利用二维-毛细管等电聚焦/十二烷基硫酸钠凝胶电泳揭示组蛋白蛋白异构体

目前，我们的研究重点是进一步表征表观遗传学改变与代谢重编程之间的现有相关性，最终目标是鉴定出新的表观遗传治疗靶点。鉴于表观遗传修饰具有动态性和可逆性，近年来已开发出多种表观遗传药物（epi-drug），显著改善了癌症治疗效果并降低了化疗耐药性。近年来，在个体特征分析领域取得了重要进展，这得益于现代质谱技术与分离技术（如top page或高效液相色谱）的结合应用。

组蛋白表征的主要挑战在于存在无数种组蛋白蛋白异构体，这些异构体源于动态修饰酶与代谢物可及性之间的相互作用。首先，为小型垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳系统制备小型TAU凝胶。具体操作为：在室温下轻轻搅拌，将六摩尔尿素溶解于含有15%丙烯酰胺-双丙烯酰胺和一毫升超纯水的溶液中。

然后加入其他组分并定容。将此溶液倒入预置的凝胶板中，确保无气泡产生，并在顶部留出1.5厘米空间。在上层加入1毫升异丙醇以使凝胶表面平整。

制备浓缩胶溶解液时，将尿素溶解于含有6%丙烯酰胺和双丙烯酰胺的溶液中，并加入一毫升超纯水。加入其他组分后，用该溶液填充胶板，并在两块胶板之间插入一个10孔梳子，使溶液上升至梳齿的一半高度。随后，溶解6摩尔尿素、5%冰醋酸和双蒸水，以制备100微升TAU上样缓冲液。

然后将冻干的组蛋白样品溶解于30微升TAU样品缓冲液中。用终浓度为5%乙酸的TAU电泳缓冲液填充微型胶盒。使用注射器用运行缓冲液冲洗凝胶孔，再用微量移液器将样品加入孔中。

然后将电泳槽连接至电源，将正极置于下方。偶尔关闭电源，用注射器冲洗凝胶加样孔，以去除凝胶底面的气泡。从凝胶板上取下凝胶后，使用洁净的手术刀切下目标泳道。

现在用 15 毫升 0.5 M 盐酸三羟甲基氨基甲烷（Tris-HCl），pH 8.8，洗涤凝胶泳道 15 分钟。使用此处所示组分配制 15 毫升平衡缓冲液一和平衡缓冲液二。然后将平衡缓冲液二避光保存。

现在，将凝胶条带放入 10 毫升平衡缓冲液一中，在温和振荡条件下孵育 15 分钟，然后倾去缓冲液。接着，将凝胶条带放入 10 毫升平衡缓冲液二中，在避光条件下温和振荡孵育 15 分钟，之后倾去缓冲液。接下来，按照此处所示的组分配制 15% 丙烯酰胺分离胶。

安装凝胶板，并加入分离胶溶液，留出长玻璃板末端1.5厘米的空间。在胶上方加入1毫升异丙醇以平整胶面，静置使其聚合。待凝胶聚合完成后，倾去异丙醇，并用3毫米厚的纤维素层析滤纸吸干加样孔。

用镊子将切下的凝胶条带插入分离胶孔中，避免产生气泡，然后使用含有5微升0.003%溴酚蓝的0.5%低熔点琼脂糖溶于Tris-甘氨酸-SDS缓冲液中，将凝胶条带与分离胶密封。将凝胶板放入电泳槽中，并加入Tris-甘氨酸-SDS缓冲液。在120伏电压下电泳，直至溴酚蓝染料迁移至凝胶底部。

电泳结束后，轻轻将凝胶从玻璃板上取下，并弃去多余的琼脂糖。首先，对组蛋白样品进行微型二维凝胶三丁基氧化胺-酸性尿素（TAU）电泳，随后进行银染。然后配制此处所示的试剂。

使用洁净的手术刀从染色后的凝胶中切下目标组蛋白条带，将每块凝胶条带分别放入新的1.5毫升硅化管中，以避免亚型间的交叉污染。向每块凝胶中加入250 µL 50 mM碳酸铵溶液或50%丙酮硝酸溶液，在室温下置于温控振荡仪中轻柔振荡孵育。倾去溶液，重复此步骤三次，直至凝胶碎片变得透明为止。

为了使凝胶斑点脱水，加入 200 微升丙酮腈。在此步骤中，凝胶块将变为不透明的白色。倾去丙酮腈，并让凝胶斑点在空气中干燥 10 分钟。

凝胶小块在离心管中会呈现干燥状态。接下来，加入20微升胰蛋白酶溶液或足量溶液以完全覆盖凝胶小块，使凝胶斑点重新水化。将离心管置于37摄氏度的温控振荡仪中，在轻柔振荡条件下孵育至少4小时，最长可至16小时。

将含有三联肽的上清液转移至新的离心管中。向凝胶碎块中加入50 µL提取液，在4°C下于超声水浴中处理两次，每次10分钟。将含有额外三联肽的上清液转移至同一新离心管中。

使用冷冻干燥机在 30 摄氏度下干燥合并的提取肽。试管中将形成冻干沉淀。现在，向每根试管中加入 15 µL 的 0.1% 三氟乙酸，并在 25 摄氏度下于恒温混匀仪中轻轻孵育。

将上清液转移至小瓶中，用于液相色谱串联质谱分析。