Name: 幼虫 RNA 通过壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒递送对 家蚕 Bombyx 的 干扰 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: 了解通过壳聚糖/dsRNA纳米颗粒饲喂家蚕幼虫实现RNA干扰的方法。该技术可高效沉默BmToll9-2基因，为昆虫基因调控研究和高通量筛选提供省时省力的替代方案。

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本研究由国家自然科学基金（31501898）、广州市科技计划项目（202102010465）、广州市高等教育教学质量与教学改革工程（2022JXGG057）以及广东省高校在线开放课程教学指导委员会研究项目（2022ZXKC381）资助。

1. 家蚕物种及饲养
<ol>
	<li>在 25 ± 1 °C、光周期 12 小时光照:12 小时黑暗、相对湿度 75% ± 5% 的条件下，用新鲜桑叶饲养至少 120 条新孵化的家蚕（B. mori）P50 品系 1龄 幼虫。</li>
</ol>
2. 家蚕幼虫的选择
<ol>
	<li>选择第5天的第1天th 用于RNAi实验的龄期幼虫；家蚕幼虫在5龄第3天后生长迅速th 龄期，适用于比较幼虫形态的差异。 
	注意：也可选用较年轻的阶段，例如3rd 或 4th 龄期幼虫可用于RNAi实验。然而，需要持续进行dsRNA处理直至5龄期th 龄期，相对昂贵且材料成本较高。</li>
</ol>
3. 双链RNA的合成
<ol>
	<li>确定dsRNA靶片段：选择目标基因的编码序列，并与其他同源基因进行比对以确定保守区域。在非保守区域设计基因特异性引物，用于后续dsRNA靶片段的扩增。在昆虫中的RNAi实验中，典型的dsRNA靶片段长度通常为400–600 bp，最小可至200 bp。 
	注意：为提高RNAi实验的效率和成功率，可使用一些基于网络的工具设计dsRNA靶序列，例如dsRNA Engineer（https://dsrna-engineer.cn/）。</li>
	<li>制备PCR产物模板：在上述设计的任一引物的5'端添加T7 RNA聚合酶启动子序列（5'-TAATACGACTCACTATAGG-3'）。通过标准PCR扩增dsRNA靶片段。使用1%琼脂糖凝胶（1x TAE缓冲液）电泳检测，确认获得预期大小的单一PCR产物。随后，使用纯化试剂盒（材料表）纯化PCR产物，并用于后续转录反应。 
	注意：为长期保存靶标PCR产物并获得高产量，建议将PCR产物连接至质粒中。在PCR反应前，质粒应预先线性化。</li>
	<li>生成dsRNA：使用T7 RNAi系统（材料表）生成dsRNA。按照生产商说明书，在室温下加入各组分。轻轻吹打混匀反应体系，于37 °C孵育30分钟。 
	注意：为最大化产量，可在37 °C孵育延长至2–6小时。对于含有二级结构或GC含量较高的模板，可改用42 °C孵育，以提高dsRNA产量。</li>
	<li>退火形成dsRNA：将反应体系于70 °C孵育10分钟，然后缓慢冷却至室温（约20分钟），以完成dsRNA的退火。</li>
	<li>DNase和RNase处理：取1 µL提供的RNase溶液加入199 µL无核酸酶水中，配制新鲜稀释的RNase溶液。每20 µL反应体系中加入1 µL新鲜稀释的RNase溶液和1 µL提供的RQ1无RNase DNase，轻轻混匀后于37 °C孵育30分钟。此步骤可去除反应中的单链RNA（ssRNA）和模板DNA。</li>
	<li>醇沉淀：向反应体系中加入等体积异丙醇或2.5倍体积的95%乙醇，以及0.1倍体积的3 M醋酸钠（pH 5.2）。涡旋混匀后置于冰上孵育5分钟，形成浑浊沉淀物。在离心机中以最大速度离心10分钟，收集管底白色沉淀。弃去上清液，用0.5 mL预冷的70%乙醇洗涤沉淀，以去除残留盐分。洗去乙醇后，将沉淀在室温下晾干15分钟。用无核酸酶水以初始反应体积的2–5倍重悬沉淀。储存于-20 °C或-70 °C。 
	注意：dsRNA沉淀不宜过度干燥，否则难以完全重悬。为确保充分溶解，重悬体积至少应为沉淀体积的2倍。</li>
	<li>dsRNA的定量与质量检测：将dsRNA用无核酸酶水按1:100至1:300比例稀释。根据生产商说明书，使用微量分光光度计（材料表）测定dsRNA浓度。定量时，将测得浓度乘以体积即可。为评估dsRNA质量，采用琼脂糖凝胶电泳分析。配制1%琼脂糖凝胶（1x TAE缓冲液），将dsRNA用无核酸酶水按1:50稀释。每泳道上样5 µL稀释后的dsRNA，用0.5 mg/mL溴化乙锭染色至少15分钟进行可视化观察。 
	注意：dsRNA在凝胶中的迁移速度比dsDNA更慢。</li>
</ol>
4. 壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒的制备
<ol>
	<li>在室温下，配制 100 mM 醋酸钠缓冲液（0.1 M NaC2H3O2 和 0.1 M 醋酸，pH 4.5，溶于去离子水）和 100 mM 硫酸钠缓冲液（100 mM Na2SO4 溶于去离子水）。</li>
	<li>将市售壳聚糖（来源于虾壳，脱乙酰度 ≥75%；材料表）溶于 100 mM 醋酸钠缓冲液中，配制成 0.02%（w/v）的壳聚糖溶液。</li>
	<li>将 20 µg 的 dsRNA 溶于 50 µL 无核酸酶水中，然后加入 50 µL 100 mM 硫酸钠缓冲液，最终得到 100 µL 的 dsRNA 溶液。</li>
	<li>将 100 µL 壳聚糖溶液加入 100 µL dsRNA 溶液中。同时，通过将 100 µL 壳聚糖溶液加入 100 µL 50 mM 硫酸钠缓冲液中制备对照组。混合后，在 55 °C 下加热 1 分钟。</li>
	<li>立即使用高速涡旋振荡器剧烈振荡混合物 30 秒，以促进纳米颗粒的形成。</li>
	<li>在室温下以 13,000 x g 离心 10 分钟，获得白色沉淀。将上清液转移至新的 1.5 mL 离心管中。让沉淀在室温下静置干燥 10 分钟。</li>
	<li>使用微量分光光度计测定上清液中 dsRNA 的浓度（材料表），以对照组的上清液作为空白对照。将浓度乘以体积，计算上清液中残留的 dsRNA 总量。通过将上清液中残留的 dsRNA 量除以初始加入的 dsRNA 量，计算纳米颗粒中 dsRNA 的包封率。 
	注意：尽管纳米颗粒可在 4–37 °C 下保存至少 15 天后再使用14，但仍建议尽快使用。</li>
</ol>
5. 用壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒饲喂家蚕幼虫
<ol>
	<li>挑选刚蜕皮的5龄幼虫th 五龄蚕幼虫（即五龄第1天）th 选择相同大小的同龄幼虫用于摄食实验。将幼虫分别放入6孔板的每个孔中，盖上盖子后饥饿处理24小时。</li>
	<li>用去离子水冲洗新鲜桑叶，并用干净的厨房纸巾擦干。桑叶应完全干燥，无水滴残留。将桑叶切成 1 cm × 1 cm 的叶盘。</li>
	<li>将壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒在使用前溶于无核酸酶水，配制成 500 ng/µL 的溶液。用等体积的无核酸酶水稀释对照用壳聚糖纳米颗粒（按 4.4 步骤制备）。将裸 dsRNA 用无核酸酶水配制成 500 ng/µL 的溶液。</li>
	<li>使用壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒进行RNAi基因沉默实验，以不含dsRNA的壳聚糖纳米颗粒作为空白/阴性对照。使用裸dsRNA与壳聚糖/dsRNA纳米颗粒进行比较，以分析两者之间的差异。</li>
	<li>分别将10 µL的壳聚糖/dsRNA纳米颗粒、壳聚糖和裸露dsRNA涂布于每片叶盘表面。室温下将纳米颗粒溶液和dsRNA溶液在叶盘上风干5分钟。</li>
	<li>每天为每只幼虫提供一片纳米颗粒包被或dsRNA包被的叶盘。连续5天持续向幼虫提供纳米颗粒包被或dsRNA包被的叶盘。每天待幼虫将包被叶盘完全食尽后，可补充新鲜的桑叶。</li>
	<li>第6天，将幼虫置于冰上麻醉至不再活动，解剖幼虫进行取样。在洁净的培养皿中用剪刀剪下胸部，用镊子取出中肠。清除中肠内容物，并在另一含有无核酸酶水的培养皿中清洗中肠。将中肠置于1.5 mL离心管中，于-70 °C保存。</li>
</ol>
6. 基因沉默效果的验证
<ol>
	<li>采用定量实时 PCR（qRT-PCR）进行相对转录本定量分析。每个生物学重复至少需要三个技术重复，且至少设置三个生物学重复。建议使用至少两个参考基因对相对转录本水平进行标准化。 家蚕 Toll9-2BmToll9-2) 基因进行检测。通过将相对转录本的平均值与对照组比较，并转换为百分比，评估基因沉默效率。 
	注意：qRT-PCR 扩增条件、引物信息及相对转录本计算方法可参见我们近期的发表文章20.</li>
	<li>分析RNAi表型以评估基因沉默效果。观察幼虫和茧的大小。每天拍照记录外观。 
	注意：RNAi 可影响形态、变态、生理和行为。RNAi 相关表型的观察取决于所靶向的基因。</li>
</ol>

Nanoparticle-Mediated dsRNA Feeding for Gene Silencing in Silkworm Larvae

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<li>Yokoi, K., Tsubota, T., Jouraku, A., Sezutsu, H., Bono, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+transcriptome+data+in+silkworm+bombyx+mori%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">Reference transcriptome data in silkworm bombyx mori.</a> Insects. 12 (6), (2021).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

合适的观察阶段对于RNAi表型的观察至关重要，具体取决于靶向的基因。我们的初步结果表明 Toll9-2 参与家蚕的生长过程。五龄期家蚕幼虫的体型和体重迅速增加。th 龄期21因此，5th 选择三龄幼虫作为壳聚糖/dsRNA纳米颗粒饲喂实验的阶段。也可选择3rd 或 4th 用于饲喂实验的龄期幼虫，并观察其在5龄时的发育差异th 龄期。然而，纳米颗粒喂养实验需要每日持续喂养14. 在幼虫较早阶段进行饲喂需要更多的dsRNA制备量，成本相对较高。基于上述原因，我们建议选择刚蜕皮的五龄家蚕幼虫作为实验材料th 以龄期作为纳米颗粒喂养实验的起始点。
优化纳米颗粒的饲喂参数也十分重要。目前的研究中，通常采用持续5-7天的纳米颗粒饲喂以实现高效的RNA干扰14,18,22,23。由于dsRNA是RNA干扰实验中最昂贵的组分，可考虑每隔一天饲喂一次纳米颗粒，这可能使dsRNA制备成本降低一半。另一种降低成本的方法是优化饲喂过程中使用的dsRNA用量。本实验方案中，每头幼虫使用5 µg壳聚糖/dsRNA纳米颗粒，该剂量是实验室中dsRNA注射的通用剂量。考虑到5 µg的dsRNA属于较高剂量，且通过纳米颗粒饲喂已能实现显著的基因沉默效果，建议在实验中减少dsRNA的使用量。然而，上述两个参数对RNA干扰效率的具体影响仍有待后续实验进一步评估。
壳聚糖与双链RNA的比例可以进行优化。在本方案中，将100 µL醋酸钠溶液中的20 µg壳聚糖与100 µL硫酸钠溶液中的20 µg双链RNA混合。在首篇关于壳聚糖/双链RNA纳米颗粒的报道中，将100 µL醋酸钠溶液中的20 µg壳聚糖与100 µL硫酸钠溶液中的32 µg双链RNA混合16。在其他一些报道中，将100 µL醋酸钠溶液中的1 µg壳聚糖与100 µL硫酸钠溶液中的1 µg双链RNA混合18,23。因此，壳聚糖和双链RNA的用量可进一步优化，以实现纳米颗粒最佳的载药效率和最优的RNA干扰沉默效果。
需要考虑壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒的保存条件。壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒应在饲喂实验前制备，并建议立即使用。最近有报道称，壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒在 4 °C、24 °C 和 37 °C 下保存 15 天后仍保持稳定19。因此，壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒可预先制备，并在冰箱中于 4 °C 保存，因为 dsRNA 在低温条件下更稳定。
除了双链RNA（dsRNA）外，一些小RNA分子，如小干扰RNA（siRNA）和短发夹RNA（shRNA），也可用于制备RNA干扰实验中的纳米颗粒。例如，siRNA纳米颗粒可提高植物对Pseudomonas syringae24的抗性。递送shRNA纳米颗粒在新热带褐蝽Euschistus heros25中成功诱导了RNA干扰效应。因此，纳米颗粒可应用于RNA干扰实验中使用的任何RNA分子。
据报道，包括家蚕在内的鳞翅目昆虫的RNAi效率较低26。在家蚕中，dsRNA的递送只能通过注射方式进行，耗时且劳动成本高。采用这种壳聚糖/dsRNA纳米颗粒递送方法后，在家蚕幼虫和蚕茧中均观察到显著的转录水平或表型沉默效应，这可能得益于壳聚糖对dsRNA的保护作用，减少了其降解19。该方法操作简便、节省人力，可推广应用于其他昆虫。本实验方案的简便性不仅适用于科学研究，也可用于课堂教学演示与实践。纳米颗粒递送技术为未来的生物防治和害虫管理提供了新的方向27。

家蚕（Bombyx mori）是一种约5000多年前在中国驯化的昆虫。由于其产丝能力，家蚕在中国农业和蚕业中是一种重要的经济昆虫。在家用模式昆虫中，家蚕的重要性仅次于果蝇。作为鳞翅目中的模式昆虫，家蚕易于饲养，个体较大，且具有丰富的突变体资源。同时，家蚕是首个完成全基因组测序的鳞翅目昆虫1。目前已有大量公开数据库，提供家蚕基因组2、转录组3、表达序列标签（EST）4、非编码RNA5以及微卫星序列6等相关信息。上述特点使家蚕成为遗传学研究的理想模式生物。
RNA干扰（RNAi）是一种细胞过程，其中双链RNA（dsRNA）分子结合并切割互补的信使RNA（mRNA），从而实现靶基因的沉默效应。该机制天然存在于细菌中，用于抵御病毒入侵7。随后发现，RNAi在动物、植物和微生物中均具有保守性。由于其强大的序列特异性沉默效应，RNAi被广泛应用于基础研究中，以调控基因表达并研究基因功能。RNAi通过将dsRNA递送至细胞内而实现。
在昆虫中，递送dsRNA的三种常用方法是显微注射、饲喂和浸泡8。目前，家蚕中通过裸露dsRNA递送实现成功RNA干扰的报道主要采用dsRNA注射方式9。显微注射的优点是可将dsRNA直接递送至血淋巴，并能精确控制dsRNA的用量。然而，显微注射也存在一些缺点，例如耗时较长，且需要精密的设备。此外，还需优化注射针头、注射体积以及dsRNA的用量。因此，有必要开发一种替代方法向家蚕递送dsRNA。由于昆虫的外骨骼是由几丁质构成的防水屏障，通过浸泡幼虫实现RNA干扰的报道极少，因此该方法在昆虫RNA干扰中并非理想选择。饲喂dsRNA具有省力、成本低且操作简便的优点10，也适用于高通量基因筛选11。然而，研究发现家蚕幼虫的中肠及中肠液中存在一种DNA/RNA非特异性核酸酶，即BmdsRNase12，该酶能够优先降解dsRNA13。因此，通过饲喂裸露dsRNA来沉默家蚕基因表达似乎较为困难。
最近，纳米颗粒包被的双链RNA被证明是通过饲喂方式提高RNA干扰效率的一种良好替代方法14。壳聚糖是一种廉价、无毒且可生物降解的聚合物，可通过甲壳素脱乙酰化制备；甲壳素是一种天然存在的生物聚合物，其丰度在自然界中仅次于纤维素15。由于壳聚糖中的氨基带正电荷，而双链RNA骨架上的磷酸基团带负电荷，因此壳聚糖/dsRNA纳米颗粒可通过多聚阳离子的自组装形成16。壳聚糖/dsRNA纳米颗粒在通过幼虫饲喂实现RNA干扰方面具有显著效果，已在埃及伊蚊Aedes aegypti和冈比亚按蚊Anopheles gambiae17、棉铃斑喙象Earias vittella18以及朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus19中得到验证。
为了建立通过饲喂法向家蚕递送双链RNA（dsRNA）并实现有效RNA干扰（RNAi）效率的方法，本文重点描述了制备壳聚糖/dsRNA纳米颗粒以及将这些纳米颗粒饲喂给家蚕幼虫的逐步操作流程。该方法成本相对较低、节省人力且易于操作，可适用于其他昆虫的基因沉默研究。本研究旨在为鳞翅目昆虫提供一种更简便且RNAi效率更高的dsRNA递送方案。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>Sangon</td><td>F601620</td><td>用于 dsRNA 或纳米颗粒反应</td></tr><tr><td>10 &amp;mu;L 移液器</td><td>Eppendorf</td><td>P13473G</td><td>用于吸取或重悬液体</td></tr><tr><td>100 &amp;mu;L 移液器</td><td>Eppendorf</td><td>Q12115G</td><td>用于吸取或重悬液体</td></tr><tr><td>2.5 &amp;mu;L 移液器</td><td>Eppendorf</td><td>P20777G</td><td>用于吸取或重悬液体</td></tr><tr><td>20 &amp;mu;L 移液器</td><td>Eppendorf</td><td>H19229E</td><td>用于吸取或重悬液体</td></tr><tr><td>200 &amp;mu;L 移液器</td><td>Eppendorf</td><td>H20588E</td><td>用于吸取或重悬液体</td></tr><tr><td>6 孔透明 TC 处理多孔板</td><td>Costar</td><td>3516</td><td>用于单独饲养家蚕</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Aladdin</td><td>A116165</td><td>用于配制 TAE 缓冲液</td></tr><tr><td>琼脂糖 M</td><td>BBI Life Sciences</td><td>A610013</td><td>用于琼脂糖凝胶电泳</td></tr><tr><td>分析天平</td><td>Sartorius</td><td>BSA224S</td><td>用于称量试剂</td></tr><tr><td>离心机&amp;nbsp;</td><td>Sartorius</td><td>Centrisart A-14C</td><td>用于离心形成 dsRNA 或纳米颗粒</td></tr><tr><td>壳聚糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3646</td><td>与 dsRNA 结合用于制备纳米颗粒</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sangon</td><td>A500895</td><td>用于配制 TAE 缓冲液</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Aladdin</td><td>E130059</td><td>用于配制 TAE 缓冲液或 dsRNA 沉淀</td></tr><tr><td>冷冻柜</td><td>Siemens</td><td>iQ300</td><td>用于储存 dsRNA 或纳米颗粒</td></tr><tr><td>GoTaq Green Master Mix</td><td>Promega</td><td>M712</td><td>用于 PCR 反应</td></tr><tr><td>GoTaq qPCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>A6002</td><td>用于 qRT-PCR 反应</td></tr><tr><td>异丙醇&amp;nbsp;</td><td>Aladdin</td><td>I112011</td><td>用于 dsRNA 沉淀</td></tr><tr><td>NanoDrop 微量紫外-可见分光光度计</td><td>ThermoFisher</td><td>One</td><td>用于测定 dsRNA 浓度</td></tr><tr><td>pH 计</td><td>Sartorius</td><td>&amp;nbsp;PB-10</td><td>用于缓冲液配制</td></tr><tr><td>SanPrep 柱式 PCR 产物纯化试剂盒</td><td>Sangon</td><td>B518141</td><td>用于 PCR 产物纯化</td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td>用于配制 100 mM 乙酸钠缓冲液</td></tr><tr><td>硫酸钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239313</td><td>用于配制 100 mM 硫酸钠缓冲液</td></tr><tr><td>T7 RiboMAX Express RNAi 系统</td><td>Promega</td><td>P1700</td><td>用于 dsRNA 合成</td></tr><tr><td>ThermoMixer 恒温混匀仪</td><td>Eppendorf</td><td>C</td><td>用于 dsRNA 制备或纳米颗粒加热</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sangon</td><td>A501492</td><td>用于配制 TAE 缓冲液</td></tr><tr><td>涡旋振荡器&amp;nbsp;</td><td>IKA</td><td>Vortex 3</td><td>用于制备壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒</td></tr></tbody></table>

通过壳聚糖/dsrna 纳米颗粒递送实现家蚕 bombyx mori 的幼虫rna干扰

Larval RNA Interference in Silkworm Bombyx mori through Chitosan/dsRNA Nanoparticle Delivery

家蚕（Bombyx mori）是一种在中国具有数千年历史的重要经济昆虫。同时，家蚕也是鳞翅目昆虫中的模式生物，其基础研究积累较为丰富。它是鳞翅目中首个完成全基因组测序与组装的昆虫，为基因功能研究提供了坚实的基础。尽管RNA干扰（RNAi）技术已广泛应用于基因功能的反向研究中，但在家蚕及其他鳞翅目物种中，该技术的应用仍较为困难。以往成功实现RNAi的相关研究仅通过显微注射方式递送双链RNA（dsRNA），尚无通过饲喂方式递送dsRNA的报道。本文详细描述了制备壳聚糖/dsRNA纳米颗粒并经口饲喂家蚕幼虫的逐步操作流程。本实验方案包括：（i）选择合适发育阶段的家蚕幼虫，（ii）合成dsRNA，（iii）制备壳聚糖/dsRNA纳米颗粒，以及（iv）通过饲喂方式将壳聚糖/dsRNA纳米颗粒给予家蚕幼虫。文中展示了代表性结果，包括基因转录水平的验证和表型观察。dsRNA饲喂是一种在家蚕幼虫中实现RNA干扰的简便技术。由于家蚕幼虫易于饲养且个体较大，便于操作，因此是展示昆虫幼虫期RNAi的理想模型。此外，该技术操作简便，有助于激发更多学生参与科研实践，使家蚕幼虫成为课堂教学中理想的遗传学实验体系。

为评估RNAi效率，选择靶向免疫基因BmToll9-2进行分析。BmToll9-2基因在本实验室已有深入研究，且根据我们近期发表的研究结果20，通过注射dsRNA可实现该基因的沉默，并导致幼虫体型变小、体重减轻。为验证通过壳聚糖/dsRNA纳米颗粒经口摄入途径实现RNAi的效果，实验设置了壳聚糖纳米颗粒作为对照组，同时比较了裸dsRNA的干扰效果。
与对照组相比，不含dsRNA的壳聚糖纳米颗粒以及裸露的靶向dsRNA BmToll9-2 基因未表现出沉默效应。通过饲喂壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒可显著抑制家蚕中该基因的转录水平，敲低效率达 79%图1相对转录本的抑制表明 BmToll9-2 通过壳聚糖/dsRNA 摄入成功实现了基因沉默。
BmToll9-2 基因的敲低显著影响家蚕的生长发育。观察幼虫时可见，BmToll9-2 基因沉默的幼虫体型小于对照组幼虫（图2A）。在比较蚕茧时，BmToll9-2 基因沉默的蚕茧也更小（图2B）。壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒在家蚕的转录水平和表型水平均表现出有效的RNA干扰效应。
<img alt="柱状图比较相对转录水平：对照组 vs. 游离dsRNA vs. 壳聚糖/dsRNA。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67360/67360fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：相对转录本 BmToll9-2 壳聚糖/dsBmToll9-2 纳米颗粒处理后 摄入 B. mori 5th 龄幼虫 相对mRNA水平 BmToll9-2 在分别饲喂壳聚糖纳米颗粒（对照组）、裸露dsRNA以及壳聚糖/dsRNA纳米颗粒的幼虫中，数据表示为三次生物学重复的平均值±标准差。每次生物学重复包含三次技术重复。柱状图上不同的字母表示基于单因素方差分析（one-way ANOVA）的显著性差异。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67360/67360fig01largev2.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="壳聚糖/dsRNA 处理对家蚕生长和蚕茧形成的影响；实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67360/67360fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：饲喂壳聚糖/dsBmToll9-2 纳米颗粒后的表型观察。以壳聚糖纳米颗粒作为对照。(A) 家蚕幼虫摄取纳米颗粒后的外观。(B) 家蚕幼虫摄取纳米颗粒后形成的蚕茧外观。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67360/67360fig02largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种通过摄食途径在家蚕 Bombyx mori 幼虫中递送壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒以诱导基因沉默的实验方案。

通过壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒递送实现家蚕 Bombyx mori 的幼虫RNA干扰

家蚕（Bombyx mori）是一种具有数千年历史的重要经济昆虫，在中国有着悠久的养殖历史。同时，家蚕也是……的模式昆虫。

本研究的目的是建立一种向家蚕（Bombyx mori）幼虫喂食dsRNA的方法，以实现基因沉默效应。这将有助于基因调控研究和高通量基因筛选。壳聚糖是一种廉价、无毒且可生物降解的聚合物。壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒通过饲喂蚊虫已被证实可有效引发RNAi效应。在家蚕中，迄今为止RNAi仅能通过注射dsRNA实现，然而该方法需要足够数量且经过验证的注射设备。该技术也耗时较长。取食是昆虫的一种自然行为。通过喂食壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒使家蚕产生基因沉默效应，此前从未见报道。此外，该技术节省人力、成本低廉且操作简便。首先，在去离子水中将 0.1 摩尔的醋酸钠与 0.1 摩尔的醋酸混合，调节 pH 至 4.5。然后，在室温下用去离子水配制 100 毫摩尔的硫酸钠缓冲液。称取市售壳聚糖，配制0.02%（重量/体积）的溶液，并将其溶解于已配制的100毫摩尔/升乙酸钠缓冲液中。然后，将20微克双链RNA（dsRNA）溶解于50微升无核酸酶水中。将该溶液加入50微升硫酸钠缓冲液中，制成100微升的dsRNA溶液。接下来，将100微升制备好的壳聚糖溶液分别加入100微升的dsRNA溶液和50毫摩尔硫酸钠溶液中。混合后，在55摄氏度下加热溶液1分钟。立即高速涡旋振荡混合物30秒，以促进纳米颗粒的形成。在室温下以 13,000 G 离心混合物 10 分钟，以获得白色沉淀。将上清液转移至新的 1.5 毫升离心管中，并将沉淀在室温下晾干 10 分钟。使用微量分光光度计测定上清液中 dsRNA 的浓度。为计算双链RNA的包封率，将上清液中剩余的双链RNA量除以初始加入的双链RNA量。首先，制备用于喂食家蚕幼虫的壳聚糖-双链RNA纳米颗粒。随后，挑选大小相近、刚蜕皮进入五龄期的家蚕幼虫进行喂食实验。将每只幼虫单独放入六孔板的孔中。盖好板，饥饿处理幼虫24小时。随后，用去离子水冲洗新鲜桑叶，并用干净的厨房纸巾将其晾干。将完全干燥的叶片切成1厘米×1厘米的叶圆片。使用前，将壳聚糖dsRNA纳米颗粒溶于无核酸酶水中，浓度为500纳克/微升。分别将10微升壳聚糖/dsRNA纳米颗粒、对照壳聚糖纳米颗粒和裸dsRNA涂布于每片桑叶圆片表面。将溶液在室温下静置干燥于叶盘上，持续五分钟。随后，每天为每只幼虫提供一个纳米颗粒包被或dsRNA包被的叶盘。每天当包被叶盘被幼虫完全摄食后，更换新鲜的桑叶。第六天，将幼虫置于冰上直至其不再活动。解剖幼虫时，在洁净的培养皿中用剪刀剪去胸部，并用镊子取出中肠。清除内容物后，用无核酸酶的水在培养皿中清洗中肠。将中肠组织置于1.5毫升离心管中，在零下70摄氏度条件下冷冻保存。在家蚕中饲喂壳聚糖/dsRNA纳米颗粒后，与对照处理相比，BmToll9-2基因的转录水平降低了79%。经BmToll9-2沉默的壳聚糖/dsRNA纳米颗粒处理的家蚕幼虫，其体型明显小于对照组幼虫。BmToll9-2基因沉默幼虫所结的蚕茧也显著小于对照组。

larval-rna-interference-silkworm-bombyx-mori-through-chitosandsrna

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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