Name: 使用 2D-TAU 凝胶电泳揭示组蛋白蛋白形式 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: 学习使用二维TAU凝胶电泳技术表征组蛋白蛋白形式，探索表观遗传变化与代谢重编程的关联。该方法有助于识别新型表观遗传治疗靶点，为癌症治疗策略开发提供重要依据。

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本工作由PRIN2022资助，DS、CF和AC由PRIN2022资助，MLC由分子肿瘤学博士项目（UMG博士项目学院）资助。本工作还得到了PNRR INSIDE项目（CUP：B83C22003920001）的资助。

1. 组蛋白提取
<ol>
	<li>从至少 1 × 106 个汇合度为 80% 的细胞中提取组蛋白。本实验使用了来自 ATCC 的 MCF-10A 细胞系。接种后，用 1 mL 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞三次。所有操作均需在冰上进行。</li>
	<li>配制细胞裂解缓冲液，包含 10 mM Tris-HCl（pH 8.0）、1 mM KCl 和 1.5 mM MgCl2。使用前加入 1 mM 二硫赤藓醇以及蛋白酶和磷酸酶抑制剂。</li>
	<li>向含细胞的培养皿中加入 800 µL 细胞裂解缓冲液，刮取细胞并收集至 1.5 mL 离心管中，然后在 4 °C、300 rpm 条件下于旋转仪上孵育 1 小时。</li>
	<li>在预冷的微型离心机（适用于 1.5 mL 离心管）中，于 4 °C、10,000 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>用 400 µL 细胞裂解缓冲液洗涤沉淀，于 4 °C、10,000 × g 离心 10 分钟，弃去上清液。重复洗涤步骤 3 次。 
	注意：所有步骤均应使用预冷至 4 °C 并配有适用于 1.5 mL 离心管旋转装置的微型离心机。操作沉淀时需小心，避免样品损失。</li>
	<li>将沉淀重悬于 640 µL 0.2 M H2SO4 中，在 4 °C、300 rpm 条件下于旋转仪上孵育 16 小时。 
	警告：硫酸为危险化学品，请在通风橱中操作。</li>
	<li>于 4 °C、16,000 × g 离心 10 分钟，将上清液转移至新离心管中并保存以用于后续步骤，弃去核碎片。</li>
	<li>逐滴加入 212 µL 三氯乙酸（TCA）以沉淀组蛋白（最终 TCA 浓度为 33%）。通过翻转离心管 10 次混匀溶液。在冰上避光孵育 16 小时。 
	警告：TCA 为危险化学品，请在通风橱中操作。</li>
	<li>在预冷离心机中于 4 °C、16,000 × g 离心 10 分钟以收集组蛋白沉淀。小心弃去上清液，并用 200 µL 冷丙酮洗涤沉淀 3 次。</li>
	<li>用冷丙酮重悬沉淀，然后以高功率超声处理 2 次，每次 3 个循环（开 30 秒，关 30 秒），两次之间在冰上暂停 10 分钟。 
	注意：本步骤使用超声破碎仪完成。此步骤对于去除组蛋白结合的 DNA 至关重要。</li>
	<li>于 16,000 × g 离心 10 分钟，弃去丙酮，将样品重悬于 100 µL 双蒸水中。根据制造商说明书，采用 Bradford 法测定蛋白浓度33。 
	注意：离心后沉淀有时呈白色或半透明状。若出现白色不透明沉淀，可能提示存在盐类污染物，可能影响二维分离效果。若出现此情况，应重复丙酮洗涤步骤，直至沉淀变为透明。</li>
	<li>根据制造商说明书，对 70 µg 组蛋白进行冻干处理。将冻干机设定为 30 °C，持续 60 分钟。检查管内体积，并在 30 °C 下重复该步骤，直至样品完全冻干（通常需要 90 分钟）。60 分钟后，每 10 分钟检查一次体积，因为该过程依赖于样品特性。 
	注意：若组蛋白蛋白量较低，建议从 2 × 106 个细胞开始提取。在此情况下，仍使用与 1 × 106 个细胞相同的试剂体积。请检查实验过程中所用所有化学品的纯度，所有试剂均须为 HPLC 级。</li>
</ol>
2. 微型二维凝胶Triton-酸-尿素（TAU）电泳
<ol>
	<li>按照以下说明为小型TAU垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳系统制备小型TAU凝胶。
	<ol>
		<li>制备分离胶：6 M 尿素、15% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺（29:1）、5% 冰醋酸、0.25% Triton X-100（v/v）、0.4% TEMED（v/v）、0.1% APS（p/v）。配制溶液时，将尿素溶于丙烯酰胺/双丙烯酰胺和1 mL超纯水中，在室温下轻轻搅拌；加入其他组分并定容。制备小型TAU凝胶时，配制10 mL溶液。将溶液倒入预设的凝胶板中，距顶部约1.5 cm处停止，避免产生气泡。在溶液上覆盖1 mL异丙醇，使凝胶表面平整。</li>
		<li>制备浓缩胶：6 M 尿素、6% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺（29:1）、5% 冰醋酸、0.25% Triton X-100（v/v）、0.4% TEMED（v/v）、0.1% APS（p/v）。配制溶液时，将尿素溶于丙烯酰胺/双丙烯酰胺和1 mL超纯水中；加入其他组分并定容。用浓缩胶溶液填充凝胶板，在两板之间插入10孔梳子，并插入至凝胶溶液达到梳齿一半高度处。于4 °C下聚合16小时。
		 
		注：请小心插入梳子，以确保加样孔规则形成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过溶解6 M 尿素、5% 冰醋酸和双蒸水，配制100 µL TAU样品缓冲液。将冻干样品溶解于30 µL TAU样品缓冲液中。</li>
	<li>用TAU电泳缓冲液（终浓度为5%乙酸）填充小型凝胶盒。用装有电泳缓冲液的注射器冲洗TAU凝胶的加样孔，并使用微量移液器将样品加入加样孔中。</li>
	<li>将电泳槽连接至电源，正极（红色）置于底部。注意，当等电点IP &#62; pH时，蛋白质带正电，因此迁移方向为从正极向负极。先以30 V电压运行70分钟，然后以恒定电压25 V继续运行17小时。
	 
	注：在此期间，可偶尔关闭电源，使用一次性注射器冲洗凝胶加样孔。注意用注射器清除凝胶底面的气泡，以避免样品损失及蛋白条带拖尾现象。</li>
	<li>从凝胶板中取出凝胶，用洁净的手术刀切下目标条带。小心操作凝胶以避免断裂。由于目标条带无色，建议将样品加在第1号加样孔中，以便准确识别并切割目标泳道。
	 
	注：为检测小型TAU凝胶的分离效果，可将样品重复制备并平行电泳。其中一块凝胶可用考马斯亮蓝染色。分离图谱见图1A。</li>
	<li>用15 mL 0.5 M Tris-HCl（pH 8.8）洗涤目标条带15分钟。</li>
	<li>使用6 M 尿素、0.5 M Tris-HCl（pH 6.8）、30% 甘油、20% SDS和2% 二硫苏糖醇配制15 mL 平衡缓冲液1。使用6 M 尿素、0.5 M Tris-HCl（pH 6.8）、30% 甘油、20% SDS和2% 碘乙酰胺配制15 mL 平衡缓冲液2。平衡缓冲液1和2应在使用前新鲜配制；平衡缓冲液2需避光保存。</li>
	<li>将凝胶条带置于10 mL 平衡缓冲液1中，在轻微振荡下孵育15分钟，然后倾去液体。再将凝胶条带置于10 mL 平衡缓冲液2中，在避光条件下轻微振荡孵育15分钟，然后倾去液体。</li>
	<li>参照表1配制分离用15% SDS丙烯酰胺凝胶。安装凝胶板并倒入分离胶溶液，加至长玻璃板末端前1.5 cm处。在表面加入1 mL异丙醇以平整凝胶表面，并使其聚合。</li>
	<li>凝胶聚合完成后，倾去异丙醇，并用3MM Chr纤维素层析纸吸干加样孔。将第8步所得条带插入凝胶加样孔中。</li>
	<li>用含0.5%低熔点琼脂糖的封胶液（溶于1x Tris/甘氨酸/SDS缓冲液）并加入5 µL 0.003% 溴酚蓝，将条带与分离胶密封。室温下静置30分钟，使琼脂糖凝胶聚合。
	 
	注：琼脂糖封胶过程中应避免产生气泡，以防造成条带拖尾。</li>
	<li>将凝胶板放入凝胶盒中，并加入1x Tris/甘氨酸/SDS缓冲液。以120 V电压电泳，直至溴酚蓝染料迁移至凝胶底部。小心从板中取出凝胶，去除多余的琼脂糖，然后采用适用于质谱分析的银染方法染色，或用于免疫印迹检测。</li>
</ol>
3. 银染法 32
<ol>
	<li>准备以下试剂——固定液：50% 甲醇，5% 乙酸，45% 去离子水；洗涤液：50% 甲醇，50% 去离子水；敏化剂：0.02% Na2S2O3·5H2O 溶于去离子水中；银染试剂：0.1% 硝酸银溶于冷（4°C）去离子水中；显色液：0.04% 甲醛和 2% Na2CO3，使用前加入甲醛（37%）0.4 mL 去离子水，并定容至 1000 mL；终止液：5% 乙酸；凝胶保存液：1% 乙酸。 
	注意：由于染色所用化学品具有危害性，所有操作均需在通风橱内进行。</li>
	<li>按照表 2中的流程进行操作，并注意以下事项。所有孵育步骤均需在温和振荡条件下进行。在开始显色步骤前预先准备好终止液，以确保凝胶显色强度适中。显色过程中，条带将首先呈现黄色信号，并在孵育结束时逐渐变为浅棕色。不同条带的显色强度取决于组蛋白蛋白变体的含量。此时凝胶已准备好进行条带切取及胶内酶解（图 1B）。</li>
</ol>
4. 胶内消化
<ol>
	<li>配制以下溶液：50 mM 碳酸氢铵（NH₄HCO₃）4HCO₃)/50% (v/v) 乙腈；10 mM 二硫苏糖醇（DTT）溶于 50 mM NH4HCO3；50 mM NH₄HCO₃ 中含有 55 mM 碘乙酰胺（IAA）4HCO3；0.1% 三氟乙酸；50 mM NH₄HCO₃4HCO3，pH 8；HPLC级乙腈；1 mL硅胶管。 
	注意：为避免来自头发或皮肤的人源角蛋白污染，请佩戴洁净手套并在洁净区域操作。</li>
	<li>使用洁净的手术刀从染色后的凝胶中切下目标组蛋白条带，放入新的硅化管（1.5 mL）中。注意仅切取单一蛋白条带并置于单独的管中，以避免不同亚型之间的交叉污染。</li>
	<li>向每个胶点加入 250 µL 的 50 mM NH4HCO3/50% 乙腈，于室温下在恒温混匀仪中轻柔振荡孵育。倾去溶液，重复此步骤 3 次。凝胶碎块将变为透明。</li>
	<li>加入乙腈（200 µL）使凝胶斑点脱水。此时凝胶条块将呈现不透明的白色。</li>
	<li>倾去乙腈，室温晾干10分钟。凝胶块在离心管中将呈现干燥状态。由于组蛋白在平衡步骤中已完成还原和烷基化，因此还原和烷基化步骤并非必需。</li>
	<li>在20 µL胰蛋白酶溶液（0.1 mM HCl）中重悬凝胶点，或加入足量溶液以完全覆盖凝胶碎块。将离心管置于温控振荡仪中，在37 °C下轻柔振荡孵育，时间不少于4小时，最长可达16小时。</li>
	<li>将含有胰蛋白酶肽的上清液转移至新离心管中。向凝胶碎块中加入50 µL提取液（60%乙腈，1%三氟乙酸），在4 °C下于超声水浴中超声处理2次，每次10分钟。</li>
	<li>将含有额外胰蛋白酶肽的上清液转移至新离心管中。使用冷冻干燥机干燥合并的提取肽溶液。将冷冻干燥机温度设为30 °C，干燥溶液，直至管内形成冻干肽沉淀。 
	注意：此步骤与体积相关；通常1小时已足够，但需每10分钟检查一次体积，直至样品完全干燥。</li>
	<li>向每管中加入15 µL 0.1% TFA，在25 °C下于恒温混匀仪中轻轻孵育。将上清液转移至小瓶中，用于LC-MS/MS分析。</li>
</ol>
5. 2DTAU 蛋白质印迹
<ol>
	<li>使用双蒸水配制转膜缓冲液：250 mM Tris 碱，92 mM 甘氨酸，10% 甲醇。</li>
	<li>将硝酸纤维素膜和滤纸裁剪至与凝胶相同尺寸。</li>
	<li>将凝胶平衡，并将膜、滤纸浸泡于转膜缓冲液中 15 分钟。可使用硝酸纤维素膜或 PVDF 膜。若使用 PVDF（聚偏二氟乙烯）膜，需先用 100% 甲醇浸泡进行活化。</li>
	<li>按以下顺序在夹心盒中制备凝胶转膜夹心结构，用于半干转：负极/滤纸/凝胶/硝酸纤维素膜/滤纸/正极。确保凝胶与膜之间无气泡，以保证良好的转膜效果。</li>
	<li>将夹心盒放入半干转装置中，以 25 V 电压运行 30 分钟。结束后拆开转膜夹心结构，将膜取出用于后续免疫检测。使用丽春红染色检测转膜效率，并在膜的右上角做标记以保持正确的方向。</li>
	<li>根据实验需要孵育一抗和二抗（图 2）。</li>
</ol>

2D Gel Separation for Histone Isoform Enrichment and PTM Characterization

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</ol>

作者声明无利益冲突。

在过去十年中，通过识别驱动癌症发生和发展的多种分子改变，癌症患者的治疗得到了彻底革新。现代肿瘤学最重要的进展是基于全面分子分析的疗法的建立。基因组学和蛋白质组学的技术进步在特异性生物标志物的谱型分析中发挥了关键作用，可用于早期检测、监测、预后评估以及药物疗效监控。蛋白质组学被定义为在特定条件下对细胞、组织或生物体全部蛋白质组分的分析，同时也包括对蛋白质相互作用、翻译后修饰及定位的研究34。蛋白质组学的一个特定领域是表观蛋白质组学（epi-proteomics），其涉及组蛋白翻译后修饰的系统性研究。这些修饰已被证实与癌症的发生和发展相关35。本文介绍了一种用于鉴定影响细胞表型的特异性组蛋白异构体的方法。
该方法的关键步骤是组蛋白的提取，因为组蛋白溶解度低且碱性较强。其主要局限性在于二维图谱的复杂性以及组蛋白变体数量较少，这可能会使串联质谱（MS/MS）分析变得困难。
总体而言，该方法的主要优势在于其可在任何实验室中实施，且配备适当的防护措施后，可拥有小型凝胶电泳装置。在此背景下，我们相信该方法将有助于大量科研人员，例如那些无法在其所属机构使用大型设施的研究者，用于鉴定新的表观遗传标记物，以增进对表观蛋白质组的认识。此外，该方法可与质谱技术联用，而质谱服务可外包获取，从而发现新的蛋白质变体形式。该方法也可与免疫学检测联合使用，以验证特定翻译后修饰的变化情况，前提是存在相应的商用抗体。
该方法已被用于研究与乳腺癌发展相关的组蛋白修饰的典型变化28，并用于检测小鼠胚胎干细胞中H1的修饰情况36。此外，该方法还成功用于测量快速增殖的成纤维细胞中组蛋白羰基化水平37，并探索新的组蛋白修饰形式，如组蛋白糖基化和组蛋白MAR化修饰38。
从我们的角度来看，我们确信该方法可成功用于分析新型组蛋白翻译后修饰，特别是那些与特定代谢通路异常激活相关的修饰，例如乙酰化、丙二酰化、甲基化、脂化、乳酸化、丁酰化等。最终，该方法还可作为微量化制备工具，用于分离单个蛋白质变体，并有助于分析与代谢相关的翻译后修饰，从而加深我们对该关键研究领域的理解。

癌症的发生、发展和化疗耐药性与遗传和表观遗传事件相关，包括组蛋白翻译后修饰。组蛋白经历多种翻译后修饰，这些修饰调控染色质动态并决定细胞命运1。
核小体是染色质的功能单位，是由DNA和蛋白质组成的分子复合物，可将DNA包装到细胞核内。它由四对组蛋白（H3、H4、H2A和H2B）构成核小体核心，还包括连接组蛋白H1，后者有助于稳定染色质结构。组蛋白的氨基（N）末端尾部从其球状核心区域伸出，并发生特定的翻译后修饰，从而影响染色质的结构状态2。
迄今为止，已知的组蛋白翻译后修饰（PTMs）至少有23类。这些PTMs主要是共价修饰，主要包括甲基化、乙酰化、磷酸化、糖基化、泛素化、SUMO化以及ADP-核糖基化3。此外，最近有研究提出表观基因组稳态与代谢重编程之间存在紧密关联，这解释了组蛋白PTMs可能种类数量呈指数增长的原因4,5,6,7,8,9,10,11,12,13。组蛋白PTMs由修饰酶进行添加、去除和识别，这些酶分别被称为“书写器”（writers）、“擦除器”（erasers）和“阅读器”（readers）。它们可影响染色质结构的物理和化学性质，进而调控基因表达谱，包括抑癌基因和癌基因的表达14,15,16。
当组蛋白变体整合到核小体中时，组蛋白蛋白形式的数量会增加。这些变体是经典组蛋白的非等位异构体，通过改变染色质的化学和物理特性而增加其复杂性。与经典组蛋白相比，组蛋白变体具有功能结构域，可发生独特的翻译后修饰或与特定的染色质组分相互作用，从而影响核小体的动力学和稳定性17。
在癌细胞中，组蛋白翻译后修饰（PTMs）和组蛋白变体的失调会影响基因表达谱，导致细胞异常增殖、侵袭、转移以及药物耐药通路的激活3,18,19,20。组蛋白或染色质重塑复合物的突变可改变细胞表型，促进肿瘤发生转化。表观遗传学改变（如组蛋白甲基化）的累积是激活药物耐药通路的关键因素之一21,22,23。SWI/SNF复合物由29个基因编码的15个亚基组成，该复合物的突变影响超过20%的人类癌症，涉及多种肿瘤类型。在过去十年中，基于表观遗传的药物策略（epi-drugs）已得到发展，许多靶向组蛋白修饰异常模式癌症的药物已获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准23。
组蛋白的分析具有相当大的挑战性，使其成为一个研究难度较高的领域。近年来，质谱技术已成为表征和研究组蛋白蛋白异构体的首选方法。然而，剧烈的提取条件，加之某些变体溶解度较低以及序列同源性极高，使得其分析过程仍面临诸多困难。
在过去十年中，已开发出多种基于质谱的技术用于组蛋白分析与研究24,25,26,27。在本研究中，我们提出了一种经济高效且可靠的方法，用于构建组蛋白蛋白异构体的二维图谱，该方法可提高发现新的翻译后修饰的可能性。
二维TAU电泳结合了酸性条件下的分离与SDS-PAGE。在第一维中，介质的酸性环境使碱性蛋白质带上净正电荷。由于组蛋白是强碱性蛋白质，其等电点（pH）高于介质的pH值，因此带正电荷，并在电场作用下发生迁移。在第二维中，组蛋白被SDS变性，并根据其分子量进行分离。所得的二维图谱可用于在单一位点分辨率下富集特定的蛋白质变体，进而用于质谱分析和免疫学研究28,29。电泳完成后，二维TAU斑点可进行脱色、胰蛋白酶消化，并通过质谱分析。或者，可将二维TAU图谱转印至硝酸纤维素膜或PVDF膜上，通过免疫染色进行检测27。
在此背景下，这些方法可能有助于改进与代谢重编程相关的新颖翻译后修饰的鉴定与分析30,31。
我们通过引入超声处理步骤进一步优化了原始方法，该步骤有助于降解DNA并提高蛋白质的溶解性。此外，我们延长了组蛋白提取过程中的孵育时间，以获得高纯度的蛋白质样品。同时，在本方案中，我们在第一维电泳中采用较低电压并延长运行时间，以实现更佳的分离分辨率。所得凝胶可用于研究经典组蛋白翻译后修饰，并表征如糖化等新型修饰10,32。
总体而言，我们建立了一种提取和纯化组蛋白的方法，并通过二维图谱对组蛋白蛋白异构体进行分离。本工作还包括用于质谱分析的凝胶内消化步骤，以及二维蛋白质印迹分析的操作流程。

<table><tbody><tr><td>1,4-二硫苏糖醇</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>D8255&amp;nbsp;</td><td>用于维持的试剂 &amp;minus;还原态的SH基团；可定量还原二硫键。</td></tr><tr><td>1.5 M Tris-HCl 缓冲液，pH 8.8</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0798</td><td>分离胶缓冲液</td></tr><tr><td>10x Tris/甘氨酸/SDS&amp;nbsp;</td><td>BIO-RAD&amp;nbsp;</td><td>1610772</td><td>使用这种预混的10倍浓度Tris/甘氨酸/SDS电泳缓冲液，通过SDS-PAGE分离蛋白质样品。</td></tr><tr><td>2-丙醇</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>33539</td><td>2-丙醇（异丙醇）是一种仲醇。它已被测试作为多种燃料电池中的燃料替代品。氧化铜（CuO）粉末溶于2-丙醇中，用于激光烧蚀辅助合成铜胶体。将2-丙醇与硝酸锌（Zn(NO3)2）形成悬浮液，用于制备表面均匀涂覆P25-TiO2层的二氧化钛包覆不锈钢（P25-TiO2/SS）光阳极。该光阳极被应用于电化学光催化（ECPC）降解过程。</td></tr><tr><td>30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液&amp;nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>1610158</td><td>2.6% 交联剂。电泳纯度试剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Carlo Erba Reagennts</td><td>401392</td><td>乙酸是一种重要的化学试剂，具有广泛的工业应用。</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Panreac Applichem</td><td>211007.1214</td><td>丙酮&amp;nbsp;是一种溶剂，因其在各种实验室、制造和清洁应用中的多功能性而闻名。</td></tr><tr><td>乙腈</td><td>VWR</td><td>83640320</td><td>用于高效液相色谱&amp;nbsp;&amp;nbsp; LC-MS级</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td>琼脂糖&amp;nbsp;是一个&amp;nbsp;杂多糖&amp;nbsp; 分子生物学中常用。</td></tr><tr><td>碳酸氢铵</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A6141</td><td>最低 99.0%</td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A3678</td><td>分子生物学用，电泳用 &amp;ge;98%&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Bioruptor plus</td><td>Diagenode</td><td>B01020001 - B01020002 - B01020003</td><td>超声波破碎仪</td></tr><tr><td>二硫苏糖醇</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>D9163-5G</td><td>用于还原蛋白质中二硫键的还原剂。</td></tr><tr><td>十二面体银染试剂盒&amp;nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0480</td><td>十二面体银染试剂盒易于使用，可用于检测聚丙烯酰胺凝胶中纳克水平的蛋白质。</td></tr><tr><td>甘油</td><td>GE - 医疗生命科学</td><td>171325010L</td><td>甘油是一种简单的三元醇化合物，可用于辅助制备梯度凝胶、作为蛋白质稳定剂以及储存缓冲液的组分。</td></tr><tr><td>停止磷酸酶抑制剂&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>78428</td><td>Thermo Scientific Halt 磷酸酶抑制剂混合物在细胞裂解或组织蛋白提取过程中及之后维持蛋白质的磷酸化状态&amp;nbsp; 单次使用混合液（100倍浓缩）&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>78430</td><td>Thermo Scientific Halt 蛋白酶抑制剂混合液（100X）是即用型浓缩储存液，用于添加至样品中，防止细胞裂解和蛋白质提取过程中发生蛋白水解降解。单次使用型混合液（100X）。&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H1758</td><td>分子生物学用生化试剂</td></tr><tr><td>碘乙酰胺</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I6125</td><td>&amp;ge;99%（核磁共振），结晶状</td></tr><tr><td>KCl</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P9541</td><td>氯化钾，KCl，是&amp;nbsp;通常用于实验室常规操作。它作为pH电极的储存缓冲液以及电导率测量的参比溶液已有广泛应用。</td></tr><tr><td>MCF10细胞系</td><td>atcc</td><td>CRL-10317&amp;nbsp;</td><td>1984年从一名36岁白人女性的乳腺组织中分离得到的上皮细胞系，该女性患有乳腺纤维囊性病变。此细胞系由密歇根癌症基金会保存并提交。</td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>208337</td><td>氯化镁是一种无色结晶固体。</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-四甲基乙二胺</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T9281</td><td>用于电泳，约99%</td></tr><tr><td>1×磷酸盐缓冲液</td><td>康宁</td><td>15373631</td><td>1 × PBS（磷酸盐缓冲盐水）是&amp;nbsp;缓冲的&amp;nbsp;平衡盐溶液&amp;nbsp;用于多种生物学和细胞培养应用，例如在细胞解离前洗涤细胞、运输细胞或组织、稀释细胞用于计数以及配制试剂。</td></tr><tr><td>六氰合铁(II)酸钾</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>60299</td><td>电子受体，用于涉及电子传递的系统中</td></tr><tr><td>20% (w/v) SDS 溶液&amp;nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0418</td><td>十二烷基硫酸钠。电泳纯试剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>硫代硫酸钠，ReagentPlus，99%</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>21,726-3</td><td>硫代硫酸钠，ReagentPlus，99%</td></tr><tr><td>硫酸</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>339741</td><td>硫酸，试剂级&amp;nbsp;一种极具腐蚀性的酸，呈微黄色略带黏性的液体，可溶于水，为二元酸。具有极强的腐蚀性、脱水性、氧化性，并具吸湿性。</td></tr><tr><td>三氯乙酸</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T6399-5G</td><td>三氯乙酸（TCA）是&amp;nbsp;用作蛋白质沉淀的试剂&lt;sup&gt;1,2&lt;/sup&gt; 和核酸&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>Riedel-de Ha&amp;euml;n</td><td>34957</td><td>三氟乙酸</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T9284-1L</td><td>Triton X-100 是一种非离子型聚氧乙烯表面活性剂，最常用于蛋白质的提取和溶解。</td></tr><tr><td>猪胰蛋白酶</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T6567</td><td>蛋白质组学级，生物试剂，二甲基化</td></tr><tr><td>尿素</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>33247</td><td>尿素是一种变性剂，可用于蛋白质变性。它会破坏蛋白质二级、三级和四级结构中的氢键。它也可破坏DNA二级结构中存在的氢键。</td></tr></tbody></table>

利用二维-毛细管等电聚焦/十二烷基硫酸钠凝胶电泳揭示组蛋白蛋白异构体

Unveiling Histone Proteoforms using 2D-TAU Gel Electrophoresis

组蛋白经历多种翻译后修饰（PTMs），如甲基化、乙酰化、磷酸化、酰基化和泛素化，这些修饰调控核小体的动态变化并决定细胞命运。核小体是染色质的功能单位，由DNA、构成球状核心的四对组蛋白（H3、H4、H2A和H2B）以及稳定染色质结构的连接组蛋白H1组成。组蛋白的氨基（N）端尾部从球状核心区域突出，并经历不同的PTMs，从而影响染色质的结构状态。一些证据表明，组蛋白PTM的稳态对于维持所有生理活动至关重要。组蛋白PTMs的失调是导致细胞异常增殖、侵袭和转移的主要原因。因此，开发用于表征组蛋白PTMs的方法至关重要。本文介绍了一种有效分离和分析组蛋白亚型的技术。该方法基于两种正交分离方式的结合，可实现组蛋白亚型的富集，并随后进行质谱鉴定。该技术最初由Shechter等人描述，结合了酸-尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳（TAU-GEL）和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：前者可根据大小和电荷分离碱性组蛋白蛋白，后者可根据分子量分离蛋白质。结果得到一张组蛋白亚型的二维图谱，适用于胶内消化后进行质谱鉴定和Western印迹分析。这种蛋白质组学方法是一种稳健的技术，能够富集单一组蛋白亚型，并用于鉴定新的组蛋白PTMs。

在图1A中，可以观察到组蛋白在1D凝胶中的迁移情况。这是理解第一维电泳运行时间的重要初步步骤。确定合适的分离时间后，进行第二维电泳。组蛋白蛋白变体的二维图谱呈现出独特的拓扑模式（图1B）。图1B中的每个斑点代表一种特定的组蛋白类型。观察每种组蛋白变体在凝胶上的确切位置。每种组蛋白变体的质谱鉴定结果已在Perri等人的研究中报道32。因此，该条件下每个斑点均对应一种特定的组蛋白类型。除经典斑点外，若出现额外斑点，可能提示存在新的修饰形式。凝胶图像可通过密度测定法获取，并使用图像分析软件对所得图像进行分析。
2D TAU 图谱的可靠性取决于蛋白点的圆整度。若电泳操作正确，蛋白点应呈现为清晰的信号，且凝胶中不应出现水平或垂直的拖尾现象。相反，样品、溶液或琼脂糖覆盖层中的杂质可能导致凝胶中出现条纹或条带。凝胶的质量将影响图像的数字化以及后续的定性和定量分析，还可能影响 Western Blot 分析和质谱（MS）检测的成功率。为验证该方法的可靠性，我们使用乙酰化赖氨酸一抗（Acetylated-Lysine (Ac-K2-100) Rabbit mAb32）对已分离的组蛋白蛋白异构体的硝酸纤维素膜进行探针检测（图2）。采用抗兔 HRP 二抗检测组蛋白信号。正如预期，利用密度计可对印迹中每种组蛋白变体所特有的翻译后修饰进行定量分析。
<img alt="蛋白质电泳结果；凝胶图谱；Triton-酸性尿素、SDS、组蛋白分离" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67321/67321fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：一维和二维 TAU 凝胶电泳图谱。（A）采用一维 TAU 凝胶获得的组蛋白拓扑图谱代表性图像。（B）采用二维 TAU 凝胶获得的组蛋白拓扑图谱代表性图像。数据鉴定信息引自 Perri 等人32。如预期所示，每个斑点代表一种特定的组蛋白蛋白异构体。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67321/67321fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="通过二维凝胶电泳分离蛋白质；Triton-酸-尿素与SDS两个维度的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67321/67321fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2：代表性二维Triton-酸-尿素（2DTAU）Western印迹结果。从图中可观察到每种组蛋白蛋白变体的赖氨酸乙酰化水平。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67321/67321fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>浓度：15%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis</td>
			<td>3.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 M Tris pH 8.8</td>
			<td>2.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water</td>
			<td>3.6 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% SDS</td>
			<td>100 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% APS</td>
			<td>50 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>5 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：分离胶溶液的组成。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>步骤</td>
			<td>时间</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>固定液（50% 甲醇 / 5% 乙酸）</td>
			<td>1 h</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% 乙醇洗涤</td>
			<td>2 × 20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>去离子水洗涤</td>
			<td>1 × 20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>敏化剂 硫代硫酸盐试剂</td>
			<td>1 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>去离子水洗涤</td>
			<td>3 × 20 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>银染 硝酸银</td>
			<td>30 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>去离子水洗涤</td>
			<td>3 × 1 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>显影 显影剂</td>
			<td>25–30 min 注：显影至条带可见（浅棕色）为止</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>终止液</td>
			<td>1 × 10 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>去离子水洗涤</td>
			<td>2 × 5 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>去离子水洗涤</td>
			<td>1 h</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：银染法。

本方法描述了一种简单且快速的组蛋白蛋白异构体表征与研究策略。

组蛋白经历多种翻译后修饰（PTMs），例如甲基化、乙酰化、磷酸化、酰化和泛素化，这些修饰……

目前，我们的研究重点是进一步表征表观遗传学改变与代谢重编程之间的现有相关性，最终目标是鉴定出新的表观遗传治疗靶点。鉴于表观遗传修饰具有动态性和可逆性，近年来已开发出多种表观遗传药物（epi-drug），显著改善了癌症治疗效果并降低了化疗耐药性。近年来，在个体特征分析领域取得了重要进展，这得益于现代质谱技术与分离技术（如top page或高效液相色谱）的结合应用。组蛋白表征的主要挑战在于存在无数种组蛋白蛋白异构体，这些异构体源于动态修饰酶与代谢物可及性之间的相互作用。首先，为小型垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳系统制备小型TAU凝胶。具体操作为：在室温下轻轻搅拌，将六摩尔尿素溶解于含有15%丙烯酰胺-双丙烯酰胺和一毫升超纯水的溶液中。然后加入其他组分并定容。将此溶液倒入预置的凝胶板中，确保无气泡产生，并在顶部留出1.5厘米空间。在上层加入1毫升异丙醇以使凝胶表面平整。制备浓缩胶溶解液时，将尿素溶解于含有6%丙烯酰胺和双丙烯酰胺的溶液中，并加入一毫升超纯水。加入其他组分后，用该溶液填充胶板，并在两块胶板之间插入一个10孔梳子，使溶液上升至梳齿的一半高度。随后，溶解6摩尔尿素、5%冰醋酸和双蒸水，以制备100微升TAU上样缓冲液。然后将冻干的组蛋白样品溶解于30微升TAU样品缓冲液中。用终浓度为5%乙酸的TAU电泳缓冲液填充微型胶盒。使用注射器用运行缓冲液冲洗凝胶孔，再用微量移液器将样品加入孔中。然后将电泳槽连接至电源，将正极置于下方。偶尔关闭电源，用注射器冲洗凝胶加样孔，以去除凝胶底面的气泡。从凝胶板上取下凝胶后，使用洁净的手术刀切下目标泳道。现在用 15 毫升 0.5 M 盐酸三羟甲基氨基甲烷（Tris-HCl），pH 8.8，洗涤凝胶泳道 15 分钟。使用此处所示组分配制 15 毫升平衡缓冲液一和平衡缓冲液二。然后将平衡缓冲液二避光保存。现在，将凝胶条带放入 10 毫升平衡缓冲液一中，在温和振荡条件下孵育 15 分钟，然后倾去缓冲液。接着，将凝胶条带放入 10 毫升平衡缓冲液二中，在避光条件下温和振荡孵育 15 分钟，之后倾去缓冲液。接下来，按照此处所示的组分配制 15% 丙烯酰胺分离胶。安装凝胶板，并加入分离胶溶液，留出长玻璃板末端1.5厘米的空间。在胶上方加入1毫升异丙醇以平整胶面，静置使其聚合。待凝胶聚合完成后，倾去异丙醇，并用3毫米厚的纤维素层析滤纸吸干加样孔。用镊子将切下的凝胶条带插入分离胶孔中，避免产生气泡，然后使用含有5微升0.003%溴酚蓝的0.5%低熔点琼脂糖溶于Tris-甘氨酸-SDS缓冲液中，将凝胶条带与分离胶密封。将凝胶板放入电泳槽中，并加入Tris-甘氨酸-SDS缓冲液。在120伏电压下电泳，直至溴酚蓝染料迁移至凝胶底部。电泳结束后，轻轻将凝胶从玻璃板上取下，并弃去多余的琼脂糖。首先，对组蛋白样品进行微型二维凝胶三丁基氧化胺-酸性尿素（TAU）电泳，随后进行银染。然后配制此处所示的试剂。使用洁净的手术刀从染色后的凝胶中切下目标组蛋白条带，将每块凝胶条带分别放入新的1.5毫升硅化管中，以避免亚型间的交叉污染。向每块凝胶中加入250 µL 50 mM碳酸铵溶液或50%丙酮硝酸溶液，在室温下置于温控振荡仪中轻柔振荡孵育。倾去溶液，重复此步骤三次，直至凝胶碎片变得透明为止。为了使凝胶斑点脱水，加入 200 微升丙酮腈。在此步骤中，凝胶块将变为不透明的白色。倾去丙酮腈，并让凝胶斑点在空气中干燥 10 分钟。凝胶小块在离心管中会呈现干燥状态。接下来，加入20微升胰蛋白酶溶液或足量溶液以完全覆盖凝胶小块，使凝胶斑点重新水化。将离心管置于37摄氏度的温控振荡仪中，在轻柔振荡条件下孵育至少4小时，最长可至16小时。将含有三联肽的上清液转移至新的离心管中。向凝胶碎块中加入50 µL提取液，在4°C下于超声水浴中处理两次，每次10分钟。将含有额外三联肽的上清液转移至同一新离心管中。使用冷冻干燥机在 30 摄氏度下干燥合并的提取肽。试管中将形成冻干沉淀。现在，向每根试管中加入 15 µL 的 0.1% 三氟乙酸，并在 25 摄氏度下于恒温混匀仪中轻轻孵育。将上清液转移至小瓶中，用于液相色谱串联质谱分析。

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科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

使用 2D-TAU 凝胶电泳揭示组蛋白蛋白形式

本视频介绍了一种通过磷酸酶活性检测来评估结直肠癌细胞中tau蛋白磷酸化状态的实验方案。磷酸酶可作用于tau蛋白上的磷酸基团，使tau蛋白在SDS-PAGE凝胶中的迁移率较未经处理的tau蛋白样品提高。...

结直肠癌细胞中的磷酸酶活性检测：一种检测结直肠癌细胞中Tau蛋白磷酸化状态的方法

本视频演示了利用核磁共振波谱法（NMR）技术鉴定蛋白质中多个磷酸化位点的方法。蛋白质在特定氨基酸位点发生磷酸化会导致邻近酰胺氢的去屏蔽效应，从而产生谱图差异。...

利用核磁共振波谱法鉴定蛋白质中的多位点磷酸化

来源：Bennett, S. A., 等，在酵母神经退行性蛋白病模型中表征组蛋白翻译后修饰的改变。J. Vis. Exp.

在神经退行性蛋白过表达的酵母细胞中检测组蛋白修饰

一种使用尿素/硫脲/SDS缓冲液从人和小鼠脑组织中提取蛋白质的常用方法，可实现通过二维差异凝胶电泳（2D-DIGE）对蛋白质进行鉴定，并随后通过微型二维电泳免疫印迹法（mini 2DE...

共识脑源性蛋白质提取方案：用于人和小鼠脑蛋白质组研究的双向差异凝胶电泳与微型双向电泳免疫印迹法

本文介绍了一种利用核磁共振波谱法（NMR）鉴定内在无序蛋白多位点磷酸化的方法，并以Tau蛋白为例进行说明。重组Tau蛋白经同位素标记并修饰 体外...

用于鉴定内在无序蛋白多重磷酸化的核磁共振波谱法

构象柔性在蛋白质功能中起着关键作用。本文介绍了将时间分辨电喷雾电离质谱与氢-氘交换相结合，用于研究有序和无序蛋白质中驱动功能的快速结构变化。...

时间分辨电喷雾电离氢氘交换质谱法用于研究蛋白质结构与动力学

本文介绍了蛋白质复合物的亲和纯化及其通过蓝色天然PAGE分离的实验方案，随后采用无标记定量质谱技术进行蛋白质相关性分析。该方法有助于将相互作用组解析为不同的蛋白质复合物。...

通过蓝色天然PAGE和蛋白质相关性分析解析亲和纯化蛋白质复合物

本文描述了检测tau蛋白过度磷酸化、tau蛋白与微管结合能力以及药物处理后细胞内tau蛋白定位的标准实验方案。这些方案可重复用于筛选靶向tau蛋白过度磷酸化或微管结合的药物或其他化合物。...

结直肠癌细胞中 Tau 蛋白磷酸化、微管结合及其定位的检测方法

本文介绍了一种二维凝胶电泳（2DE）结合质谱法（MS）的技术，用于分离和鉴定人类垂体腺瘤组织的蛋白质组，该方法可获得良好且可重复的2DE图谱。在利用高灵敏度质谱分析复杂的癌症蛋白质组时，每个2DE斑点中均可检测到多种蛋白质。...

二维凝胶电泳联合质谱法分析人类垂体腺瘤组织蛋白质组

本方案概述了在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）模型中，针对与肌萎缩侧索硬化症（ALS）和帕金森病相关蛋白过表达所引发的组蛋白翻译后修饰（PTM）全基因组水平变化的表征实验流程。经SDS-PAGE分离后，通过特异性识别修饰位点的抗体，利用蛋白质印迹法（Western...

表征酵母神经退行性蛋白病模型中的组蛋白翻译后修饰变化

Tau 是一种神经元蛋白，存在于细胞质中，可结合微管，同时也存在于细胞核内，在其中发挥非常规功能，包括调控与阿尔茨海默病相关基因的表达。本文介绍一种在排除细胞质 Tau 干扰的情况下研究核内 Tau...

通过调节 Tau 蛋白的亚细胞定位研究疾病相关基因的表达

学习使用二维TAU凝胶电泳技术表征组蛋白蛋白形式，探索表观遗传变化与代谢重编程的关联。该方法有助于识别新型表观遗传治疗靶点，为癌症治疗策略开发提供重要依据。

利用二维-毛细管等电聚焦/十二烷基硫酸钠凝胶电泳揭示组蛋白蛋白异构体

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