颅骨骨髓血管动态的活体纵向成像

本研究利用活体显微镜技术，聚焦于骨髓大环境中血管动态变化的机制，旨在揭示血管在正常与病理造血过程中如何响应。我们采用先进的成像技术（如显微摄影）、转基因动物模型，并通过示踪剂分析，对活体组织中血管的动态变化进行可视化和定量分析。本研究的关键进展在于对实验方案进行了优化，以提升动物福利并符合“3R原则”。我们的纵向研究方法减少了手术步骤，显著降低了实验所需的动物数量。

本方案通过使用双光子显微镜，解决了无毒、长期活体成像的需求，该技术可实现深层组织穿透，并对细胞行为与相互作用进行高分辨率可视化观察。采用3D打印的头部植入装置，可在纵向成像过程中极为便捷地定位目标区域，无需反复调整高度、角度或顺序。目前，我们正利用该方案追踪特定内皮细胞亚型及其在白血病发生和药物治疗过程中的响应，以更深入理解其在疾病发病机制中的作用。

首先，启动分割软件并导入微计算机断层扫描（micro-CT）DICOM 文件以分离颅骨。采用基于阈值的分割方法，将骨组织与周围结构区分开来。对复杂或噪声较多的区域进行手动调整，以优化分割结果。

在 3D Slicer 中导入 DICOM 文件并加载数据集。在轴向、矢状向和冠状向切片视图中观察 CT 切片。打开分割编辑器，单击“添加”以创建新的分割，然后再次单击“添加”以创建用于阈值分割的新片段。

在分割编辑器面板中，点击阈值效果。调整下限和上限阈值滑块，或输入数值，以红色高亮显示分割区域。要将分割后的颅骨导出为 stl 文件，请切换到分割模块。

确保已选中阈值分割的区域。在“导出/导入模型和标签图”部分，将导出类型设置为模型，文件格式设置为 stl，然后点击导出以保存文件。为在 CAD 中准备颅骨模型，首先将简化后的 stl 格式颅骨模型作为新零件或新模型导入 CAD 软件中。

在正中矢状面内，创建一条与颅顶相切的轴线，然后保存制备好的颅骨模型。在颅顶平面内创建一个草图，并从前后向（AP）+6.5 至 -2 设计一个梨形样样条曲线。在 AP 0.0 处宽度为 6 毫米，该曲线将作为可观察的表面轮廓。

设计植入物的尾部，确保其符合颅骨结构，以实现正确固定，同时兼顾可用空间。最后，制作保护盖，以便在不使用时保护观察窗。将麻醉后的小鼠置于设定为37摄氏度的加热垫上，并目视监测其呼吸频率。

使用电动剃刀剃除小鼠头部的毛发，然后在小鼠眼睛上涂抹一滴眼用凝胶。确保完全去除所有毛发，以防止成像伪影并降低伤口感染的风险。

现在，使用无菌镊子和剪刀在头皮中央区域做一个小切口，以暴露中央的骨性瘢痕。清除颅骨与头皮之间的结缔组织。在培养皿中混合足够的牙科水泥，制成糊状物。

迅速将其涂抹至头部固定植入物的底部。在防止牙科水泥进入成像区域的前提下，将头部固定器放置在暴露的颅骨上，并使其固化。打开异氟烷气流，通向显微镜的立体定位面罩。

现在，迅速将小鼠移至显微镜下。用一只手轻轻抬起小鼠的鼻子，同时小心地将小鼠的门齿插入面罩中，以确保异氟烷充分进入。用一只手固定小鼠的同时，另一只手轻轻将头部固定植入件的燕尾部分滑入固定夹持器中。

用螺丝旋钮旋转半圈将其固定。接着，插入预先涂有水性凝胶的直肠探针，以监测小鼠体温。向头部成像腔内填充大量水性凝胶或磷酸盐缓冲液（PBS）。

将水浸物镜降低至完全浸入水中，以在双光子激发过程中实现最佳激发和信号检测。移动 x、y 载物台和 z 轴驱动装置，聚焦于支架瘢痕中的中央骨组织。识别由骨表面和中央静脉标记的组织。

关闭房间内的灯光，并将显微镜支架周围的盒子闭合。激活非TOSCAN探测器后，设置PMT1用于检测423至461纳米范围内的二次SHG信号，D2通道用于检测485至548纳米范围内的GFP荧光，D3通道用于检测551至645纳米范围内的TD D'Amato荧光。

将偏移量保持在零。现在，将SHG的PMT增益设置为850伏，高D增益设置为100%。逐步增加红外激光功率，直到在三个通道中最低的通道上观察到动态范围为200个灰度级的图像。在采集软件中，定位包含骨髓腔隙的区域，该区域显示为被骨表面包绕的结构。

为了识别不同的感兴趣区域（ROI），启动 Loss Navigator 并使用螺旋模式创建概览图像。单击单幅图像图标以记录选定的 ROI 位置，并在任务列表中为每个位置重命名。要获取 Z 轴层扫三维图像，选择 Z 轴层扫模式并将步进大小设置为 3 µm。

取消选择“所有区域使用相同堆栈大小”选项，然后按“开始”以启动，按“结束”以完成。采集完成后，单击“重新定义堆栈”。按“开始”以启动图像采集，并将图像保存至相应文件夹中。

为了测量动态特征（如血管通透性），将采集模式更改为XYZT以进行时间序列成像。在T模块中，将时间间隔调整为3分钟，持续时间设置为1小时。随后，以4毫克/毫升的浓度静脉注射100 µL的70 kDa Dextran TRITC，并开始图像采集。

将小鼠转移至37摄氏度加热垫上的手术位置后，在颅骨上涂抹intrasite凝胶以保持其湿润。用特定盖板封闭头颅植入物的成像区域，并用螺丝小心固定盖板。将小鼠放入设定为37摄氏度的加热箱中，等待其苏醒。

待小鼠完全恢复后，将其转移至动物房，饲养于洁净的笼具中，并提供水凝胶和环境丰富化物品。对于纵向采集实验，将眼用凝胶少量滴加至已安装头部固定装置的小鼠眼睛上。获取概览图像，操作方法如前所述。

如有必要，使用加载并对齐图像模块重新对齐之前的图像和新图像。打开屏幕截图以在原始位置标记相应点。钛制头部固定植入物的CAD模型根据颅骨的解剖结构设计，以确保其能稳定地固定在显微镜载物台上，用于细胞水平的成像。

植入物成功固定在小鼠颅骨上，能够在允许小鼠维持正常活动的同时实现长期稳定的成像。通过拼图扫描可视化颅骨骨髓血管系统，揭示了小动脉、过渡性毛细血管和窦状血管组成的复杂网络。定量血管分析实现了血管结构的分割，可测量血管直径、长度和直度，并分析其相关性。

纵向成像捕捉到白血病进展过程中颅骨血管系统的进行性重塑，随时间推移观察到血管密度增加。通过动态评估血管通透性，发现荧光染料在不同时间点的滞留存在差异，显示出不同骨髓血管的通透性差异。