通过体外泛素链切割实验测定与神经发育障碍相关的去泛素化酶的酶活性

我们的研究致力于阐明与泛素系统酶基因变异相关的神经发育障碍的分子基础。我们采用前沿技术来解析这些酶所调控的信号通路，并确定基因变异对蛋白质生物学功能的影响。该方法的优势在于它是一种不依赖底物的技术，无需事先了解特定去泛素化酶（DUB）所调控的底物蛋白。

通过这种方法，我们可以直接测量与神经发育障碍相关的基因变异对去泛素化酶（DUB）催化活性的影响，并推测可能的致病机制。由于大多数DUB的细胞功能尚不明确，我们实验室的研究重点将是鉴定这些酶所介导的信号通路，以及与遗传疾病相关的基因变异如何影响这些过程。首先，在使用前将20 µL化学感受态Rosetta 2 Escherichia coli细胞置于冰上立即解冻。

加入1至10纳克的pGEX6P1 USP27X表达质粒，冰上孵育5分钟。将细胞置于42摄氏度干浴中热激30秒，随后再次冰上孵育2分钟。

向细胞中加入 80 µL 室温 SOC 培养基。在 37 °C、19 mm 轨道的恒温摇床中以 200 RPM 振荡培养 60 分钟。然后取 50 µL 菌液涂布于含有氯霉素和氨苄青霉素的 LB 琼脂平板上。

在37摄氏度、盖子朝下的条件下，在温控培养箱中培养20小时。挑取一个转化细菌的单菌落，接种于10毫升添加了氯霉素和氨苄青霉素的无菌LB培养基中。按照前述条件培养20小时。

然后将10毫升过夜培养物加入到1升含有氯霉素和氨苄青霉素的TB培养基中。培养至600纳米处的光密度达到0.5至0.6。接着，向培养物中加入50 µM的异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）以诱导表达。

将样品冷却至16摄氏度后，在16摄氏度下以200转/分钟振荡孵育20小时。然后在4摄氏度下以3000 ×g或更高的离心力离心20分钟，使表达培养物中的细胞沉淀。最后，将沉淀物在-80摄氏度下保存至少1小时。

首先，将空的重力流层析柱固定在铁架台上。用两到三毫升谷胱甘肽琼脂糖树脂填充层析柱，用于纯化从一升表达培养物中收集的细胞沉淀。用一个树脂床体积的20%乙醇洗涤层析柱。

洗涤层析柱后，在4 °C下解冻细胞沉淀。向解冻的沉淀中加入30 mL MS500缓冲液，并轻轻翻转混匀孵育。随后将裂解的细胞在冰上用50 mL离心管进行超声处理，直至裂解液从移液器吸头滴下时能够自由流动。

在4°C、20,000 G或更高条件下离心30分钟，以澄清上清液。然后将上清液倾入烧杯中，并将澄清的裂解液上样到层析柱中。通过重力流使裂解液流经层析柱，同时收集穿流液。

随后，用至少两个树脂床体积的 MS500 洗涤缓冲液洗涤层析柱，并以 5 毫升为一份收集洗涤穿流液。接着，将每份洗脱液各取 1 微升加入 100 微升 Bradford 试剂中，检测蛋白质的存在。通过向柱中加入 MS500 洗脱缓冲液并收集 5 毫升的洗脱组分，回收目标蛋白质。

为沉淀蛋白质，向洗脱液中加入两倍体积的4摩尔硫酸铵，轻轻倒置离心管直至溶液变浑浊。在4摄氏度、20,000 G或更高条件下离心30分钟。每次离心后去除上清液，注意不要扰动蛋白质沉淀。

然后将蛋白质重新溶解于添加了25%甘油的MS500缓冲液中，再进行储存。为每种去泛素化酶的每个时间点准备10微升纯化的GST标签USP27X蛋白，并将其置于去泛素化酶激活缓冲液中。在加入泛素链之前，向零时间点样品中加入7微升SDS-PAGE上样缓冲液，以防止去泛素化反应提前开始。

对于每种去泛素化酶的每个时间点，加入375纳克用10微升酶活化缓冲液稀释的K63连接的二泛素链。将反应管在30摄氏度孵育，并通过加入7微升SDS-PAGE上样缓冲液终止各个时间点的反应。使用4%至12%的梯度凝胶进行SDS-PAGE。

野生型USP27X在孵育一小时后将K63连接的二泛素链切割为单泛素。与XLID-105相关的变异F313V、Y381H和S404N在孵育一小时后未能切割K63连接的二泛素链。