康对照者，揭示了与急性肺损伤发作相对应的全身性代谢改变39,40。
核磁共振（NMR）波谱法是一种高通量、自动化的分析技术，能够提供关于代谢指纹的可靠且无偏倚的信息，揭示潜在的病理生理机制38。NMR数据的临床应用和生物学解释依赖于获取富含信息的高质量谱图。因此，确保数据采集、处理和分析的准确性、一致性和规范性至关重要。本研究旨在利用基于NMR的代谢组学关键步骤，实现对代谢物的鉴定与定量。本研究强调了开展临床代谢组学研究所需的关键实验步骤（图1），包括合适样本的选择、样本的采集与储存、样本处理与制备、数据获取与分析、目标代谢物的鉴定与定量，以及最终在临床背景下对结果进行解释以获得相关科学见解。上述每一步骤对于利用NMR波谱技术在代谢组学中揭示重要的生物学和临床信息均至关重要。

<table><tbody><tr><td>离心机</td><td>Sigma aldrich</td><td>3-18KS</td><td></td></tr><tr><td>Chenomx NMR suite&amp;nbsp;</td><td>NMR Suite, v9, Chenomx Inc., Edmonton, Canada</td><td></td><td>NMR代谢物定量分析软件</td></tr><tr><td>同轴插入管</td><td>Sigma aldrich</td><td>Z278513</td><td></td></tr><tr><td>重水</td><td>Sigma aldrich</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf管</td><td>Tarsons</td><td>500020</td><td></td></tr><tr><td>Metaboanalyst</td><td>Wishart Research Group</td><td></td><td>代谢组学统计分析软件</td></tr><tr><td>NMR管</td><td>Wilmad</td><td>Z412007</td><td>直径5 mm</td></tr><tr><td>移液器</td><td>Eppendorf research plus</td><td>3123000039</td><td>0–100 &amp;mu;l</td></tr><tr><td>样品收集瓶</td><td>Tarsons cryo chill vials</td><td>523194</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠晶体</td><td>Sigma aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma aldrich</td><td>567550</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Sigma aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Topspin 3.6.4</td><td>Bruker</td><td></td><td>NMR数据处理与分析工具</td></tr><tr><td>Tsp盐</td><td>Sigma aldrich</td><td>269913</td><td></td></tr></tbody></table>

基于核磁共振的代谢组学在危重患者中异常代谢物的鉴定与定量

Identification and Quantification of Deranged Metabolites in Critically Ill Patients Using NMR-Based Metabolomics

代谢组学正逐渐成为反映个体对病理生理状态应答的重要方法。核磁共振（NMR）波谱技术已发展为识别重症患者代谢紊乱的工具，适用于急性呼吸窘迫综合征（ARDS）、重症急性胰腺炎（SAP）、急性肾损伤（AKI）和脓毒症等疾病。通过800 MHz核磁共振波谱仪采集研究组与对照组血清样本的谱图数据，并利用核磁共振数据处理与分析工具进行处理。此外，采用严格的统计分析方法（如单变量和多变量检验）以确定具有显著差异的代谢物，随后使用核磁共振代谢物定量软件对其进行准确鉴定与定量。同时，通路分析可揭示导致疾病严重程度的异常生化循环。通过这一综合方法，研究人员旨在深入理解这些危重疾病相关的代谢改变，有望为疾病机制的进一步阐明以及诊断和治疗策略的优化提供支持。

进行代谢组学研究时，必须确定样本量以及将要分析的特定组别。选择合适的样本量对于获得与疾病严重程度准确相关的显著结果至关重要48。然而，在本项研究中，我们采用了较小的样本量，旨在演示基于核磁共振（NMR）代谢组学进行代谢物鉴定与定量所涉及的步骤，主要供参考之用。本研究分析了急性呼吸窘迫综合征（ARDS）患者在入住重症监护室（ICU）第1天时轻度与中度阶段之间的代谢差异，共纳入8名受试者。按照实验方案，采集并处理了所有样本的NMR谱图，最终生成了包含分箱结果的电子表格。
随后我们进行了严格的统计分析，将分箱表作为输入文件，使用总和、对数和帕累托方法对数据进行标准化。我们进行了主成分分析（PCA，图2A）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA，图2B），前者显示了样本的聚类趋势，而后者则揭示了组间明显的分离，并突出了代谢差异。置换检验（20次）得到的统计值为 R2Y=0.99 和 Q2=0.47。随后，我们进行了学生t检验（图2C）和生物标志物分析（图2D），以鉴定表达失调的代谢物。根据方案部分所述的标准，我们对结果进行了筛选，获得显著差异代谢物（表2）。
<img alt="显示ARDS严重程度的PCA和PLS-DA图表及ROC分析，展示聚类情况和数据方差。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67319/67319fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2：多变量与单变量分析。（A）主成分分析（PCA）以及（B）轻度ARDS患者（以红色表示）与中度ARDS患者（以绿色表示）的正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）。（C）箱线图展示了通过血清样本的质子核磁共振波谱检测到的轻度与中度ARDS患者之间代谢物相对浓度的差异。x轴表示研究组别，y轴表示相对浓度，比较的是入住ICU第1天的轻度ARDS患者（以红色表示）与中度ARDS患者（以绿色表示）。（D）在入住ICU第1天对轻度与中度ARDS患者进行生物标志物分析后，获得的可预测疾病严重程度的显著代谢物的曲线下面积（AUC）图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67319/67319fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>序号</td>
			<td>名称</td>
			<td>化学位移位置 (ppm)</td>
			<td>p 值</td>
			<td>VIP</td>
			<td>AUC 值</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>Lactate</td>
			<td>1.34</td>
			<td>0.04</td>
			<td>1.99</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>Isoleucine</td>
			<td>1.42</td>
			<td>0.03</td>
			<td>2.01</td>
			<td>0.875</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：比较ICU入院第1天轻度与中度ARDS患者后获得的显著代谢物列表。
由于结果以 ppm 值获得，我们通过查阅既往文献对代谢物进行指认，并利用分析软件对其进行验证。完成指认后，乳酸和异亮氨酸被确定为显著性代谢物，这些代谢物在既往一些急性呼吸窘迫综合征（ARDS）研究中也有报道30,40。我们确保选择分辨良好且无重叠的峰信号。鉴定完成后，我们依据方案中所述标准对显著性代谢物列表进行筛选。随后，通过打开谱图、搜索目标代谢物并将软件中的峰拟合至谱图中检测到的峰，利用分析软件模块对目标代谢物进行定量，从而获得以 mM 为单位的代谢物定量值。同时生成包含样本名称、代谢物名称及浓度的电子表格以供参考。在软件定量完成后，还可通过其他方法（如蛋白质组学）进行进一步验证。
此外，对鉴定出的代谢物进行深入分析，以确定其与疾病严重程度的相关性，并识别这些代谢物所参与的生化通路。由于在采用材料与方法部分所述标准后仅鉴定出两种具有显著意义的代谢物，因此无法通过软件进行通路分析。为此，通过系统性文献调研来揭示出现紊乱的代谢循环。本研究鉴定出的两种代谢物与急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的严重程度成功建立了相关性。乳酸水平升高提示肺部炎症及无氧呼吸，而异亮氨酸升高则表明与肺损伤、感染及能量代谢相关的蛋白质分解代谢40。理解这些代谢通路具有双重意义：一方面，它揭示了疾病的复杂性，有助于阐明其生物学机制；另一方面，它可通过指导临床医生针对患者制定个体化治疗方案，推动治疗进展，最终改善临床结局。

核磁共振（NMR）波谱法用于识别多种疾病患者中代谢物的异常调节。该技术可对异常代谢物进行定量分析，揭示其病理生理学机制。本文详细描述了基于核磁共振的患者代谢特征分析的逐步操作流程。

代谢组学正逐渐成为反映个体对病理生理状况应答的重要方法。核磁共振（NMR）...

我们的研究采用基于核磁共振（NMR）的代谢组学方法，鉴定在重症监护病房（ICU）危重患者中发生异常的代谢物及生化通路，并纳入了急性呼吸窘迫综合征（ARDS）患者，这是一种严重的肺部疾病。通过分析并比较代谢特征谱，我们旨在揭示与疾病进展相关的生化紊乱，并据此定制治疗方案以改善患者预后。实际上，我们正致力于填补对各类ARDS患者（包括轻度、中度和重度ARDS患者）代谢失调机制认知上的空白。为了加深对疾病及其进展的理解，最终通过提供精准医疗和个性化医疗来改善患者的治疗效果。核磁共振（NMR）技术具有样品制备简便的优点，可保持血清的完整性以供重新分析，并且无需化学衍生化即可检测已知和未知的代谢物。该技术可提供可重复的定量数据，确保代谢物测量结果的可靠性。与靶向方法不同，核磁共振（NMR）能够灵敏且无偏倚地探索代谢变化，非常适合用于发现疾病进展过程中的特征性标志物和通路。我们的研究发现将通过揭示在不同阶段中尚未被充分研究的代谢变化，推动急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的研究。利用基于核磁共振的代谢组学方法，我们旨在鉴定出异常的代谢物和代谢通路，从而为早期诊断、预后评估、更及时的预测及治疗提供潜在的生物标志物。该方法推进了个体化管理，并加深了对多状态代谢谱分析的认识。我们的研究结果为提出新的科学问题奠定了基础，例如：在ARDS不同阶段鉴定出的特定代谢物如何影响疾病的进展？这些失调的通路能否作为早期治疗干预的靶点？此外，这些代谢变化在其他呼吸系统或炎症性疾病中如何差异？首先，使用无菌针头，从诊断为轻度或中度急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的患者的动脉中采集两毫升血液。将血液转移至无菌小瓶中，并在室温下静置30分钟使其凝固。将凝固的血液在3,100 G条件下离心15分钟，以分离血清。将血清转移至无菌微量离心管中，每管分装400至500微升。用患者信息标记各管，并于-80摄氏度保存。进行核磁共振（NMR）实验时，将250微升血清等分试样与250微升磷酸盐生理盐水缓冲液混合，以最小化pH值变化。涡旋混合约15秒，确保均匀混合。将制备好的样品转移至洁净的NMR管中，NMR管内含同轴插入件，插入件中含有浓度为0.05毫摩尔的TSP。接下来，将核磁共振管放入磁体中。输入 WRPA 并选择适当的实验编号，以使用 CPMG 脉冲程序设置质子实验。点击“标题”选项，输入患者姓名及其他必要信息。输入锁定指令并按回车键以锁定磁场。然后，选择 90% 水和 10% 氘代氧化氘的选项。接着，输入 ATMM 并按回车键，以对探头进行调谐和匹配。接下来，从“采集参数”选项中选择参数，设置为在 128 次扫描中采集 64,000 个数据点以收集优化数据。设置弛豫延迟为 5 秒，谱扫描宽度为 12 PPM，回波时间为 200 微秒，重复 300 次。使用指数窗函数应用 0.3 赫兹的线宽展宽。接下来，使用核磁共振（NMR）处理与分析工具采集NMR谱图。获得最终谱图后，输入APK和ABSN分别进行相位校正和基线校正。然后，点击上方面板中的“校准轴”（Calibrate Axis）选项，将TSP峰校准至0 PPM，可选择自动或手动方式进行校准。最后，将NMR系统中获取的数据转移至工作站以进行进一步分析。在获取被诊断为轻度或中度ARDS患者的NMR谱图后，打开NMR代谢物定量软件进行数据处理。为使用Whitaker方法进行手动基线校正，请在NMR代谢物定量软件的处理器模块中打开谱图文件。选择基线校正，然后选择Whitaker方法。在整个光谱范围内，在峰的基部放置点。完成后，将经过基线校正的光谱文件保存到同一个文件夹中。接下来，使用 Profiler 模块进行光谱分箱，依次选择工具（Tools）、批量处理（Batch Process），然后选择光谱分箱（Spectral Binning）。为生成用于统计分析的最终分箱数据表，请选择包含所有基线校正后光谱文件的文件夹。将光谱划分为等宽的区间，每个区间的光谱宽度设定在每百万分之0.01至0.04之间。设置桶大小以及起始和终止的 PPM 值。选择一个文件夹以保存输出的分箱表格。排除对应于水和溶剂 TSP 的化学位移区域，以防止谱图干扰。最终的电子表格将在一行中显示样本名称，其他行则显示对应 PPM 的区段值。在进行统计分析之前，需使用某种归一化方法、对数转换和帕累托缩放对数据进行标准化。对于多变量分析，应进行主成分分析、偏最小二乘判别分析以及正交偏最小二乘判别分析，以观察组间的差异，并获得每个对代谢谱差异有贡献的代谢物的投影变量重要性得分。采用学生t检验（Student's t-test）筛选显著性代谢物，p值阈值设为小于0.05。t检验生成箱须图，用于展示代谢物浓度的差异。随后进行生物标志物分析，绘制受试者工作特征曲线下面积（ROC曲线下面积）图。根据投影变量重要性得分大于1、经Bonferroni校正后的p值小于0.05，以及曲线下面积大于0.8的标准，筛选出显著性代谢物的最终列表。利用人类代谢组数据库（Human Metabolome Database）鉴定对应特定PPM值的代谢物。在开始定量分析之前，使用处理器模块对本研究选定的参考化合物进行校准。单击“校准化学位移指示器”选项，并输入参考化合物的浓度。将软件峰拖动至谱图参考峰位置，并调整其高度和宽度。当谱图参考峰与软件峰对齐后，单击“接受”。接下来，在 Profiler 模块中打开所需谱图，并选择适合研究的化合物库。屏幕底部将显示代谢物列表。从列表中选择感兴趣的代谢物。单击屏幕角落处的 PPM 数值。将谱图缩放至目标代谢物的特定 PPM 范围。此时屏幕上会出现两个峰，其中一个表示记录的数据，另一个以虚线显示，代表软件模拟的峰。拖动软件峰，使其与记录的峰对齐，并调整峰的高度和位置以匹配。当峰正确对齐后，从“浓度（毫摩尔）”标题下显示的数值读取代谢物的浓度。要生成输出文件，请在“工具”菜单下点击“批处理操作”选项，并指定用于保存输出文件的目标文件夹。主成分分析显示轻度与中度急性呼吸窘迫综合征（ARDS）患者组之间存在明显的聚类分离。正交偏最小二乘判别分析揭示了轻度与中度ARDS组之间的清晰区分，突出了代谢差异。t检验与生物标志物分析揭示了轻度与中度ARDS之间关键的失调代谢物。乳酸和异亮氨酸被确定为与急性呼吸窘迫综合征（ARDS）严重程度显著相关的代谢失调代谢物。

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科研

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Biology

生物学

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