Name: Attine Ants Gardens 的微生物群:通过扫描电子显微镜可视化微生物景观 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: 探索切叶蚁菌圃微生物群落的结构组织与生物膜介导的相互作用机制。本研究采用优化扫描电子显微镜方案，揭示微生物与真菌的空间整合关系及其在生态系统中的功能意义。

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作者感谢圣保罗州研究资助基金会&#160;(FAPESP)&#160;提供的资金支持（项目编号 #2019/03746-0）。MOB 感谢 FAPESP&#160;（项目编号 2021/08013-0）和巴西高等教育人员提升协调办公室（CAPES）——资助代码 001 提供的博士奖学金。AR 还感谢国家科学技术发展委员会（CNPq）&#160;提供的研究奖学金（#305269/2018）。作者感谢 Marcia Regina de Moura Aouada 和 Antonio Teruyoshi Yabuki 在样品制备预实验中的帮助，感谢 Renato Barbosa Salaroli 提供的技术支持，以及 Enzo Sorrentino 在摄影拍摄中的协助。本研究在遗传资源获取授权 # SISGen AA39A6D 下开展。

1. 野外蜂群采样
注意：采集蚂蚁种群时，须确保已获得当地法律法规要求的所有许可后方可进行采集。在本研究中，采集许可证编号 #74585 由巴西奇科·门德斯生物多样性保护研究所（Instituto Chico Mendes de Conservação e Biodiversidade, ICMBio）签发。若样本来源于实验室种群，请直接进入第 2 节。
<ol>
	<li>找到并标记蚁群位置。在蚁巢周围挖掘一条沟槽，直至暴露菌圃室（图2A）。 
	注意：某些切叶蚁物种可能将巢穴建于落叶层下或腐烂的树干内部。在此类情况下，应小心翻动落叶层或谨慎劈开树干以采集样本。有关多种切叶蚁物种的巢穴定位、样本采集及活体蚁群维持的详细信息，请参见 Sosa-Calvo 等人46。</li>
	<li>从侧面打开菌圃室，以防止土壤掉落至菌圃表面。根据菌圃大小，使用昆虫镊子、勺子或厨房滤网小心采集菌圃样本。 
	注意：采集前务必对工具进行灭菌处理。采集切叶蚁菌圃时，应佩戴厚实的织物手套，以防止（或至少减轻）工蚁叮咬。对于其他切叶蚁物种，佩戴织物手套为可选操作。</li>
	<li>将菌圃样本转移至洁净的塑料容器中，容器内需铺有一层石膏以调节菌圃湿度。转移菌圃及工蚁后，将容器密封，防止样本干燥。将菌圃样本储存于23–25 °C条件下，直至进行后续处理。</li>
	<li>用先前挖出的土壤将沟槽填回。</li>
</ol>
<img alt="蚁群挖掘及扫描电镜样品制备示意图：固定、脱水、干燥、成像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67334/67334fig02v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：样品制备流程图。（A）野外蚁群取样。（B）样品处理。（C）样品制备的基本原理与操作流程：1. 固定：用于增强并保持样品结构。2. 脱水：用乙醇置换样品中的水分。3. 临界点干燥：用液态CO2置换乙醇并使其蒸发。4. 安装：将样品置于分析位置。5. 溅射镀金：防止样品带电。6. 成像。插图与照片由Mariana Barcoto提供。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67334/67334fig02largev3.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
2. 试剂
注意：请记住，以下溶液应预先配制。
<ol>
	<li>配制 0.2 M 的二甲胂酸钠缓冲液。将 42.8 g 二甲胂酸钠溶解于 800 mL 蒸馏水中，搅拌至完全溶解，并使 pH 稳定在 7.2（如需要，可用盐酸调节 pH）。用蒸馏水定容至 1 L。4 °C 下保存（约 1 个月）。 
	注意：戊二醛和多聚甲醛具有毒性，操作时应在通风橱内进行。接触此类试剂时，务必全程佩戴腈类手套和防护眼镜。</li>
	<li>配制 Karnovsky 固定液（参照 Karnovsky 方法改良）47。取 25 mL 0.2 M 二甲胂酸钠缓冲液，加入 10 mL 25% 戊二醛水溶液和 10 mL 20% 多聚甲醛水溶液，混匀。再加入 1 mL 0.1 M 氯化钙（CaCl2），用蒸馏水定容至 100 mL。4 °C 下保存（最多 1 个月）。 
	注意：Karnovsky 固定液吸入后有害，可能引起皮肤和眼睛刺激。避免吸入蒸气，仅在户外或通风良好的区域使用。操作该溶液时，务必全程佩戴腈类手套和防护眼镜。</li>
	<li>使用分析纯无水乙醇，用蒸馏水配制 30%、50%、70% 和 90% 的乙醇溶液；同时需要 100% 乙醇。</li>
</ol>
3. 样品固定
注意：固定剂可硬化并保存样本，维持其形态学特征。醛类（如多聚甲醛和戊二醛）属于非凝固性交联型固定剂，可在蛋白质和核酸内部及其之间诱导形成交联结构48。
<ol>
	<li>使用昆虫学镊子从花园样本中移除工蚁、卵、蛹和幼虫（图2B）。将不超过5 mm3的花园碎片分离出来，并加入至2 mL离心管中（图2C）。</li>
	<li>向含有样本的离心管中，使用巴斯德玻璃移液管加入约1 mL卡诺夫斯基固定液（确保样本完全被覆盖）。轻轻振荡混合，以促进样本充分浸润，并在4 °C下孵育至少24小时，之后再继续样本处理（图2C.1）。 
	注意：若后续脱水步骤无法在固定后立即进行，可在本步骤暂停实验流程，样本可在4 °C下保存约1年。 
	建议使用巴斯德玻璃移液管，因其材质惰性，且后续更易于清洗重复使用。花园材料具有高度疏水性，容易漂浮在固定液表面，通常需要长达5分钟才能完全浸入固定液中。请确保固定液体积足以覆盖所有花园碎片，因为液体渗入样本孔隙后体积会减少。我们通过实验观察到，当样本被浸润变湿后，其组分（特别是脆弱的真菌菌丝体）在进一步混合时易发生破碎。因此，我们建议尽可能避免振荡或剧烈晃动样本。</li>
</ol>
4. 样品脱水
注意：乙醇洗涤系列步骤可逐步将样品中的水替换为乙醇。为避免对这类精细样品造成过度损伤或塌陷，必须从低浓度的乙醇溶液开始（见下文）49。
<ol>
	<li>使用玻璃移液管完全去除卡诺夫斯基固定液，注意不要破坏样本（图 2C.1）。 
	注意：将卡诺夫斯基固定液弃置于正确标记的有毒化学残留物处理容器中。</li>
	<li>去除固定液后，立即加入 1 mL 30% 乙醇，注意不要破坏样本，并在室温下孵育 10 分钟（图 2C.2）。 
	注意：样本必须始终浸没在溶液中。在逐步乙醇洗涤过程中，应迅速更换溶液。当样本失去多孔结构并在管底聚集时，1 mL 乙醇通常足以覆盖样本（当样本体积不超过 5 mm3 时）。但如果样本未被完全覆盖，请添加乙醇直至完全浸没。</li>
	<li>使用玻璃移液管完全去除 30% 乙醇，注意不要破坏样本。妥善弃置 30% 乙醇。 
	注意：在整个逐步乙醇洗涤过程中，均应将乙醇弃置于正确标记的有毒化学残留物处理容器中。</li>
	<li>加入 1 mL 50% 乙醇，在室温下孵育 10 分钟。使用玻璃移液管完全去除 50% 乙醇，注意不要破坏样本。妥善弃置 50% 乙醇。</li>
	<li>加入 1 mL 70% 乙醇，在室温下孵育 10 分钟。使用玻璃移液管完全去除 70% 乙醇，注意不要破坏样本。妥善弃置 70% 乙醇。 
	注意：在 70% 乙醇洗涤步骤中，如需暂停操作，可将样本管置于 4 °C 过夜保存，以便材料不立即进行后续处理。</li>
	<li>加入 1 mL 90% 乙醇，在室温下孵育 10 分钟。使用玻璃移液管完全去除 90% 乙醇，注意不要破坏样本。妥善弃置 90% 乙醇。</li>
	<li>加入 1 mL 100% 乙醇，在室温下孵育 10 分钟。使用玻璃移液管完全去除 100% 乙醇，注意不要破坏样本。妥善弃置 100% 乙醇。</li>
	<li>使用镊子和/或刮刀，小心地将样本转移至临界点干燥仪（CPD）的样品容器中，容器上应贴有预先用纸和铅笔书写的样本标识标签。为防止样本干燥，此转移操作应在盛有 100% 乙醇并加盖的培养皿中进行，将容器置于其中。</li>
	<li>盖上容器盖子，并将其浸入装有足量 100% 乙醇的刻度玻璃烧杯中，乙醇应足以淹没容器。盖上烧杯，在室温下孵育 10 分钟；然后妥善弃置 100% 乙醇。</li>
	<li>将样品容器转移至另一个装有足量 100% 乙醇的刻度玻璃烧杯中，乙醇应足以淹没容器。盖上烧杯，在室温下孵育 10 分钟；然后将样品容器转移至临界点干燥仪中。 
	注意：完成洗涤步骤后，玻璃移液管和烧杯应使用蒸馏水充分冲洗，冲洗后的残液应弃置于正确标记的有毒化学残留物处理容器中。冲洗后，玻璃器皿可用中性洗涤剂清洗，再用自来水冲洗，并自然晾干。</li>
</ol>
5. 临界点干燥
注意：临界点干燥仪将样品中的乙醇置换为液态二氧化碳（CO2），然后在较高温度和压力下使二氧化碳从样品中蒸发。请遵循仪器制造商提供的相关操作说明。
<ol>
	<li>打开设备。</li>
	<li>打开腔室，将样品容器放入其中，并加入100%乙醇直至完全浸没容器，然后关闭腔室。</li>
	<li>启动冷却 选项，等待温度降至10 °C。</li>
	<li>打开CO2气瓶阀门，并启动搅拌器 选项。</li>
	<li>启动通入CO2 选项，同时持续观察腔室，确认CO2填充程度。当腔室接近充满时，关闭通入CO2选项，启动置换 选项，并保持开启状态，直至腔室内CO2仅足以覆盖样品容器为止。确保容器始终被CO2覆盖（即在所有CO2排出前关闭置换 选项）。重复步骤5.5共6次。</li>
	<li>最后一次启动通入CO2选项，将腔室填充至样品容器被完全覆盖。</li>
	<li>启动加热 选项，关闭搅拌器 选项，并关闭CO2气瓶阀门。</li>
	<li>待温度升至35 °C后，启动排气 选项。 
	注意：当温度升至约30 °C时，腔室内压力达到70–80 bar，达到临界点，此时液相消失。</li>
	<li>当腔室压力降至1 bar时，表明所有气体已排尽。打开腔室并取出容器。</li>
	<li>关闭设备。</li>
</ol>
6. 封片
<ol>
	<li>准备扫描电镜样品台（即铝制样品台；图 2C.4）。
	<ol>
		<li>用一片铝箔包裹样品台，仅覆盖顶部，以便在分析后清洁样品台。</li>
		<li>在样品台底部写上样品编号/代码，以确保能够识别放置在上方的样品。</li>
		<li>用双面碳导电胶带覆盖样品台的上部表面，并将样品台放入样品 holder 中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>打开样品容器的盖子，使用镊子和刮刀小心地将干燥的样品转移至玻璃培养皿中。 
	注意：临界点干燥的类器官容易聚集，形成高度致密的样品，应小心将其分离成不超过 1 mm3 大小的碎片。</li>
	<li>小心地将碎片放置在覆盖胶带的样品台粘性表面上。一旦类器官碎片接触到胶带，便很难再移动或重新调整位置，因此需避免将其置于不希望的位置。每个样品台最多放置九个碎片。</li>
	<li>对每个样品重复步骤 6.2 和 6.3。</li>
</ol>
7. 金溅射镀膜
注意：需要对样品进行镀膜以防止其带电。请根据制造商的说明调整相关参数，例如工作气体压力（本方案中为0.5 × 10-1 mm Hg）、溅射时间（220 s）、金层厚度（约120 Å）、电流（50 mA）以及电压供应。尽管不同制造商的设备在操作上可能略有差异，但溅射过程通常遵循相似的工作流程。
<ol>
	<li>打开铰接的目标臂，将样品台上的载片放置到位。</li>
	<li>关闭铰接的目标臂，并检查玻璃真空室的防溅屏蔽是否正确嵌入。</li>
	<li>打开氩气瓶阀门，并接通主电源开关。</li>
	<li>观察设备显示屏上的真空度上升情况，直至达到显示值 0.5 × 10-1 mm Hg；然后启动Rinsing（清洗）程序。重复此操作5次。</li>
	<li>启动水循环系统，激活HV On（高压开启）选项，并打开镀金膜盖。确认等离子体颜色呈粉红色。按照本方案，设定溅射时间为220秒，电流为50 mA，可沉积约120 Å（12 nm）厚的金膜。</li>
	<li>HV On（高压开启）将自动关闭。关闭水循环系统，并盖上镀金膜盖。</li>
	<li>关闭主电源开关，使空气进入真空室。对于园艺和废弃物样品，重复步骤7.1–7.7共3次。 
	注意：若样品制备后不能立即进行成像，请将载片存放在充满硅胶层的密闭容器中，以避免样品重新吸水。</li>
</ol>
8. 成像
注意：请遵循制造商的说明调整扫描电子显微镜（SEM）的设置，例如物镜光阑直径、工作电压、电子束系统的对中、轴向对中以及消像散器。
<ol>
	<li>将样品 stub 放入样品台，并记录每个样品的位置。 
	注意：插入或取出样品台时需佩戴手套，并尽量保持样品台清洁。</li>
	<li>从桌面启动操作软件。</li>
	<li>选择仪器参数设置。使用30 µm 的物镜光阑直径（即第二级）对花园样品进行观察，工作模式为高真空，信号检测采用二次电子探测器（SED），加速电压设为20 kV，工作距离设为15 - 20 mm，探针电流设为40.0（高电流模式），并根据样品情况调节放大倍数。</li>
	<li>按照导航提示，点击Vent图标，等待样品室通气。进度条将显示真空状态。</li>
	<li>当压力达到大气压后，打开样品室，小心插入样品台。</li>
	<li>轻轻关闭样品室门，点击Evac图标开始抽真空，并通过进度条监控真空状态。导航系统将显示移动载物台的位置，并在移动完成后提供样品台示意图。点击Camera图标拍摄样品台照片，获得俯视图，以便在成像过程中在不同样品间导航。</li>
	<li>点击Observation图标以开启电子枪，并等待图像形成。使用手动用户界面（手动控制）手动调节 Z 轴至合适高度（根据样品高度和设定的工作距离）。 
	注意：为延长钨灯丝寿命，在不进行主动成像时应暂停Observation功能。</li>
	<li>使用屏幕上显示的选项或手动控制调节扫描速率和图像位置。移动载物台以全面观察样品，利用RDC功能对特定区域进行聚焦。当观察目标结构或感兴趣结构时，相应调节放大倍数、聚焦、亮度、对比度和消像散。通过手动用户界面移动载物台在 X 和 Y 方向上的位置来校正像散。
	<ol>
		<li>将放大倍数调节至 100x 至 700x，以观察花园的整体特征（如菌丝密度、基质及定植模式）。</li>
		<li>将放大倍数调节至 700x 至 1,500x，以观察微生物群落的空间分布模式。</li>
		<li>将放大倍数调节至 1,500x 至 3,000x，以观察微生物群落与生物膜之间的物理相互作用。</li>
		<li>将放大倍数调节至 3,000x 至 4,000x，以聚焦于特定的微生物聚集体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>保存图像时，使用Freeze功能，点击Photo图标，并设置文件路径。作为标准，应至少分析三个花园片段，对每个片段均在第 8.8 步所述的所有放大倍数范围内进行成像。这将获得每个样品至少 12 张图像，但更多图像有助于更详细的描述。建议每个样品采集 15–25 张图像，覆盖第 8.8 步中的全部放大倍数范围，以获得更精细的样品描述细节。 
	注意：扫描和保存图像需要数秒钟，在此期间应避免对 SEM 浮动台产生任何振动。</li>
	<li>完成成像后，点击Vent选项对样品室通气，并通过进度条监控真空状态。小心取出样品台，轻轻关闭样品室门，然后点击Evac对样品室重新抽真空。</li>
	<li>抽真空完成后，立即退出操作软件。</li>
	<li>使用图像编辑软件调节亮度和对比度，以改善图像可视化效果。</li>
</ol>

 Microscale SEM Analysis of Microbial Communities in Fungus-Growing Ant Cultures

作者无任何利益冲突需要披露。

扫描电子显微镜（SEM）利用电子束扫描样品，生成放大的图像，从而以高分辨率观察三维微结构。由于SEM在高真空条件下运行，因此需要从样品中去除99%以上（或高达99%以上）的水分。在SEM真空腔内，部分水合的样品可能发生脱水和塌陷，并导致电子散射。为了实现SEM的高分辨率成像，样品制备应包括去除水分的同时尽可能减少体积和形态变化的步骤，以及进行镀层处理以防止成像过程中产生电荷积累55,56,57。
首先，通过交联样品中的蛋白质和核酸对其进行化学固定，该过程可通过多种技术实现。一种广泛使用的方法是将戊二醛和甲醛（或聚甲醛）加入缓冲液中，例如哌嗪-1,4-二[2-乙磺酸]（PIPES）；N-[2-羟乙基]哌嗪-N′-2-乙磺酸（HEPES）；磷酸盐缓冲盐水（PBS）；或二甲胂酸钠。化学固定可增强样品的稳定性，从而在干燥过程中保持其结构。根据样品性质，可能需要进行二次固定（使用四氧化锇），甚至三次固定（使用醋酸铀酰）。其次，样品必须脱水。由于空气干燥会导致精细结构严重塌陷，一种常见的替代方法是临界点干燥（CPD）。在临界点干燥过程中，样品不会受到表面张力作用，从而避免产生假象。一方面，水的临界点为228.5 bar和374 °C，这一条件极易破坏样品；另一方面，CO2&#160;的临界点为73.8 bar和31 °C，因此适合作为过渡流体。当温度升高时，CO2转化为气态并从样品中去除58,59,60,61,62,63。第三，非导电样品应进行镀膜处理，以防止样品带电并提高二次电子产率，从而有助于获得清晰的图像信号64。
本文所展示的方案结合了保存基于真菌的样本32,33,45,65,66,67,68&#160;以及生物膜69,70的多种操作步骤，同时通过省略后固定步骤并缩短脱水时间简化了流程。该方法成功保留了菌圃精细的结构，进一步揭示了微生物群落之间的物理相互作用，并展现了生物膜的空间结构。微生物群落的空间组装对于建立相互作用关系及其调控模式均至关重要。空间分布塑造了微生物的社会动态，由此可能涌现出内在特性，这对于应对微生物生态系统中所面临的变异性与复杂性具有重要意义71,72,73。我们的研究结果强化了菌圃结构模式在整合微生物群落中的作用，支持其可能参与生理响应的假设32,42,43,44。我们提供了in situ证据，表明生物膜在切叶蚁菌圃栽培系统中的微生物相互作用具有重要作用42,44。生物膜是复杂且异质性的多细胞体系，其中微生物被包裹于自身分泌的胞外多糖基质（EPS）中，形成社会性网络。通过合作性或拮抗性相互作用，生物膜内部的互动决定了生态位的开启、占据与改造71,72,73,74。扫描电镜（SEM）使我们能够进一步理解微生物群落在菌圃不同区域的空间组织结构，详细呈现了微生物群落与基质之间以及微生物群落与菌丝之间的物理相互作用，同时简化了该领域未来研究的方法流程。
关于花园微生物群的研究正受到越来越多的关注，特别是聚焦于可能影响这些独特群落组成的过程75,76，以及它们的功能和相互作用42,43,44。细菌与真菌在作物上的相互作用可能帮助真菌溶解磷酸盐、产生铁载体，并降解纤维素和几丁质。这类相互作用可能以互利-拮抗的连续体形式存在，从而调控花园的功能44。我们在此提出的方法学手段，能够实现对相互作用可能发生的空间结构维度进行原位观察。该方法强调，与其他大多数已被研究的微生物生态系统相似，切叶蚁花园在空间上具有明确的、异质性的组织模式5,7,8。扫描电镜（SEM）已为多种宿主相关微生物群落中的微生物动态提供了原位空间视角，例如蓝细菌海绵77、座头鲸皮肤78、蘑菇66、刺胞动物79、人类肠道80、地衣81，同时也助力于描述“塑料圈”（一种新近由人类活动形成的生态系统）82。然而，这些研究中每一项所采用的样品制备步骤方法均略有不同。
园艺样本极为精细且具有高度异质性，其中真菌菌丝被认为具有防止水分流失的适应性26，此外还包含多种基质24、微生物群及其生物膜。然而，我们所采用的样本制备方案保留了大部分此类结构，使我们能够进一步拓展对微生物群空间结构的表征。我们认为使用Karnovsky固定液是该方案中的关键步骤，因为此类精细样本的三维结构在此阶段可能发生塌陷和/或压平。通常，基于真菌的复杂样本采用戊二醛固定，再用OsO4进行后固定来制备扫描电镜（SEM）样品65,66,67,68。然而，已有报道表明，联合使用醛类（多聚甲醛和戊二醛）可改善生物膜在SEM中的保存效果69,70。用于保存生物膜的方法还可包括在初始Karnovsky固定液中添加0.15%阿尔新蓝（Alcian Blue）或0.15%钌红（Ruthenium Red），以及在1%锇酸（osmium）后固定液中加入1%单宁酸。既往研究中，使用Karnovsky液固定并以OsO4&#160;进行后固定的方案虽可在老化的园艺样本和废弃物样本中保留细菌，但未能清晰显示生物膜结构32。由于我们的样本在未采用以往方案中所使用的锇酸后固定步骤的情况下，仍成功保留了园艺结构、微生物群及生物膜32,33,69,70，因此我们选择简化方案，省略该步骤。OsO4&#160;是一种氧化剂，主要用于固定脂质性细胞组分83。由于其具有强腐蚀性，OsO4&#160;接触皮肤或黏膜时可能引起严重灼伤，吸入或摄入后还可能损伤呼吸道或胃肠道84,85。通过去除OsO4 后固定步骤，该方案相应减少了需操作的有毒试剂数量。
我们还建议使用乙醇洗涤系列，而不是丙酮，因为丙酮可能对 delicate 样本过于剧烈86。乙醇洗涤系列每步持续10分钟，也简化了以往的扫描电镜（SEM）操作流程45&#160;，且不会影响图像分辨率。此外，我们通过实验验证发现，额外的溅射步骤可获得更高品质的图像，这一现象在我们测试的所有物种的园艺样本中均一致存在。这些额外步骤可能使样本镀层更加均匀，因为仅镀一次的样本中电子散射现象明显更频繁（图4A）。因此，我们鼓励未来研究进一步测试不同的添加剂和条件，以优化适用于园艺样本中生物膜可视化的实验方案。
扫描电镜（SEM）是一种强大的工具，可用于详细观察表面微生物群的细胞形态及胞外聚合物（EPS）的空间排列，能够以高分辨率和高放大倍数揭示样本表面的形貌与纹理特征70,87然而，该方法无法提供群落成员的分类学区分，因此我们无法明确各微生物的分布位置。此外，尽管扫描电镜具有较大的焦深，却无法揭示样品的三维结构特征。对于包括分类学地理分布和三维空间分辨率在内的切叶蚁微生物园的完整描述，扫描电镜分析可作为园内样本逐步成像技术的初步步骤。为实现分类学上的分辨，扫描电镜可与荧光技术相结合 原位 荧光原位杂交（FISH）88,89&#160;及其变体，例如高系统发育分辨率荧光原位杂交（HiPR-FISH）90组合标记与光谱成像FISH（CLASI-FISH）9,91和三维投影92三维微结构分析可通过X射线显微断层扫描（X-ray µCT）进一步细化。93到目前为止，扫描电镜（SEM）使我们能够详细观察菌丝周围以及基质表面、沟槽和凹陷处微生物群落的空间分布。这类微生物空间模式的研究正在增进我们对切叶菌圃中潜在微生物相互作用的认识。我们认为，本文所介绍的样品制备步骤可广泛应用于其他精细微生物生态系统中微生物空间结构研究的优化。

生态系统由特定地理区域（即环境）内通过各种过程相互关联的生物组成。生物随时间与环境相互作用，从而形成复杂且异质的空间格局。空间格局决定生态多样性与稳定性，并最终影响生态系统的功能1,2,3,4。在湿地、稀树草原、珊瑚礁和干旱生态系统等大尺度生态系统中，空间格局与资源的流动和浓度密切相关。空间异质性和空间格局有助于资源优化，使得生态系统比均质系统更具恢复力2。群落生态学中生物的空间定位基础同样适用于微生物世界。
微生物生态系统并非生物体在微生境中随机且均匀混合的状态，而是呈现出定义其大部分功能的空间格局5,6,7从温诺格拉斯基柱到环境及宿主相关微生物群落，这些生态系统在空间上呈异质性分布，其空间排布会引发不同的表型响应。共存物种更有可能相互作用并影响彼此的生理状态。因此，群落的空间结构相较于其组成 本身，界定生态系统属性和生态位5,7,8以这些概念为例，空间分布模式的变化似乎与牙菌斑、龋齿和牙龈疾病的病理进展相关。9,10炎症性肠病11，囊性纤维化肺部感染，慢性伤口感染12,13结直肠癌和腺瘤14.
在微生物生物地理学（研究微生物多样性在时空尺度上的分布格局）的范畴内，理解微生物群落的空间分布模式极大地促进了人们对微生物生态系统的认知。6,13,15,16,17我们研究了迷人切叶蚁（fungus-growing attine ant）所构建的昆虫-微生物生态系统的空间格局，该生态系统位于其核心膜翅目：蚁科：切叶蚁亚科：收获蚁族：收获蚁亚族) 菌落。这里存在着一个以担子菌门真菌为核心的“微生物园”，该真菌属于担子菌科族 白鬼伞亚科（担子菌门：蘑菇科） 或在科内 小塔氏菌科 (担子菌门：伞菌目)18,19,20,21,22。菌圃是由菌丝相互交织形成的海绵状结构，通过代谢蚂蚁采集的以植物为主的基质而生长图 1）。根据不同的切叶蚁属，这些物质可能包括：干燥的植物部分、昆虫粪便和尸体、 freshly cut leaves、种子以及花部结构23,24类似于外部草食性动物的消化道，该菌圃通过酶解和化学作用将难降解的聚合物转化为易利用的营养物质，为蚂蚁提供必需氨基酸、脂质和可溶性糖21,25,26,27,28.
对切叶蚁属Atta和Acromyrmex的菌圃进行的超微结构、酶学和转录组学分析表明，这些环境构成了一个连续的底物降解和营养斑块体系26,29,30,31,32。菌圃的较年轻区域由于新近加入并被破碎的底物而通常颜色较深。这些新添加的底物通常从边缘开始被定植，这些边缘由工蚁切割，并接种了菌丝团块。菌丝从切割边缘向外辐射，在底物表面扩展29,32,33。随着底物降解的进行，菌丝丰度增加，形成白色且代谢活跃的区域30,31,32。较老的区域底物降解程度更高，并含有丰富的微生物群落29,32，通常呈现褐色色调且湿度较高。工蚁会移除这些区域的碎片，将其分离并堆放为废弃物，同时也会将有害于真菌共生体的底物带入其中34,35,36。尽管废弃物堆在物理上与菌圃分离，但仍是大量定居微生物持续进行底物降解和养分循环的重要场所29,32,37,38,39。
主要由微生物群组成的 肠杆菌属，克雷伯氏菌属，泛菌属，假单胞菌属 和 粘质沙雷菌，也栖息于菌圃中，似乎被多种切叶蚁真菌种植系统所共有。这些微生物编码能够补充真菌代谢的代谢通路，可能参与菌圃的生理响应过程40,41,42,43,44。宏基因组数据不仅表明微生物群的存在41,42，但对切叶蚁菌圃的扫描电镜（SEM）分析显示，植物基质上主要为杆状细菌32尽管从整个菌圃中分离出了细菌（包括纤维素降解菌株），但细菌仅在菌圃较老的区域、废物堆以及创始蚁后携带的初始菌团中被观察到。29,32也不确定微生物群是否能够形成生物膜 体内 （即在花园和废弃物中），这与其代谢能力相符42 并观察 体外44.
本研究采用扫描电子显微镜（SEM）进一步解析花园不同区域中微生物群落的空间组织结构，详细描述微生物群落与基质以及微生物群落与菌丝之间的物理相互作用。SEM 提供具有较大焦深的图像，能够以高分辨率观察三维微观结构，从而实现对花园微生物群落空间分布模式的全面分析。本文详细阐述了对这类异质性高且脆弱的真菌基样品进行固定、脱水、干燥、溅射镀膜和成像的步骤。通过省去四氧化锇（OsO4）的后固定步骤并缩短脱水时间，我们对用于花园样品和废弃物样品 SEM 分析的前处理方案32,33,45 进行了简化。该优化后的方案可有效保持菌丝结构特征以及微生物群落和生物膜的空间组织状态，亦可应用于其他脆弱的微生物生态系统和生物膜的研究。
<img alt="切叶蚁园中的微生物相互作用概念；含生物膜分析的显微图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67334/67334fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：切叶蚁的微生物园。该菌园是一种海绵状结构，由菌丝交织形成的网状物构成，通过代谢蚂蚁带入的以植物为主的底物而生长。园中还栖息着微生物群，其编码的代谢通路可能补充真菌的代谢功能。宏基因组数据和先前的扫描电子显微镜分析已表明其存在，但我们对其空间组织以及与底物和真菌菌丝的物理相互作用了解甚少。我们采用扫描电镜（SEM）揭示微生物群及生物膜的空间组织与分布模式。图示由Mariana Barcoto绘制（菌园和微生物群改编自Barcoto和Rodrigues94），照片由Mariana Barcoto和Enzo Sorrentino拍摄。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67334/67334fig01largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>2 mL 离心管</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C-BRA</td><td>固定并脱水样本</td></tr><tr><td>无水氯化钙</td><td>默克</td><td>C4901</td><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 无水以配制 Karnovsky&amp;rsquo;固定剂</td></tr><tr><td>临界点干燥仪</td><td>Leica</td><td>EM CPD 300</td><td>用于临界点干燥</td></tr><tr><td>双面碳导电胶带，12 毫米（宽）× 5 米（长）</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>77819-12</td><td>用于样品封片</td></tr><tr><td>昆虫镊</td><td>无特定供应商</td><td></td><td>处理园艺样品</td></tr><tr><td>乙醇（=ethanol），纯品（&amp;ge;99.5%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td>用于脱水</td></tr><tr><td>镊子</td><td>无特定供应商</td><td></td><td>处理园艺样品</td></tr><tr><td>玻璃烧杯</td><td>无特定供应商</td><td></td><td>用于脱水</td></tr><tr><td>玻璃培养皿</td><td>无特定供应商</td><td></td><td>处理园艺样品</td></tr><tr><td>玻璃移液管</td><td>无特定供应商</td><td></td><td>固定并脱水样本</td></tr><tr><td>戊二醛（水相电子显微镜级戊二醛，25%）</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>16220</td><td>制备卡诺夫斯基固定液&amp;rsquo;固定剂</td></tr><tr><td>金靶&amp;nbsp;</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>8071</td><td>镀金溅射处理</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>用于调节溶液的pH值</td></tr><tr><td>图像编辑器</td><td>Photoshop</td><td>任何版本</td><td>调整图像</td></tr><tr><td>多聚甲醛（多聚甲醛20%水溶液，电子显微镜级）</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>15713</td><td>制备卡诺夫斯基固定液&amp;rsquo;固定剂</td></tr><tr><td>丙烯容器</td><td>无特定供应商</td><td></td><td>用于维持活体蚂蚁群落</td></tr><tr><td>扫描电子显微镜</td><td>JEOL&amp;nbsp;</td><td>IT300 SEM</td><td>用于样品成像&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>二甲胂酸钠三水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250</td><td>用于配制卡考基酸钠缓冲液</td></tr><tr><td>刮勺</td><td>无特定供应商</td><td></td><td>处理园艺样品</td></tr><tr><td>直径15毫米、高10毫米的标本容器</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>4591</td><td>用于临界点干燥</td></tr><tr><td>溅射镀膜仪</td><td>Baltec&amp;nbsp;</td><td>SCD 050</td><td>镀金</td></tr><tr><td>支架（铝制底座，平头针）12.7 mm × 8 mm&amp;nbsp;</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>75520</td><td>用于样本封片</td></tr></tbody></table>

切叶蚁菌圃的微生物群落：通过扫描电子显微镜可视化微生物景观

Microbiota of Attine Ants' Gardens: Visualizing a Microbial Landscape by Scanning Electron Microscopy

在宏观生态系统中，例如雨林或珊瑚礁，生物体的空间定位是我们理解群落生态学的基础。同样，在微生物世界中，微尺度生态系统也远非生物与栖息地的随机均质混合。获取微生物的空间分布对于理解微生物群的功能与生态至关重要，因为共存的物种更有可能相互作用并影响彼此的生理状态。
真菌种植蚂蚁群落的核心是一个跨界的微生物生态系统，这些蚂蚁培养担子菌门真菌作为营养来源。切叶蚁采集多种底物（主要为植物来源），由所培养的真菌代谢这些底物并形成一种海绵状结构，即&#34;微生物园&#34;，其功能类似于体外消化系统。该“微生物园”由真菌菌丝交织而成，菌丝通过代谢底物不断生长，从而为具有特征性且已适应的微生物群落创造生态位并使其定殖。目前认为，这些微生物群落在底物降解和真菌生长过程中发挥重要作用，但其空间组织结构仍有待阐明。
本文中，我们描述了如何利用扫描电子显微镜（SEM）以前所未有的细节研究不同培菌系统中培菌蚁的微生物群落及生物膜的空间结构。SEM成像已提供了微生物群落空间结构与组织方式的详细描述。SEM结果显示，微生物群落通常以生物膜形式聚集，这是培菌系统中微生物生态景观中普遍存在的结构。我们展示了用于固定、脱水、干燥、溅射镀膜以及成像这类复杂群落的实验方案。这些方案经过优化，可处理包含植物和真菌生物量以及微生物群落和生物膜的脆弱且异质的样品。

本文介绍了一种简化的可视化方法，用于观察切叶蚁菌园及废弃物样本中的组分，如菌丝、基质、微生物群落和生物膜。扫描电镜（SEM）技术加深了我们对菌园和废弃物如何支撑微生物群落结构模式的理解。图3）。在切叶菌圃中，菌丝是覆盖基质表面部分区域的树枝状结构。由于菌丝通常对脱水和破裂极为敏感，操作者可依据菌丝的形态来评估样品制备的效果。此现象亦见于先前的研究中32,33,45，菌丝呈管状；完整、管状的菌丝表明样品制备有效（图3A 和 图 4C）。当菌丝呈带状时，这种扁平化可能是该技术造成的人工假象（图4C).
植物基质表面可通过角质层和表皮层以及气孔和毛状体来识别。当基质尚未被真菌菌丝和微生物群定殖时，这些结构更易于辨认（图3A 和 图4C）。当基质被定殖后，微生物群和/或真菌菌丝会覆盖其表面，导致特定的植物结构不易分辨（图3A）。微生物群可能定殖于真菌菌丝上或基质表面，二者呈现出明显不同的空间组织模式。图3 中对这些空间模式进行了示意图说明，并在相应扫描电镜（SEM）图像中用方框标出其位置；这有助于将SEM结果与其解释联系起来。
定殖于菌丝的微生物群较为少见，一旦发现，通常由杆状或球状细胞组成，这些细胞孤立存在或以小群体形式附着在菌丝表面。在小团块中可观察到围绕菌丝的生物膜胞外多糖基质（EPS），呈现类似“蕾丝织物”的结构（图3A）。更为常见的是定殖于基质的微生物群，可在不同切叶蚁物种的菌圃中发现。定殖模式在一定程度上由基质降解阶段决定。因此，当微生物群定殖于尚未降解的基质时，可表现为单个细胞或聚集成小群体；而当基质出现显微镜下的降解迹象时（即植物角质层/表皮层及其他植物结构已不可辨识，且沟槽和凹陷大量存在），微生物群可形成层状覆盖于基质表面。
在这些“微生物垫”中，当不存在EPS基质时，细胞的形态更容易识别。而在微生物细胞嵌入EPS基质的情况下，其形态则不易区分。根据其空间结构特征，我们将生物膜表征为“铺展型”或“三维型”。当生物膜呈铺展状态时，微生物细胞与EPS基质间断性地覆盖基底表面，形成一层平坦的、厚度为1–3个细胞的薄层（图3B）。当生物膜呈三维结构时，微生物细胞与EPS基质层层堆积，形成具有多个细胞厚度的聚集体。由退化基质（如老园区域和废弃物）构成的园艺区域，其沟槽与凹陷处为微生物群落提供了庇护所，并在此形成较厚的群落结构（图3C）。特别是废弃物样品中高度降解的基质，容纳了极为丰富的微生物群落，其形态多样性在所有区域中最为显著。酵母菌进一步增加了该群落的复杂性，通过生物膜与原核生物发生直接的物理相互作用。在 Atta sexdens 和 Acromyrmex sp. 的废弃物样品中，观察到EPS基质形成明显的纤维状网状结构，包裹着杆状和球状的原核生物以及纺锤形和球形的酵母菌（图3C）。
由于菌丝相互交织形成网状结构，该菌圃的海绵状构造需要额外进行溅射处理，以使样品表面镀层更加均匀。此类步骤可避免电子散射，从而防止图像失真并提高分辨率（图4A）。样品制备步骤保留了大部分菌圃结构，揭示了微生物群的空间分布与组织方式。然而，有必要再次强调，真菌菌丝和胞外多糖（EPS）基质等结构对脱水极为敏感，极难保存，尤其是在扫描电镜（SEM）观察中。尽管菌丝结构相对保存较好，但仍应合理考虑：在部分菌圃样品中所观察到的生物膜可能缺失EPS基质的某些结构组分。尽管在某些样品中保留了包裹微生物群的最外层光滑多糖结构（图3A、B），但另有一些样品虽保留了微生物的形态特征，却未见EPS基质。然而，目前尚不明确EPS基质是原本缺失，还是在样品制备过程中被去除。
一方面，去除生物膜的光滑表层会损害对生物膜精确结构的理解；另一方面，它能够揭示位于该表层下方细胞的形态、空间排列及其物理相互作用，而这正是我们研究的主要关注点。先前的研究报道，通过使用四氧化锇（OsO₄）可同时保存真菌菌丝和生物膜基质。4以蒸气作为主要固定剂44,50,51,52,53,54然后，我们采用OsO₄对新鲜园艺样品进行固定，开展了一项比较实验。4 蒸气，显然保持了生物膜的平滑外观（图4B然而，该方法导致菌丝和微生物群发生严重压扁，这种压扁造成了先前所描述的菌圃整体空间特征的丧失29,33,32,45，从而限制了对园林结构模式的进一步研究。使用OsO₄固定4 使得微生物形态和分布的区分以及细胞结构与技术假象的辨别均变得困难，从而增加了数据解读的复杂性。
<img alt="菌丝定植、基质扩散、三维基质簇；扫描电镜，真菌菌丝，生物膜胞外多糖基质。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67334/67334fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：微生物群落的结构模式。 微生物群落在空间上可定植于真菌菌丝或基质，呈现不同的空间组织结构。这些空间模式在相应的扫描电镜（SEM）图像中以示意图形式标出（图中以白色方框圈出）：（A）定植于菌丝的微生物群落由孤立或小团状的细胞组成，在部分样品中可检测到生物膜的胞外多糖（EPS）基质。（B）定植于基质的微生物群落在基质上广泛扩散，EPS基质覆盖细胞，导致其形态不易分辨。（C）定植于基质的微生物群落形成三维聚集体，构成单形态或多形态的生物膜，在某些情况下可见EPS基质。插图由Mariana Barcoto绘制。缩写：EPS = 胞外多糖基质。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67334/67334fig03largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="电子散射SEM图像；不同固定剂处理的生物膜纹理对比。菌丝结构分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67334/67334fig04v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：成像失败示例。 图像质量低下导致结果无效和/或阻碍对结构模式的解读。(A) 电子散射使图像失真，降低其分辨率，从而影响形态学鉴定。该现象在仅喷镀一次的样品中频繁出现，通过额外喷镀可减轻。(B) 使用四氧化锇（OsO4）蒸气作为主要固定剂对新鲜园艺样品进行固定44,50,51,52,53,54，看似保留了生物膜的光滑外观，但导致菌丝和微生物群严重压扁，破坏了园艺结构的空间构型。(C) 与使用OsO4相比，采用Karnovsky固定液进行样品制备可获得更高质量的图像，较好地保存了菌丝结构、微生物群分布以及园艺结构的空间模式。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67334/67334fig04largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

我们提出了一种优化的扫描电子显微镜实验方案，用于观察包含植物和真菌生物量以及微生物群和生物膜的高度异质且脆弱的样品。该方案可用于描述微生物群空间结构的维度特征。

在宏观生态系统中，例如雨林或珊瑚礁，生物体的空间定位是我们理解群落结构的基础……

我们研究生活在切叶蚁真菌园中的微生物群落。我们希望了解这些微生物的种类以及它们如何构建这一微生物生态系统。特别是，我们希望了解这些微生物群落与蚂蚁所培育的真菌之间在物理层面如何相互作用。而这些相互作用主要由生物膜介导。蚂蚁培育的微生物园是一种复杂且异质的样本，由培育的真菌、用于培养的基质以及微生物群组成。除了非常脆弱之外，要找到能够保存花园所有组分以用于成像的方法也极具挑战性。我们的研究结果表明，微生物群落整合了真菌园的结构，同时也支持了它们可能参与该环境生理反应的观点。我们还提供了证据，证明生物膜在这些相互作用中具有重要作用。我们的实验方案在保留生物膜中真菌结构的同时，简化了其他操作步骤。然而，该方法能够保持花园结构的精细性，进一步揭示微生物群与基质的物理相互作用，并展现生物膜的空间结构。生物膜是一种细胞系统，其中微生物嵌入胞外多糖（EPS）基质中，形成社会性网络。扫描电子显微镜使我们能够以前所未有的细节观察微生物群在真菌园中的空间组织方式，包括菌丝周围及整个基质表面的分布情况。我们认为，此处建议的制备步骤将被广泛应用于其他微生物生态系统研究的优化。首先，定位并标记切叶蚁物种的蚁群。在蚁巢周围挖掘一条沟槽，直至暴露菌圃室。横向打开花园培养室，以防止土壤在花园表面坍塌。使用昆虫学镊子小心采集花园样本。将花园样本转移至一个干净的塑料容器中，容器内含有一层石膏以平衡湿度。转移花园和蚂蚁工蚁后，将容器密封以防止样品干燥。使用先前移除的土壤填埋沟槽。将花园样品置于23至25摄氏度下保存，直至进一步处理。进行样品固定时，使用昆虫学镊子从园地样品中取出工蚁、卵、蛹和幼虫。将不超过五立方毫米的园地碎片留出，并加入至2毫升离心管中。然后用巴斯德玻璃移液管向管中加入约1毫升卡诺夫斯基固定液，以完全浸没样品。轻轻振荡试管，使样品充分浸透，并在4°C下孵育样品至少24小时。首先，获取含有瘤胃蚁属（attine ant）物种菌落片段的卡诺夫斯基固定液（Karnofsky fixative）样本。固定后，使用玻璃移液管将卡诺夫斯基固定液完全移除，注意不要破坏样本。依次用一毫升浓度递增的乙醇孵育样品，确保样品保持静止。完全去除乙醇后，使用镊子和刮刀小心地将样品转移至临界点干燥仪的样品容器中。盖上容器盖子，并将其浸入盛有足量100%乙醇的刻度玻璃烧杯中，使容器完全浸没。然后将样本容器转移至另一个含有足量100%乙醇的刻度玻璃烧杯中，在室温下孵育10分钟。随后将容器转移至临界点干燥仪中。首先，获取经过临界点干燥处理的切叶蚁物种菌落片段。准备样品台时，用一片铝箔包裹样品台，仅覆盖其顶部。在用双面导电碳胶带覆盖样品台的上部之前，先在每个样品台的底部标记样品编号或代码以进行识别。然后打开样品容器的盖子，使用镊子和刮刀小心地将干燥的样品转移至玻璃培养皿中。将花园样品的碎片小心地放置在覆有胶带的载片黏性表面上。经喷金镀膜后，将载片放入样品台，用于扫描电子显微镜观察。使用屏幕上的选项或手动控制来调整放大倍数和图像位置。移动载物台以全面观察样本。使用RDC功能对特定区域进行聚焦。观察到有趣结构时，应相应调整放大倍数、焦距、亮度、对比度和消像散。为正确进行消像散，使用手动用户界面，在 X 和 Y 方向上移动载物台。调节扫描速率以检查图像分辨率。根据成像部位调整放大倍数。保存图像时，使用冻结功能并点击照片图标。设置图像保存的文件路径。最后，分析至少三个菌圃片段，拍摄所有提及放大倍数范围下的图像。在切叶蚁菌圃中观察到的真菌菌丝呈现为覆盖基质表面的完整管状结构，表明样品制备效果良好。扩散的生物膜则由微生物细胞构成，形成覆盖基质表面的单层至三层细胞的薄层结构。

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科研

JoVE Journal

Biology

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