诱导第三阶段扩散性幼虫的进入 松材线虫 通过渗透调节进入隐生状态

我们的研究主要聚焦于松材线虫扩散型第三阶段幼虫的冷感受机制，重点探讨松材线虫如何在约零下20摄氏度的低温胁迫下存活。目前实验中的关键挑战是脱水时间，该因素对松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）第三阶段扩散型幼虫的存活率具有决定性影响。我们建议，脱水时间越长，效果越佳。

我们已证实，松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）第三阶段扩散性幼虫进入隐生状态后，能够耐受极端低温环境，这凸显了其在恶劣条件下的一种关键生存机制。本实验方案通过诱导松材线虫进入隐生状态并成功实现其结构复苏，填补了该领域的研究空白。该方法可支持对线虫生存机制的可控研究，并拓展其他应用。

本方案简便可靠，可为松材线虫抗逆机制的研究提供强有力的技术支持，相较于其他技术更具可及性和高效性。首先使用锯子将采集的马尾松原木切成厚度为0.5至1厘米的片状，再将这些木片修剪成长度为2至3厘米的小条。

将小木条放入密封袋中，并将袋子存放在实验室中以备后续使用。将橡胶管连接到长约颈玻璃漏斗的窄端，该漏斗的直径约为15厘米。用止水夹固定橡胶管，并将组装好的漏斗放置在漏斗架上。

用单层纸巾完全包裹小木条。将包好的木条放入漏斗中，加入蒸馏水直至所有木条完全浸没，然后缓慢松开漏斗底部的夹子，使 2000 至 5,000 微升的混合液滴入直径为五厘米的培养皿中，用于显微镜检查和形态学鉴定。观察该混合液，通过观察其特征（如口针、食道中腺、脂滴以及指状尾形）来鉴定松材线虫（J3 期 Bursaphelenchus xylophilus）。

使用10微升移液器，每次吸取10微升液体并同时吸取一条线虫，将单个松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）J3幼虫转移至载玻片上。在提取完松材线虫J3幼虫后，对剩余的木条和感染木材材料进行灭菌处理，以防止进一步污染。首先，从马尾松（Pinus massoniana）中提取松材线虫J3幼虫样本，然后配制8%的氯化钾水溶液用于渗透压调节。

使用移液器，将 10 µL 8% 氯化钾水溶液加入含有 J3 期 Bursaphelenchus xylophilus 的载玻片中。将载玻片置于显微镜载物台上，静置使其水分自然蒸发。在显微镜下观察 J3 期 Bursaphelenchus xylophilus 的脱水过程。

观察线虫是否出现身体卷曲和聚集等现象。当水分完全蒸发、氯化钾晶体析出后，观察线虫停止运动并进入隐生状态。将处于隐生状态的松材线虫J3幼虫置于-20摄氏度的恒温环境中保存24小时。

24小时后，使用移液器在经过低温处理的幼虫周围加入约300微升蒸馏水。在显微镜下观察松材线虫J3阶段（Bursaphelenchus xylophilus）的复水过程，监测身体伸展和运动恢复等迹象。