Name: 通过体外泛素链切割测定法测量神经发育障碍相关去泛素化酶的酶活性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: 学习使用体外泛素链切割测定法测量神经发育障碍相关去泛素化酶的酶活性。该方法结合重组蛋白纯化技术，无需预先了解底物即可直接评估基因变异对DUB催化功能的影响。

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本工作由Sanford Research为FB提供的启动资金以及NIH资助R01CA233700（授予MJS）支持。插图由Felipe G. Serrano（www.illustrative-science.com）完成。&#160;我们感谢Greg Findlay博士（邓迪大学&#160;）提供GST-USP27X质粒。

以下方案可针对在不同感受态细胞菌株中表达的带有各种亲和标签的重组蛋白进行调整。根据所表达蛋白的不同，培养及过夜表达条件可能需要对诱导表达时的OD600、表达时间、表达温度和IPTG浓度进行优化。本方案的总体流程如图1所示。本研究中所用试剂与设备的详细信息列于材料表中。
1. 将重组 GST-USP27X 表达质粒转化至感受态 Rosetta 2 E. coli 细胞
注意：为保持细菌培养物的无菌状态，所有打开培养基容器的操作均须在本生灯火焰下进行。为实现最佳氧气传递，细菌培养振荡应在台式温控摇床中进行，振荡直径为 19 mm 至 50 mm，转速为 200 rpm29。
<ol>
	<li>使用前立即在冰上解冻 20 µL 化学感受态 Rosetta 2 E. coli 细胞。加入 1–10 ng pGEX6P1-USP27X 表达质粒（编码N端谷胱甘肽-S-转移酶（GST）30 标签标记的 USP27X，并含有氨苄青霉素抗性基因），冰上孵育 5 分钟。</li>
	<li>在 42 °C 干浴中热激 30 秒，然后在冰上孵育 2 分钟。</li>
	<li>加入 80 µL 室温（RT）SOC 培养基，在 37 °C、200 rpm 振荡条件下，于 19 mm 轨道台式温控摇床中孵育 60 分钟。</li>
	<li>取 50 µL 菌液涂布于含有 25 µg/L 氯霉素和 50 µg/L 氨苄青霉素的 LB 琼脂平板上，倒置平板，在 37 °C 温控培养箱中孵育 20 小时。</li>
</ol>
2. 从表达质粒进行重组蛋白的过夜细菌表达
注意事项：为保持细菌培养物的无菌状态，所有需打开培养基容器的操作均应在本生灯火焰下进行。为实现最佳氧气传递，将细菌培养物置于轨道半径为19 mm至50 mm、转速为200 rpm29的台式温控摇床中振荡培养。使用分光光度计测定培养物在600 nm处的光密度（OD600）。
<ol>
	<li>在2 L带挡板的培养瓶中，将47.6 g TB粉末加入含0.4%甘油的1 L超纯水中，配制1 L terrific broth（TB）培养基。121 °C高压灭菌30 min，冷却至室温。</li>
	<li>挑取一个转化后的单菌落，接种于10 mL含25 µg/L氯霉素和50 µg/L氨苄青霉素的无菌LB培养基中。在19 mm轨道振荡器中，37 °C、200 rpm振荡培养20 h。</li>
	<li>将10 mL过夜培养物按1:100的比例接种至1 L含25 µg/L氯霉素和50 µg/L氨苄青霉素的TB培养基中（起始培养物与表达培养物之比为1:100）。在19 mm轨道振荡器中，37 °C、200 rpm振荡培养，直至菌液OD600达到0.5–0.6。</li>
	<li>向培养物中加入50 µM IPTG以诱导蛋白表达，将温度降至16 °C，在16 °C、200 rpm条件下继续振荡培养20 h。</li>
	<li>在≥3,000 × g、4 °C条件下离心20 min，收集表达培养物中的菌体沉淀。将沉淀在-80 °C保存至少1 h。 
	注意：此时实验可暂停并择期继续（建议在同周内完成）。沉淀物可在-80 °C长期保存。</li>
</ol>
3. 通过重力流亲和柱进行蛋白质纯化
注意：每种蛋白纯化所用的树脂、结合缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液和保存缓冲液需根据目标重组蛋白的特性进行选择。使用 SDS-PAGE 缓冲液收集细胞沉淀、上清液、穿流组分、洗涤组分及洗脱组分的样品。对样品进行 SDS-PAGE 电泳及考马斯亮蓝染色，以评估纯化效果。纯化过程应在 4 °C 下进行，所有组分需置于冰上操作。蛋白标签的切除可通过相应的蛋白酶在柱内或柱外进行，靶向特定蛋白酶的切割位点。
<ol>
	<li>将空的重力流层析柱固定在铁架台上，并装入谷胱甘肽琼脂糖树脂。每纯化1 L表达培养物收集的细胞沉淀，使用2–3 mL树脂。</li>
	<li>用一个柱床体积的20%乙醇洗涤层析柱。再用一个柱床体积的MS500缓冲液（20 mM Tris pH 7.5，500 mM NaCl，0.5 mM TCEP）洗涤层析柱3次。在准备细胞沉淀期间，保持缓冲液覆盖树脂，防止树脂干燥。</li>
	<li>在4 °C下解冻细胞沉淀。向解冻后的沉淀中加入30 mL MS500缓冲液（20 mM Tris pH 7.5，500 mM NaCl，0.5 mM TCEP，60 mg溶菌酶和一片蛋白酶抑制剂片剂）。在4 °C下轻轻翻转旋转裂解30分钟。</li>
	<li>在冰上将裂解后的细胞在50 mL离心管或金属烧杯中进行超声处理，直至从移液枪头滴出的裂解液可自由流动。在4 °C下以≥20,000 × g离心30分钟，以澄清上清液。 
	注意：超声条件需通过实验确定。调节超声仪参数，使总超声时间120秒足以将黏稠的裂解液转化为流动性好且透明的液体。</li>
	<li>将上清液倒入烧杯中，上样至层析柱。通过重力流使澄清的裂解液流过层析柱，同时收集穿流液。将收集的穿流液再次上样并通过层析柱。</li>
	<li>用至少两个柱床体积的MS500洗涤缓冲液（20 mM Tris pH 7.5，500 mM NaCl，0.5 mM TCEP）洗涤层析柱，共洗5次。每次收集5 mL洗脱液组分。向每组分中各取1 µL加入100 µL Bradford试剂中，肉眼观察是否有蛋白存在。持续洗涤直至最后一次洗脱液中不再检测到未结合蛋白，必要时增加洗涤步骤。</li>
	<li>使用MS500洗脱缓冲液（MS500缓冲液中添加10 mM谷胱甘肽和10 mM NaOH）流过层析柱以回收蛋白，收集5 mL洗脱组分。取1 µL洗脱液加入100 µL Bradford试剂中检测蛋白存在情况。当Bradford试剂不再显示蛋白存在时，停止收集组分。</li>
	<li>通过沉淀和离心进行缓冲液置换。向洗脱液中加入2倍体积的4 M硫酸铵，轻轻颠倒混匀至出现浑浊，然后在4 °C下以≥20,000 × g离心30分钟，再重复离心5分钟。每次离心后小心去除上清液，避免扰动蛋白沉淀。</li>
	<li>将蛋白重新溶解于含25%甘油的MS500缓冲液中并储存。将蛋白沉淀或含储存缓冲液的蛋白在-80 °C下保存。</li>
</ol>
4. 体外 泛素链切割实验
注意：应根据先前文献报道31或实验确定的去泛素化酶（DUB）特异性，选择泛素链长度和连接类型。如有必要，本方案可用于检测目标野生型DUB对一系列 commercially available、具有明确长度和连接类型的泛素链的活性。实验起始条件可采用375–750 ng的双泛素链和1–2 µM的DUB浓度27。
<ol>
	<li>配制10x DUB激活缓冲液（500 mM Tris-HCl pH 7.5，500 mM NaCl，100 mM TCEP）。</li>
	<li>针对每种DUB的每个时间点，配制总体积为10 µL的DUB反应混合液，其中含2 µM纯化的GST-USP27X，溶于1x DUB激活缓冲液（DUB混合液）。先配制总混合液，再分装至各时间点。</li>
	<li>将DUB混合液在室温下孵育10分钟。</li>
	<li>在加入泛素链之前，向“时间0”样品中加入7 µL SDS-PAGE上样缓冲液，以防止去泛素化反应启动。</li>
	<li>向每种DUB的每个时间点反应体系中加入375 ng K-63二聚泛素链，该泛素链已用10 µL 1x DUB激活缓冲液稀释。每反应体系总体积为20 µL。</li>
	<li>将反应管在30 °C孵育，并在各时间点分别加入7 µL SDS-PAGE上样缓冲液以终止反应。</li>
	<li>使用4%–12%梯度凝胶进行SDS-PAGE电泳，并对泛素和USP27X进行免疫印迹7,32，以分析所选时间点中单泛素含量的变化。</li>
</ol>
<img alt="蛋白质纯化流程图：转化、表达、裂解、亲和层析、SDS-PAGE分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67367/67367fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1研究设计示意图。 (A感受态细胞的转化 E. coli 带有重组蛋白表达质粒的细胞。B) 重组去泛素化酶蛋白的细菌过夜表达。C) 利用重力流亲和层析柱纯化重组去泛素化酶蛋白。D) 体外 泛素链切割实验以评估去泛素化活性 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67367/67367fig01largev2.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

Assessing DUB Variants in Neurodevelopmental Disorders Using a Cleavage Assay

<ol><li>Morris-Rosendahl, D. J., Crocq, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodevelopmental+disorders%3A+the+history+and+future+of+a+diagnostic+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Dialogues+Clin+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurodevelopmental disorders: the history and future of a diagnostic concept.</a> Dialogues Clin Neurosci. 22 (1), 65-72 (2020).</li>
<li>Ebstein, F., Küry, S., Papendorf, J. J., Krüger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodevelopmental+disorders+%28NDD%29+caused+by+genomic+alterations+of+the+ubiquitin-proteasome+system+%28UPS%29%3A+the+possible+contribution+of+immune+dysregulation+to+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurodevelopmental disorders (NDD) caused by genomic alterations of the ubiquitin-proteasome system (UPS): the possible contribution of immune dysregulation to disease pathogenesis.</a> Front Mol Neurosci. 14, 733012(2021).</li>
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<li>Pickart, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying ubiquitination.</a> Annu Rev Biochem. 70 (1), 503-533 (2001).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

本文介绍了一种重组USP27X去泛素化酶（DUBs）的表达与纯化实验方案，以及一种 体外 泛素链切割实验用于比较野生型USP27X与神经发育障碍相关变异体蛋白的去泛素化活性。该实验确定，与XLID105相关的变异体会破坏USP27X的催化活性7这一机制性发现帮助我们将XLID105定义为一种由USP27X功能障碍引起的疾病。
该方案可适用于其他与遗传性疾病相关但分子机制尚不明确的去泛素化酶（DUB）。针对特定目标DUB优化其表达与纯化方案至关重要。若尚无针对某一特定DUB的详细实验方案报道，本文所述方法可作为起始参考。在优化蛋白表达与纯化流程时，关键步骤包括选择适当的参数：（1）表达系统（如细菌菌株、昆虫细胞或哺乳动物细胞），（2）表达载体，（3）所用标签及亲和树脂，（4）培养条件，（5）培养物用量，以及（6）是否需要进一步纯化（如 通过 尺寸排阻或离子交换色谱）。关于该方法这些及其他方面的具体建议已有讨论33.
的 体外 泛素链切割实验是测量野生型或突变型去泛素化酶（DUB）去泛素化活性的简便方法。通过时间依赖性分析泛素链的切割情况，可深入了解遗传变异对DUB酶动力学的影响，从而确定诸如K等参数m 和 V最大值。这将有助于区分去泛素化酶活性位点中影响催化功能的缺陷（降低的V最大值）以及那些损害底物识别能力的突变（K 值升高）m该检测方法的多功能性源于可使用多种不同类型的泛素链，从而为感兴趣的去泛素化酶（DUB）提供独特的机制信息。不同长度和连接拓扑结构的泛素链均可从商业途径获得，使得该方法易于非专业研究人员使用。特定的去泛素化酶在酶动力学、连接方式识别及切割特性方面具有独特性质。本实验的关键步骤包括：（1）确定DUB的工作浓度，（2）确定最佳反应时间，（3）选择泛素链的连接类型和长度，（4）选择检测方法。
泛素链切割实验用于检测神经发育障碍相关变异体对去泛素化酶（DUB）活性的影响7,11，有助于识别那些破坏DUB活性并导致异常发育的变异体。该实验可应用于多种由遗传变异驱动病理过程的场景，包括癌症和神经退行性疾病。作为一种不依赖底物的实验方法，无需预先鉴定特定的泛素化蛋白底物。然而，该实验仅限于测量泛素链切割活性的变化，无法评估变异体对DUB其他功能的影响，例如蛋白质-蛋白质相互作用、亚细胞定位以及翻译后修饰。要深入研究这些变异体如何导致特定的神经发育障碍，需先明确目标DUB所参与的广泛信号通路，进而开发针对性的特异性实验方法。

神经发育障碍（NDDs）由多种病因引起，其环境或遗传因素导致神经系统发育异常1。新一代测序遗传检测已将越来越多的泛素系统相关基因变异与遗传性NDDs联系起来2。泛素系统催化小分子蛋白修饰物泛素与底物蛋白中主要为赖氨酸残基的连接，从而驱动细胞行为的改变，包括定位、稳定性、蛋白质-蛋白质相互作用或活性的变化3。泛素化过程由E1激活酶、E2结合酶和E3连接酶介导4，而去泛素化酶（DUBs）可催化泛素从底物蛋白上切割并移除，从而使该过程具有可逆性5。泛素可以单体形式（单泛素化）或聚合链形式（多聚泛素化）连接至底物蛋白，多聚链可在泛素的七个赖氨酸残基（K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63）或M1位点形成。这些不同的泛素链拓扑结构及其组合构成了细胞内的信号传导关键编码系统6。
USP27X、USP7、USP9X、USP48、STAMBP、OTUD4、OTUD6B 和 OTUD5 等去泛素化酶（DUB）已被发现与神经发育障碍（NDD）相关2,7,8,9,10,11。对于大多数 NDD 而言，驱动其发病的分子机制在实验上仍不明确。部分导致新近描述疾病的 DUB 尚未被充分理解，且缺乏可用于评估遗传变异对蛋白质功能影响的已知细胞检测方法。体外泛素链切割实验可克服这一局限，作为不依赖底物的 DUB 活性检测手段，用于测量基因变异对酶活性的影响12。
体外 泛素切割实验自20世纪80年代以来已被广泛应用。这些使用放射性标记底物的实验促成了首批去泛素化酶（DUBs）的发现，包括因能够去泛素化组蛋白H2A而被鉴定的异肽酶（isopeptidase）13，以及因能够从多种化学偶联物中水解泛素而被发现的泛素羧基末端水解酶（UCH）14,15,16。此外，放射性标记的全长多泛素化蛋白或肽段被用于分别从红细胞和骨骼肌中鉴定出异肽酶T以及多种UCH和泛素特异性蛋白酶（UBPs）17,18,19,20。具有确定长度和连接类型的泛素链（K48连接的四聚泛素）首次被用于测定异肽酶T的DUB活性21。自此以后，该实验已成为在突变分析中测定DUB活性的金标准22,23。该实验的进一步优化目前可通过电泳及常规凝胶染色（如考马斯亮蓝、SYPRO orange、ruby和银染）或基于荧光或免疫印迹的检测方法来可视化泛素的切割过程12,24。通过在功能实验中使用不同长度（例如二聚、三聚、四聚泛素）和连接类型（K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63、线性）的泛素链，可以阐明DUB活性的分子特征，例如最小链长要求和连接特异性25,26,27,28。与神经发育障碍（NDD）相关的变异可能引发对特定泛素链连接类型具有选择性的DUB活性缺陷11。
利用纯化的重组去泛素化酶（DUB）蛋白进行双泛素切割实验，可直接测量神经发育障碍（NDD）变异体对DUB活性的影响。本方案以在X连锁智力障碍105型（XLID105）中发生突变的USP27X为例进行说明7,28。该方法可用于确定基因变异如何破坏已知或未知DUB相关神经发育障碍中的DUB活性。

<table><tbody><tr><td>Amersham Protran 0.45 NC 200 mm &amp;times; 200 mm 25/包</td><td>Cytiva</td><td>10600041</td><td></td></tr><tr><td>硫酸铵</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC205872500</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760 25</td><td></td></tr><tr><td>抗泛素抗体（小鼠单克隆）</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 646302, RRID:AB_1659269</td><td>(WB: 1:1000)</td></tr><tr><td>抗GST抗体（绵羊多克隆）</td><td>MRC-PPU 试剂与服务</td><td>Cat# S902A 第三次采血</td><td>(WB: 1:1000) https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/</td></tr><tr><td>带挡板培养瓶 2 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-042-5N</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 试剂</td><td>Millipore Sigma</td><td>B6916-500ML</td><td></td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>Gold Biotechnology</td><td>C-105-25</td><td></td></tr><tr><td>Complete 蛋白酶抑制剂片剂</td><td>Millipore Sigma</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Column 1.5 &amp;times; 5 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>7371507</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer F1.5&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5384000020</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Genesee Scientific</td><td>18-205</td><td></td></tr><tr><td>Illustrator</td><td>Adobe</td><td></td><td>https://www.adobe.com/products/illustrator.html</td></tr><tr><td>Image Studio</td><td>LI-COR 生物科学</td><td></td><td>https://www.licor.com/bio/image-studio/</td></tr><tr><td>Inkscape</td><td>Inkscape</td><td></td><td>https://inkscape.org/</td></tr><tr><td>Invitrogen 4-12% NuPAGE 1 mm 12 孔胶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-109</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW 驴抗山羊IgG二抗</td><td>LI-COR 生物科学</td><td>Cat# 926-32214</td><td>(WB: 1:10000)</td></tr><tr><td>IRDye 800CW 驴抗小鼠IgG二抗</td><td>LI-COR 生物科学</td><td>Cat# 926-32212</td><td>(WB: 1:10000)</td></tr><tr><td>Isotemp 数字干浴器</td><td>Fisher Scientific</td><td>88860022</td><td></td></tr><tr><td>K63 二聚泛素</td><td>South Bay Bio LLC</td><td>SBB-UP0072</td><td></td></tr><tr><td>LB 琼脂</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-119</td><td></td></tr><tr><td>LB 肉汤</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-118</td><td></td></tr><tr><td>溶菌酶</td><td>Gold Biotechnology</td><td>L-040-100</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 4000 台式轨道摇床</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SHKE4000-7</td><td></td></tr><tr><td>MES-SDS 电泳缓冲液</td><td>Boston Bioproducts Inc</td><td>BP-177</td><td></td></tr><tr><td>微型管旋转混合器</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-051</td><td></td></tr><tr><td>NuPage LDS 样品缓冲液 4x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey&amp;nbsp;Fc 成像系统</td><td>LI-COR 生物科学</td><td>43214</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Plus 蛋白分子量标准</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26620</td><td></td></tr><tr><td>pGEX6P1 人 USP27X</td><td>MRC-PPU 试剂与服务</td><td>DU21193</td><td>https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/</td></tr><tr><td>pGEX6P1 人 USP27X F313V</td><td>Addgene</td><td>225715</td><td>Koch 等 2024 (PMID: 38182161)</td></tr><tr><td>pGEX6P1 人 USP27X S404N</td><td>Addgene</td><td>225717</td><td>Koch 等 2024 (PMID: 38182161)</td></tr><tr><td>pGEX6P1 人 USP27X Y381H</td><td>Addgene</td><td>225716</td><td>Koch 等 2024 (PMID: 38182161)</td></tr><tr><td>Pierce 谷胱甘肽琼脂糖</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16100</td><td></td></tr><tr><td>PMSF（苯甲基磺酰氟）</td><td>Gold Biotechnology</td><td>P-470-10</td><td></td></tr><tr><td>聚山梨酯 20（Tween 20）</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC233360010</td><td></td></tr><tr><td>Rosetta 2 感受态细胞</td><td>Millipore Sigma</td><td>71402-M</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec 3000</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2501</td><td></td></tr><tr><td>SOC 培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Genesee Scientific</td><td>18-216</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier 250 超声破碎仪</td><td>Branson</td><td>100-132-135</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC 6 Plus 离心机</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>TCEP（三(2-羧乙基)膦盐酸盐）</td><td>Gold Biotechnology</td><td>TCEP10</td><td></td></tr><tr><td>优质肉汤粉末</td><td>Genesee Scientific</td><td>18-225</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Genesee Scientific</td><td>18-146</td><td></td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell 和 XCell II 转膜模块&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EI0002</td><td></td></tr></tbody></table>

通过体外泛素链切割实验测定与神经发育障碍相关的去泛素化酶的酶活性

Measuring Enzymatic Activity of Neurodevelopmental Disorder-Associated Deubiquitylating Enzymes via an In Vitro Ubiquitin Chain Cleavage Assay

神经发育障碍（NDDs）与神经系统功能受损相关，但在分子水平上往往仍缺乏深入理解。由单个基因引起的特定障碍为研究驱动非典型神经发育的机制提供了模型。编码去泛素化酶（DUB）家族蛋白的基因变异与多种NDDs相关，但目前亟需明确由这些基因变异所导致疾病的致病机制。基因变异对DUB活性的影响可通过不依赖底物的实验方法进行测定 体外 泛素切割实验。该实验无需了解下游底物即可直接测量催化活性。本文以去泛素化酶泛素特异性蛋白酶27X连锁（USP27X）为例，建立检测基因变异对酶活性影响的实验方案，该基因在X连锁智力障碍105型（XLID105）中发生突变。此实验流程可用于阐明由去泛素化酶基因变异引起的神经发育障碍的潜在机制。

为确定与XLID105相关的USP27X变异体对USP27X催化活性的影响，从细菌中纯化了带有GST标签的野生型USP27X以及与XLID105相关的F313V、Y381H和S404N变异体USP27X蛋白。这些变异体位于USP27X的USP催化结构域内图 2A）。由于先前有报道称 USP27X 可切割 K63 泛素链31野生型USP27X以及与XLID105相关的F313V、Y381H和S404N USP27X蛋白与K63连接的二泛素链在37℃下孵育1小时，随后对这些样品进行分离 通过 SDS-PAGE32，并分析了泛素和USP27X蛋白 通过 免疫印迹。野生型USP27X可诱导二聚泛素的切割，生成单泛素。图2B 和 补充图1）。与XLID105相关的USP27X变异蛋白F313V、Y381H和S404N不能切割这些链。由于F313V、Y381H和S404N变异破坏了USP27X的催化活性，因此USP27X功能的破坏似乎是XLID105发病机制的主要原因。7. 更多定量分析和补充实验此前已有报道7.
<img alt="泛素蛋白酶（USP27X）结构域突变示意图及双泛素（di-Ub）分析的免疫印迹检测。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67367/67367fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：XLID105变异体对USP27X去泛素化活性的影响。（A）人源USP27X蛋白结构示意图，显示氨基酸残基编号及在USP结构域（紫色）中所评估的XLID105变异体的位置。（B）将GST标签标记的野生型USP27X及XLID105变异体（F313V、Y381H和S404N）与K63连接的双泛素链在指定时间下孵育，随后使用抗GST（USP27X）和泛素抗体进行免疫印迹分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67367/67367fig02largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充图1：图2B的未裁剪蛋白印迹图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67367/R1%20Koch%202024%20Jove%20supplemental%20Figure.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案介绍了如何通过重组蛋白纯化与泛素链切割实验相结合，来检测与神经发育障碍相关的遗传变异对去泛素化酶活性的影响。

神经发育障碍（NDDs）与神经系统功能受损相关，但在分子水平上往往仍缺乏深入理解。

我们的研究致力于阐明与泛素系统酶基因变异相关的神经发育障碍的分子基础。我们采用前沿技术来解析这些酶所调控的信号通路，并确定基因变异对蛋白质生物学功能的影响。该方法的优势在于它是一种不依赖底物的技术，无需事先了解特定去泛素化酶（DUB）所调控的底物蛋白。通过这种方法，我们可以直接测量与神经发育障碍相关的基因变异对去泛素化酶（DUB）催化活性的影响，并推测可能的致病机制。由于大多数DUB的细胞功能尚不明确，我们实验室的研究重点将是鉴定这些酶所介导的信号通路，以及与遗传疾病相关的基因变异如何影响这些过程。首先，在使用前将20 µL化学感受态Rosetta 2 Escherichia coli细胞置于冰上立即解冻。加入1至10纳克的pGEX6P1 USP27X表达质粒，冰上孵育5分钟。将细胞置于42摄氏度干浴中热激30秒，随后再次冰上孵育2分钟。向细胞中加入 80 µL 室温 SOC 培养基。在 37 °C、19 mm 轨道的恒温摇床中以 200 RPM 振荡培养 60 分钟。然后取 50 µL 菌液涂布于含有氯霉素和氨苄青霉素的 LB 琼脂平板上。在37摄氏度、盖子朝下的条件下，在温控培养箱中培养20小时。挑取一个转化细菌的单菌落，接种于10毫升添加了氯霉素和氨苄青霉素的无菌LB培养基中。按照前述条件培养20小时。然后将10毫升过夜培养物加入到1升含有氯霉素和氨苄青霉素的TB培养基中。培养至600纳米处的光密度达到0.5至0.6。接着，向培养物中加入50 µM的异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）以诱导表达。将样品冷却至16摄氏度后，在16摄氏度下以200转/分钟振荡孵育20小时。然后在4摄氏度下以3000 ×g或更高的离心力离心20分钟，使表达培养物中的细胞沉淀。最后，将沉淀物在-80摄氏度下保存至少1小时。首先，将空的重力流层析柱固定在铁架台上。用两到三毫升谷胱甘肽琼脂糖树脂填充层析柱，用于纯化从一升表达培养物中收集的细胞沉淀。用一个树脂床体积的20%乙醇洗涤层析柱。洗涤层析柱后，在4 °C下解冻细胞沉淀。向解冻的沉淀中加入30 mL MS500缓冲液，并轻轻翻转混匀孵育。随后将裂解的细胞在冰上用50 mL离心管进行超声处理，直至裂解液从移液器吸头滴下时能够自由流动。在4°C、20,000 G或更高条件下离心30分钟，以澄清上清液。然后将上清液倾入烧杯中，并将澄清的裂解液上样到层析柱中。通过重力流使裂解液流经层析柱，同时收集穿流液。随后，用至少两个树脂床体积的 MS500 洗涤缓冲液洗涤层析柱，并以 5 毫升为一份收集洗涤穿流液。接着，将每份洗脱液各取 1 微升加入 100 微升 Bradford 试剂中，检测蛋白质的存在。通过向柱中加入 MS500 洗脱缓冲液并收集 5 毫升的洗脱组分，回收目标蛋白质。为沉淀蛋白质，向洗脱液中加入两倍体积的4摩尔硫酸铵，轻轻倒置离心管直至溶液变浑浊。在4摄氏度、20,000 G或更高条件下离心30分钟。每次离心后去除上清液，注意不要扰动蛋白质沉淀。然后将蛋白质重新溶解于添加了25%甘油的MS500缓冲液中，再进行储存。为每种去泛素化酶的每个时间点准备10微升纯化的GST标签USP27X蛋白，并将其置于去泛素化酶激活缓冲液中。在加入泛素链之前，向零时间点样品中加入7微升SDS-PAGE上样缓冲液，以防止去泛素化反应提前开始。对于每种去泛素化酶的每个时间点，加入375纳克用10微升酶活化缓冲液稀释的K63连接的二泛素链。将反应管在30摄氏度孵育，并通过加入7微升SDS-PAGE上样缓冲液终止各个时间点的反应。使用4%至12%的梯度凝胶进行SDS-PAGE。野生型USP27X在孵育一小时后将K63连接的二泛素链切割为单泛素。与XLID-105相关的变异F313V、Y381H和S404N在孵育一小时后未能切割K63连接的二泛素链。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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