Name: 通过比色分析量化弹性蛋白酶活性的调节 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 30 s
Description: 了解如何使用比色分析法量化弹性蛋白酶活性，评估天然植物提取物对组织弹性恢复的效果。该方法简单灵敏，适用于生物化学和酶学研究。

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本研究由西班牙科学与创新部（MCIN/AEI/10.13039/501100011033/FEDER，UE；项目编号：RTI2018-096724-B-C21、TED2021-129932B-C21 和 PID2021-125188OB-C32）以及巴伦西亚自治区政府（PROMETEO/2021/059）资助。本工作还得到了西班牙政府官方生物医学研究资助机构——卡洛斯三世健康研究所（ISCIII）通过 CIBEROBN（CB12/03/30038）和巴伦西亚创新署（INNEST/2022/103）的支持，后者由欧洲区域发展基金共同资助。E.B.-C 和 M.H.-L. 获得了2021/2023年度西班牙大学系统再提升计划项目的资助。F.J.Á.-M. 获得了2021/2023年度玛格丽塔·萨拉斯青年博士培训资助。我们谨向在本实验方案的开发过程中提供坚定而宝贵行政与技术支持的工作人员致以诚挚的感谢。

本研究所用试剂和设备的详细信息见材料表。
1. 0.2 M Tris 碱反应缓冲液（RB）的配制
<ol>
	<li>使用分析天平称取相应的Tris碱。</li>
	<li>将Tris碱转移至烧杯中，并用量筒加入去离子水。</li>
	<li>用磁力搅拌器搅拌溶液，直至Tris碱完全溶解。</li>
	<li>逐滴加入4 N HCl，将pH调节至8.0。使用pH计监测pH值。</li>
	<li>达到目标pH值后，将溶液转移至容量瓶中，并用去离子水定容至刻度线。</li>
	<li>将缓冲液转移至贴有标签的储存瓶中，室温保存备用。</li>
</ol>
2. 样品制备
<ol>
	<li>使用分析天平准确称取所需量的样品。本研究中，每种样品取 1 mg 即可。</li>
	<li>将样品溶解于 RB 中，达到所需浓度。可测试不同样品浓度，其中 1 mg/mL 是一个良好的参考浓度。</li>
	<li>使用涡旋混合器确保样品完全溶解。</li>
	<li>将制备好的样品置于冰上保存，直至使用。 
	注意：如果样品颜色较深，可能干扰吸光度读数，请按照相同步骤制备颜色对照，但在后续步骤中不添加弹性蛋白酶。</li>
</ol>
3. 弹性蛋白酶的制备
<ol>
	<li>在RB中配制终浓度为10 µg/mL的弹性蛋白酶工作液。使用以下公式计算所需储存液体积： 
	储存液体积（µL）= 所需终体积（µL）× 所需终浓度（µg/mL）/ 储存液浓度（µg/mL）</li>
	<li>将配制好的弹性蛋白酶溶液置于冰上保存，待用。 
	注意：应考虑供应商提供的酶的比活性，不同批次间可能存在差异。此外，酶活性在冻融后可能下降；建议尽可能新鲜配制溶液。</li>
</ol>
4. SANA 底物的制备
<ol>
	<li>通过将适量的 SANA 粉末溶解于 RB 中，配制 0.8 mM 的 SANA 溶液。使用以下公式： 
	SANA 质量（mg）= 所需终体积（µL）× 所需终浓度（mM）× 分子量（mg/mmol）/1000</li>
	<li>避光保存该溶液，并于 4 °C 储存直至使用。</li>
</ol>
5. 苯甲基磺酰氟（PMSF）储备液的配制
<ol>
	<li>用异丙醇配制 100 mM 的 PMSF 储存液。</li>
	<li>将配制好的 PMSF 溶液置于冰上，待用。 
	注意：将 PMSF 溶液分装成小份（例如 100 µL），于 -20 °C 保存，以避免反复冻融。</li>
</ol>
6. 建立检测方法
<ol>
	<li>在微量离心管中以三份重复的方式配制以下溶液：
	<ol>
		<li>阴性对照：移取 800 µL RB 溶液。</li>
		<li>溶剂对照：加入 600 µL RB 溶液和 200 µL 用于溶解样品的溶剂。</li>
		<li>阳性抑制对照：加入 24 µL PMSF 储备液和 776 µL RB 溶液。</li>
		<li>异丙醇对照：加入 24 µL 异丙醇和 776 µL RB 溶液。</li>
		<li>样品组：移取 200 µL 已配制的样品溶液，并加入 600 µL RB 溶液。</li>
		<li>显色对照（如需要）：移取 200 µL 样品溶液，并加入 800 µL RB 溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>除显色对照外，向每根试管中加入 100 µL 弹性蛋白酶溶液（10 µg/mL）。</li>
	<li>将所有试管在室温下孵育 20 分钟。</li>
	<li>除显色对照外，向每根试管中加入 100 µL SANA 底物溶液（0.8 mM）。</li>
	<li>通过轻轻翻转试管数次使溶液充分混匀。将每根试管中的 300 µL 溶液转移至 96 孔板中，确保每个样品设置三复孔。</li>
	<li>将 96 孔板放入设定波长为 410 nm 的酶标仪中。每隔 1 分钟测定一次吸光度，持续 20 分钟或直至信号稳定。设置酶标仪在室温下进行检测。 
	注意：若酶标仪支持动力学检测模式，请设置为自动在预定时间间隔采集数据；否则需手动记录各时间点的吸光度值。</li>
</ol>
7. 数据分析
<ol>
	<li>将阳性抑制对照（PMSF）设为100%抑制率，阴性对照（仅RB）设为0%抑制率，对结果进行归一化处理。</li>
	<li>使用以下公式计算每个样本的抑制百分比： 
	%&#160;抑制率 = 100 - [（样本吸光度 - 溶剂对照吸光度 - 显色对照吸光度）/（阴性对照吸光度 - 阳性对照吸光度 - 异丙醇对照吸光度）] × 100</li>
	<li>使用绘图软件将每个样本浓度的抑制百分比对样本浓度作图，以直观展示其抑制效应。</li>
</ol>

Measuring Elastase Modulation: A Colorimetric Assay for Therapeutic Insights

<ol><li>Imokawa, G., Ishida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+mechanisms+underlying+the+ultraviolet+radiation-induced+formation+of+skin+wrinkling+and+sagging+I%3A+Reduced+skin+elasticity%2C+highly+associated+with+enhanced+dermal+elastase+activity%2C+triggers+wrinkling+and+sagging%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Biological mechanisms underlying the ultraviolet radiation-induced formation of skin wrinkling and sagging I: Reduced skin elasticity, highly associated with enhanced dermal elastase activity, triggers wrinkling and sagging.</a> Int J Mol Sci. 16 (4), 7753-7775 (2015).</li>
<li>Voynow, J. A., Shinbashi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+elastase+and+chronic+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Neutrophil elastase and chronic lung disease.</a> Biomolecules. 11 (8), 11081065(2021).</li>
<li>Whitcomb, D. C., Lowe, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreatic+digestive+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Dig+Dis+Sci%22%5BJournal%5D)">Human pancreatic digestive enzymes.</a> Dig Dis Sci. 52 (1), 1-17 (2007).</li>
<li>Heinz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+fibers+during+aging+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Elastic fibers during aging and disease.</a> Ageing Res Rev. 66, 101255(2021).</li>
<li>Antonicelli, F., Bellon, G., Debelle, L., Hornebeck, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin-elastases+and+inflamm-aging%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Elastin-elastases and inflamm-aging.</a> Curr Top Dev Biol. 79, 99-155 (2007).</li>
<li>Desmiaty, Y., Faizatun, F., Noviani, Y., Ratih, H., Ambarwati, N. S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+natural+products+in+inhibiting+premature+skin+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Appl+Pharm%22%5BJournal%5D)">Potential of natural products in inhibiting premature skin aging.</a> Int J Appl Pharm. 14 (Special Issue 3), 1-5 (2022).</li>
<li>Bhatiya, M., Pathak, S., Jothimani, G., Duttaroy, A. K., Banerjee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+study+on+the+anti-cancer+effects+of+quercetin+and+its+epigenetic+modifications+in+arresting+progression+of+colon+cancer+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Immunol+Ther+Exp+%28Warsz%29%22%5BJournal%5D)">A comprehensive study on the anti-cancer effects of quercetin and its epigenetic modifications in arresting progression of colon cancer cell proliferation.</a> Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 71 (1), 6(2023).</li>
<li>Shen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+analysis+of+curcumin-mediated+alleviation+of+inflammation+in+periodontitis+patients+with+experimental+validation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Computational analysis of curcumin-mediated alleviation of inflammation in periodontitis patients with experimental validation in mice.</a> J Clin Periodontol. 51 (6), 787-799 (2024).</li>
<li>Yücel, Ç, Karatoprak, G. Ş, Yalçıntaş, S., Böncü, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethosomal+%28%E2%88%92%29-epigallocatechin-3-gallate+as+a+novel+approach+to+enhance+antioxidant%2C+anti-collagenase+and+anti-elastase+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Beilstein+J+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Ethosomal (−)-epigallocatechin-3-gallate as a novel approach to enhance antioxidant, anti-collagenase and anti-elastase effects.</a> Beilstein J Nanotechnol. 13, 491-502 (2022).</li>
<li>Wojtkiewicz, A. M., Oleksy, G., Malinowska, M. A., Janeczko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+synthesis+of+a+skin+active+ingredient+-+glochidone+by+3-ketosteroid+dehydrogenase+from+Sterolibacterium+denitrificans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Steroid+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Enzymatic synthesis of a skin active ingredient - glochidone by 3-ketosteroid dehydrogenase from Sterolibacterium denitrificans.</a> J Steroid Biochem Mol Biol. 241, 106513(2024).</li>
<li>Amnuaykan, P., Juntrapirom, S., Kanjanakawinkul, W., Chaiyana, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+antioxidant%2C+anti-aging%2C+anti-tyrosinase%2C+and+anti-inflammatory+properties+of+Vanda+coerulea+griff.+ex+lindl.+protocorm+through+elicitations+with+chitosan%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">Enhanced antioxidant, anti-aging, anti-tyrosinase, and anti-inflammatory properties of Vanda coerulea griff. ex lindl. protocorm through elicitations with chitosan.</a> Plants. 13 (13), 13131770(2024).</li>
<li>Petcharaporn, K., Thongkao, K., Thongmuang, P., Sudjaroen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+composition%2C+capsaicin+content+and+enzyme+inhibitory+activities+from+%26%2334%3BBang+Chang%26%2334%3B+thai+cultivar+chili+pepper+%28capsicum+annuum+var.+acuminatum%29+after+drying+process%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm+Qual+Assur%22%5BJournal%5D)">Nutritional composition, capsaicin content and enzyme inhibitory activities from &#34;Bang Chang&#34; thai cultivar chili pepper (capsicum annuum var. acuminatum) after drying process.</a> Int J Pharm Qual Assur. 14 (3), 707-711 (2023).</li>
<li>Jeon, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidant+activity+and+inhibitory+effects+of+whitening+and+wrinkle-related+enzymes+of+Polyozellus+multiplex+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Food+Meas+Charact%22%5BJournal%5D)">Antioxidant activity and inhibitory effects of whitening and wrinkle-related enzymes of Polyozellus multiplex extracts.</a> J Food Meas Charact. 17 (2), 1279-1288 (2023).</li>
<li>Putri, I. R., Handayani, R., Elya, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-elastase+activity+of+rumput+teki+%28Cyperus+rotundus+L.%29+rhizome+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogn+J%22%5BJournal%5D)">Anti-elastase activity of rumput teki (Cyperus rotundus L.) rhizome extract.</a> Pharmacogn J. 11 (4), 754-758 (2019).</li>
<li>Liyanaarachchi, G. D., Samarasekera, J. K. R. R., Mahanama, K. R. R., Hemalal, K. D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosinase%2C+elastase%2C+hyaluronidase%2C+inhibitory+and+antioxidant+activity+of+Sri+Lankan+medicinal+plants+for+novel+cosmeceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Ind+Crops+Prod%22%5BJournal%5D)">Tyrosinase, elastase, hyaluronidase, inhibitory and antioxidant activity of Sri Lankan medicinal plants for novel cosmeceuticals.</a> Ind Crops Prod. 111, 597-605 (2018).</li>
<li>Apraj, V. D., Pandita, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+skin+anti-aging+potential+of+Citrus+reticulata+blanco+peel%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogn+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of skin anti-aging potential of Citrus reticulata blanco peel.</a> Pharmacogn Res. 8 (3), 160-168 (2016).</li>
<li>Pandey, B. P., Pradhan, S. P., Adhikari, K., Nepal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bergenia+pacumbis+from+Nepal%2C+an+astonishing+enzymes+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Complement+Med+Ther%22%5BJournal%5D)">Bergenia pacumbis from Nepal, an astonishing enzymes inhibitor.</a> BMC Complement Med Ther. 20 (1), 198(2020).</li>
<li>Dharwal, V., Sandhir, R., Naura, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP-1+inhibition+provides+protection+against+elastase-induced+emphysema+by+mitigating+the+expression+of+matrix+metalloproteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">PARP-1 inhibition provides protection against elastase-induced emphysema by mitigating the expression of matrix metalloproteinases.</a> Mol Cell Biochem. 457 (1-2), 41-49 (2019).</li>
<li>Jugniot, N., Voisin, P., Bentaher, A., Mellet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+elastase+activity+imaging%3A+Recent+approaches+in+the+design+and+applications+of+activity-based+probes+and+substrate-based+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Contrast+Media+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Neutrophil elastase activity imaging: Recent approaches in the design and applications of activity-based probes and substrate-based probes.</a> Contrast Media Mol Imaging. 2019, (2019).</li>
<li>Stone, P. J., Morris, S. M., Thomas, K. M., Schuhwerk, K., Mitchelson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+elastase-digested+elastic+fibers+in+acellular+matrices+by+replating+with+neonatal+rat-lung+lipid+interstitial+fibroblasts+or+other+elastogenic+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Repair of elastase-digested elastic fibers in acellular matrices by replating with neonatal rat-lung lipid interstitial fibroblasts or other elastogenic cell types.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 17 (3), 289-301 (1997).</li>
<li>Weiss, F. U., Budde, C., Lerch, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+a+polyclonal+fecal+elastase+ELISA+for+CELA3%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Specificity of a polyclonal fecal elastase ELISA for CELA3.</a> PLoS ONE. 11 (7), 0159363(2016).</li>
<li>Thring, T. S. A., Hili, P., Naughton, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-collagenase%2C+anti-elastase+and+anti-oxidant+activities+of+extracts+from+21+plants%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Complement+Altern+Med%22%5BJournal%5D)">Anti-collagenase, anti-elastase and anti-oxidant activities of extracts from 21 plants.</a> BMC Complement Altern Med. 9 (1), 27(2009).</li>
<li>Donà, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+restraint+by+green+tea%3A+Inhibition+of+inflammation%2C+associated+angiogenesis%2C+and+pulmonary+fibrosis+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil restraint by green tea: Inhibition of inflammation, associated angiogenesis, and pulmonary fibrosis 1.</a> J Immunol. 170, 4335-4341 (2003).</li>
<li>Michailidis, D., Angelis, A., Nikolaou, P. E., Mitakou, S., Skaltsounis, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploitation+of+vitis+vinifera%2C+foeniculum+vulgare%2C+cannabis+sativa+and+punica+granatum+by-product+seeds+as+dermo-cosmetic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Exploitation of vitis vinifera, foeniculum vulgare, cannabis sativa and punica granatum by-product seeds as dermo-cosmetic agents.</a> Molecules. 26 (3), 26030731(2021).</li>
<li>Suzuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin+attenuates+elastase-+and+cigarette+smoke-induced+pulmonary+emphysema+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Curcumin attenuates elastase- and cigarette smoke-induced pulmonary emphysema in mice.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296 (4), L614-L623 (2009).</li>
<li>Brás, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+pancreatic+elastase+by+polyphenolic+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Inhibition of pancreatic elastase by polyphenolic compounds.</a> J Agric Food Chem. 58 (19), 10668-10676 (2010).</li>
<li>Álvarez-Martínez, F. J., Díaz-Puertas, R., Barrajón-Catalán, E., Micol, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-derived+natural+products+for+the+treatment+of+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Experimental+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Plant-derived natural products for the treatment of bacterial infections.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. , (2024).</li>
<li>Álvarez-Martínez, F. J., Barrajón-Catalán, E., Herranz-López, M., Micol, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibacterial+plant+compounds%2C+extracts+and+essential+oils%3A+An+updated+review+on+their+effects+and+putative+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Antibacterial plant compounds, extracts and essential oils: An updated review on their effects and putative mechanisms of action.</a> Phytomedicine. 90, 153626(2021).</li>
<li>Saganuwan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+modified+Michaelis-Menten+equations+for+determination+of+enzyme+inducing+and+inhibiting+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Application of modified Michaelis-Menten equations for determination of enzyme inducing and inhibiting drugs.</a> BMC Pharmacol Toxicol. 22 (1), 57(2021).</li>
<li>AlShaikh-Mubarak, G. A., Kotb, E., Alabdalall, A. H., Aldayel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+elastase-producing+bacteria+and+characteristics+of+the+most+potent+producer%2C+Priestia+megaterium+gasm32%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A survey of elastase-producing bacteria and characteristics of the most potent producer, Priestia megaterium gasm32.</a> PLoS ONE. 18, 0282963(2023).</li>
<li>Sánchez-Moreiras, A. M., Reigosa, M. J. Advances in plant ecophysiology techniques. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aS%C3%A1nchez-Moreiras%2C+AM+%22Adv+Plant+Ecophysiol+Tech%22">Adv Plant Ecophysiol Tech</a>. , Springer International Publishing. (2018).</li>
<li>Dharwal, V., Sandhir, R., Naura, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP-1+inhibition+provides+protection+against+elastase-induced+emphysema+by+mitigating+the+expression+of+matrix+metalloproteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">PARP-1 inhibition provides protection against elastase-induced emphysema by mitigating the expression of matrix metalloproteinases.</a> Mol Cell Biochem. 457 (1-2), 41-49 (2019).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+molecular+probes+for+in+vivo+near-infrared+fluorescence%2Fphotoacoustic+duplex+imaging+of+human+neutrophil+elastase%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Engineering molecular probes for in vivo near-infrared fluorescence/photoacoustic duplex imaging of human neutrophil elastase.</a> Anal Chem. 94 (7), 3227-3234 (2022).</li>
<li>Ahn, C. M., Sandler, H., Saldeen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+lung+hyaluronan+in+a+model+of+ARDS+in+the+rat%3A+Effect+of+an+inhibitor+of+leukocyte+elastase%5BTitle%5D)+AND+%22Ups+J+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Decreased lung hyaluronan in a model of ARDS in the rat: Effect of an inhibitor of leukocyte elastase.</a> Ups J Med Sci. 117 (1), 1-9 (2012).</li>
<li>Vanga, R. R., Tansel, A., Sidiq, S., El-Serag, H. B., Othman, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+performance+of+measurement+of+fecal+elastase-1+in+detection+of+exocrine+pancreatic+insufficiency%3A+Systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Diagnostic performance of measurement of fecal elastase-1 in detection of exocrine pancreatic insufficiency: Systematic review and meta-analysis.</a> Clin Gastroenterol Hepatol. 16 (8), 1220-1228 (2018).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

在本方法中，采用比色法检测植物化学物质对弹性蛋白酶的调节作用。弹性蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，在弹性蛋白降解过程中起关键作用，对维持多种器官组织的弹性具有重要意义。本文所述的比色法弹性蛋白酶活性检测提供了一种简单、灵敏且快速的酶活性测定方法。
在此背景下，研究人员关注了多种调节剂（如植物提取物和纯植物化学成分）对弹性蛋白酶活性的调节潜力；这些调节剂在天然治疗剂或化妆品的开发中展现出应用前景22。多项研究表明，多种植物提取物和植物化学成分具有此类作用，包括绿茶提取物23、葡萄藤、石榴和茴香籽提取物24、姜黄素25以及多种多酚类物质26（如原花青素）。植物化学成分作为合成化学品更安全的替代品具有广阔前景，并具备以下优势：植物化学成分在传统医学中具有长期安全使用的历史，表明其安全性良好；与合成药物相比，植物化学成分通常引起的不良反应更少<sup clas...

弹性蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，其在降解弹性蛋白中发挥关键作用。弹性蛋白是一种为肺、皮肤和血管等多种组织提供弹性的蛋白质。弹性蛋白酶的活性受到严格调控，以维持组织稳态，其失调可导致肺气肿、动脉粥样硬化和皮肤皱纹等病理及皮肤状况1。
弹性蛋白酶有多种类型，每种都具有特定的特征和功能。中性粒细胞弹性蛋白酶由中性粒细胞产生，在免疫反应和炎症过程中起重要作用。这类酶能够降解多种细胞外蛋白，参与慢性炎症性疾病的发生发展2。而胰弹性蛋白酶则在小肠蛋白质消化过程中发挥作用3。区分这些不同类型的弹性蛋白酶对于开发针对不同疾病的特异性治疗策略至关重要。
弹性蛋白的正常水平及调控弹性蛋白酶活性的通路有助于维持皮肤弹性，防止过早老化。年龄增长、紫外线辐射、炎症、遗传易感性、环境污染物和营养等因素均显著影响弹性蛋白酶的活性及其降解过程4。近年来备受关注的一个研究领域是弹性蛋白降解片段（elastokines），即弹性蛋白酶降解弹性蛋白后产生的生物活性片段。这些分子可引发多种显著的生物学效应，包括加剧炎症反应、弹性纤维钙化以及脂质沉积等5。elastokines 可能影响与弹性蛋白降解相关疾病的发展进程，并为新型治疗干预提供潜在靶点（图1）。
一些化合物，例如天然存在的植物化学物，因其潜在的治疗和美容功效而受到广泛关注，其中包括调节弹性蛋白酶活性的能力6。例如，存在于苹果和洋葱中的类黄酮槲皮素（quercetin）已被证明能有效抑制弹性蛋白酶活性，这有助于其发挥抗炎和抗衰老作用7。姜黄素（curcumin）是姜黄中的一种生物活性成分，也是一种被广泛研究的植物化学物，具有抑制弹性蛋白酶的特性，可对皮肤老化和炎症提供保护作用8。此外，表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate, EGCG）是绿茶中的主要儿茶素，已显示出强效的弹性蛋白酶抑制活性，使其成为旨在维持皮肤弹性的护肤配方中的重要成分9。&#160;这些实例凸显了植物化学物作为天然弹性蛋白酶抑制剂的潜力，为开发新的治疗和美容产品奠定了基础。
目前，比色法弹性蛋白酶检测是测量弹性蛋白酶活性的常用方法7,10,11,12,13。该检测方法基于弹性蛋白酶水解特定底物 N-琥珀酰基-(Ala)3-硝基苯胺（SANA）的能力，将其分解为琥珀酰氨基氨基酸和对硝基苯胺（pNA）。pNA 是一种呈黄色的发色团，可在 410 nm 波长下使用分光光度计轻松检测（图 2）。pNA 的生成速率与样品中的弹性蛋白酶活性成正比14。
该方法在多个研究领域具有广泛的应用。通过该方法，研究人员能够快速鉴定化合物对弹性蛋白酶活性的调节能力，探究弹性蛋白酶抑制剂的作用机制，并评估这些抑制剂在弹性蛋白酶相关疾病的细胞和动物模型中的有效性。此外，该检测还可用于研究不同的抑制机制，例如竞争性或非竞争性抑制，从而提供有关天然或合成化合物如何调节弹性蛋白酶活性的重要信息。
弹性蛋白酶活性调节检测法相较于其他测量弹性蛋白酶活性的方法具有多项优势。该方法操作简便，技术要求低，可在标准实验室条件下进行15。此外，该检测法灵敏度高，能够检测到弹性蛋白酶活性的微小变化。检测可快速获得定量结果，便于高效的数据分析。而且，该方法可适用于多种实验形式，包括高通量筛选和动力学研究16。
然而，该检测方法也存在一些局限性，例如底物特异性较低（因其仅针对弹性蛋白酶），以及容易受到样品中其他成分的干扰，如有色化合物或对对硝基苯胺（pNA）水解具有抑制作用的物质。因此，研究人员必须考虑这些局限性，并结合使用其他补充方法，以全面探究弹性蛋白酶抑制剂作用机制17。
存在多种弹性蛋白酶活性检测的替代方法。例如，酶谱法（zymography）是一种用于鉴定和区分不同弹性蛋白酶同工型的优良工具，在研究不同弹性蛋白酶亚型对特定疾病过程的具体贡献时具有重要意义。然而，酶谱法是一种半定量技术，且需要额外的显色步骤，因此与分光光度法相比，其在高通量分析中效率较低18。荧光测定法相较于分光光度法具有更高的灵敏度，可实现更低的检测限，从而更灵敏地分析弹性蛋白酶活性及其调节因子的相互作用，更全面地揭示酶促反应过程19。但荧光测定法需要专用仪器，且可能受到生物样本中某些化合物的干扰。放射性同位素测定法具有极高的灵敏度，适用于检测极低水平的弹性蛋白酶活性。然而，使用放射性物质需要配备专用设备、严格的安全部署以及规范的废物处理程序，带来操作上的复杂性和安全风险20。免疫测定法因其多功能性而突出，既可直接测量弹性蛋白酶活性，也可定量检测弹性蛋白酶-抑制剂复合物，从而评估抑制剂的有效性。此外，免疫测定法可适用于组织匀浆等复杂生物样本，而SANA方法则不具备此优势。但免疫测定法的开发与验证过程耗时较长，且需要特异性抗体，可能导致成本高于简单的分光光度法21。
比色法弹性蛋白酶活性调节检测是一种用于研究任何化合物对弹性蛋白酶活性调节能力的重要工具。由于该方法具有操作简便、灵敏度高和适应性强等优点，已被广泛应用于各类研究领域。然而，研究人员必须考虑该检测方法的局限性，并结合其他互补性方法，以全面确定弹性蛋白酶抑制剂作用机制的细节。

<table><tbody><tr><td>96孔细胞培养板</td><td>Corning Incorporated</td><td>3599</td><td>平底带盖，聚苯乙烯材质</td></tr><tr><td>细胞成像多功能读板仪</td><td>Agilent</td><td>BioTek Cytation 1</td><td>与Gen5软件配合使用</td></tr><tr><td>猪胰弹性蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7885</td><td>CAS 39445-21-1；25.9 kDa</td></tr><tr><td>异丙醇 99.5%</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC184130010</td><td>CAS 67-63-0；C3H8O；60.10 g/mol</td></tr><tr><td>N-琥珀酰-(丙氨酰)3-硝基苯胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4760</td><td>CAS 52299-14-6；C19H25N5O8；451.43 g/mol</td></tr><tr><td>pH计</td><td>Hach Lange</td><td>sensION+ PH31</td><td>配有磁力搅拌器和传感器支架</td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td>CAS 329-98-6；C7H7FO2S；174.19 g/mol</td></tr><tr><td>分子生物学用Tris</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A2264</td><td>CAS 77-86-1；C4H11NO3；121.14 g/mol</td></tr></tbody></table>

通过比色分析定量弹性蛋白酶酶活性的调控

Quantifying the Modulation of Elastase Enzyme Activity Through Colorimetric Analysis

弹性蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，在弹性蛋白的降解过程中发挥着关键作用。弹性蛋白是一种细胞外蛋白，有助于维持肺、皮肤和血管组织的弹性。弹性蛋白酶活性的严格调控对于组织稳态至关重要，因为其失调可能导致肺气肿、皱纹和动脉粥样硬化等病理状态。一些化合物，例如天然存在的植物化学物质，已显示出治疗干预的潜力，并引起了广泛关注。阐明不同化合物对弹性蛋白酶的调节作用（无论是抑制还是激活），对于开发针对弹性蛋白酶相关疾病的新型治疗和美容策略至关重要。目前广泛采用的一种检测弹性蛋白酶活性的方法是比色法弹性蛋白酶检测。该方法使用一种特异性底物被弹性蛋白酶降解，释放出一种可检测的黄色化合物——对硝基苯胺（pNA）。生成的pNA量反映了样品中弹性蛋白酶的活性，可通过比色法进行测定。该检测方法具有操作简便、灵敏度高、结果快速以及可适应多种研究需求等优点。比色法弹性蛋白酶检测仍是研究化合物如何影响弹性蛋白酶活性的重要工具。由于其操作简便且效果可靠，该检测方法已成为该领域研究的核心技术之一。

完成实验方案后，可获得进行相关计算所必需的吸光度数据，从而定量分析样品对弹性蛋白酶活性的调节能力。图3标示了不同对照和样品所在孔的位置。对于有颜色的样品（如本示例中所使用的样品），必须添加颜色对照，以尽量减少分光光度干扰，因为样品颜色可能干扰在410 nm处对对硝基苯胺（pNA）黄色产物的测定。
获得吸光度结果后，已计算各样品的抑制率，并根据对照组对结果进行了标准化处理，必须绘制出类似于图4的柱状图。较高的抑制率数值表明样品中弹性蛋白酶抑制活性较强。接近100%的数值提示对弹性蛋白酶有强效抑制作用，而接近0%的数值则表明对弹性蛋白酶的抑制作用较弱或无抑制作用。负值的抑制率表示激活了弹性蛋白酶活性。图4中的图表显示，在0.5 mg/mL、0.75 mg/mL和1 mg/mL浓度下，与阴性对照组相比，表现出虽弱但具有显著性的弹性蛋白酶抑制活性；而在0.25 mg/mL浓度下，未检测到显著的弹性蛋白酶抑制效应。...

本方案描述了一种比色法测定化合物抑制或激活弹性蛋白酶活性能力的方法。

弹性蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，在弹性蛋白的降解过程中发挥关键作用。弹性蛋白是一种细胞外蛋白，有助于维持组织的弹性……

我们的研究重点是开发天然活性化合物。通过体外方法，旨在评估弹性蛋白酶的活性——该酶参与弹性蛋白的降解以及组织弹性的丧失，以期恢复组织的稳态。定量天然植物提取物的活性面临诸多挑战，主要与其复杂的化学成分及其通常较强的色泽有关，后者可能干扰常规检测方法的测量结果。建立可靠的自适应方案对于推动该研究领域的发展至关重要。本研究为相关领域提供了多项优势，包括操作简便、灵敏度高、张力结果快速，以及能够适应不同的研究需求。首先，使用分析天平称取适量的Tris碱，并将称量好的Tris碱转移至烧杯中。使用量筒向烧杯中加入去离子水。用磁力搅拌器搅拌溶液，直至 Tris 碱完全溶解。然后用 4 N 盐酸将溶液的 pH 值调节至 8。当达到所需 pH 值后，将溶液转移至容量瓶中。使用去离子水将容量瓶定容至刻度线。将配制好的缓冲液转移至贴有标签的储存瓶中，并在室温下保存。进行样品制备时，使用分析天平准确称取所需量的样品。将样品溶解于已配制的反应缓冲液中，以达到目标浓度。使用涡旋混合器充分溶解样品。将制备好的样品置于冰上保存。接下来，用反应缓冲液配制弹性蛋白酶的工作液，使其终浓度为 10 微克/毫升。将弹性蛋白酶溶液置于冰上保存，待用时取出。现在用反应缓冲液配制0.8毫摩尔的SANA溶液。避光保存，并于4摄氏度下贮存直至使用。对于苯甲基磺酰氟（PMSF）储备液，用异丙醇配制100毫摩尔的PMSF溶液。将配制好的溶液置于冰上保存。使用微量离心管，每个反应设置三个重复。所有离心管于室温孵育20分钟。然后，除颜色对照外，向每支试管中加入 100 µL SANA 底物溶液。轻轻颠倒混匀数次，将每支试管中的 300 µL 溶液转移至 96 孔板中，确保每个样本设置三个复孔。最后，将 96 孔板放入设定波长为 410 nm 的酶标仪中，每隔 1 分钟测定一次吸光度，持续 20 分钟，或直至信号在室温下稳定。提取物一在1、0.75和0.5毫克/毫升浓度下显示出较弱但具有显著性的弹性蛋白酶抑制活性，在0.25毫克/毫升浓度下无显著作用。提取物二在所有测试浓度下均表现出较高的弹性蛋白酶抑制活性，在1、0.75和0.5毫克/毫升浓度下的抑制水平与阳性对照相似。

quantifying-modulation-elastase-enzyme-activity-through-colorimetric

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

通过比色分析量化弹性蛋白酶活性的调节

蛋白酶荧光检测试剂盒旨在利用荧光测定法检测蛋白酶活性，也可用于检测微量蛋白酶污染。该方法基于蛋白酶对一种FITC标记的酪蛋白底物专有配方进行蛋白水解反应。...

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一种用于定量抗菌蛋白酶活性的染料释放检测法

我们介绍一种简单、定量的比色法，可特异性地测定人、小鼠或大鼠颗粒酶B（Granzyme B,...

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荧光肽底物酶谱法检测蛋白酶活性

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评估新热带无尾两栖类不同尺度生物标志物的生态毒理学方法

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基于比率型荧光共振能量转移的DNase活性评估

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通过比色分析定量弹性蛋白酶酶活性的调控

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