Name: 急性高血糖合并短暂性局灶性缺血诱导的出血转化小鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 学习使用大脑中动脉闭塞再灌注技术建立急性高血糖C57BL/6小鼠出血转化模型。该方案具有高重复性、高稳定性和低死亡率的特点，适用于出血转化临床前研究。

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图1使用BioRender软件（https://www.biorender.com/）制作。本研究获得湖北省自然科学基金指导性项目（编号：2022CFC057）资助。

实验方案经江汉大学实验动物福利与使用委员会（JHDXLL2024-080）批准，并依照中国疾病预防控制中心发布的实验动物伦理指南进行。本研究使用成年雄性C57BL/6J小鼠，体重为21–26 g。所用试剂与设备的详细信息列于下文 材料表.
1. 动物分组与急性高血糖诱导
<ol>
	<li>将小鼠饲养于江汉大学实验动物中心，环境温度控制在20–22 °C，相对湿度50%–55%，光照/黑暗周期为12小时交替，自由摄食和饮水 广告 随意摄取</li>
	<li>将小鼠随机分为四组：假手术 + 生理盐水组（n = 12）、假手术 + 葡萄糖组（n = 12）、MCAO + 生理盐水组（n = 12）和 MCAO + 葡萄糖组（n = 20）。</li>
</ol>
2. 术前准备
注意：所有实验小鼠在手术前禁食 12 小时。
<ol>
	<li>术中给予全身镇痛药（美洛昔康，5 mg/kg，皮下注射）和切口部位局部麻醉（布比卡因，2 mg/kg，皮下注射）。</li>
	<li>将所有手术器械、棉签和外科缝线在121 °C、15 psi条件下高压灭菌30分钟。</li>
	<li>用75%乙醇擦拭手术平台及周围工作区域，并打开加热开关，将温度设定为37 °C。</li>
	<li>在麻醉诱导舱内使用3%异氟烷-20%氧气混合气体对小鼠进行麻醉。随后，通过评估&#160;脚趾夹捏反射&#160;来检测&#160;麻醉深度。</li>
	<li>将小鼠俯卧位置于手术平台上，迅速将其鼻部插入鼻罩。&#160;打开通向鼻罩的气体流量，同时关闭通向麻醉诱导舱的气流。将异氟烷比例调整至2%，并将混合气体流速设定为0.4 mL/min以维持麻醉。</li>
	<li>在小鼠眼部涂抹眼用凝胶，以保持术中眼球湿润。</li>
	<li>使用动物专用剪毛器剃除颈部区域毛发。使用消毒棉棒交替涂抹碘伏和70%乙醇对皮肤进行清洁和消毒。</li>
	<li>在颈部覆盖无菌纱布，并剪开一个开口以暴露手术区域。</li>
</ol>
3. 脑血流量基线测量
<ol>
	<li>使用动物电推剪剃除头皮区域的毛发。用消毒棉签交替涂抹碘伏和70%乙醇，清洁并消毒头皮。</li>
	<li>在额部正中皮肤做一处1.0 cm长的切口，暴露颅骨囟门区域。用生理盐水保持颅骨湿润。</li>
	<li>准备激光多普勒血流仪（LDF），将LDF探头尖端垂直置于左侧顶骨表面（位于前囟后方1 mm、外侧5 mm处）；待血流信号（FLUX）稳定后，记录基线值。 
	注意：FLUX的测量单位为灌注单位（Perfusion Units, PU），测量范围为0–1000 PU。激光多普勒血流仪测得的理想基线脑血流值应&#62;600 PU。连续5秒内波动范围小于10%的血流信号视为有效读数。</li>
	<li>使用5.0 PGA可吸收缝线分别缝合肌肉和皮肤。在伤口处涂抹双氯芬酸钠凝胶和莫匹罗星软膏。</li>
</ol>
4. 大脑中动脉阻塞手术操作
注意：MCAO 采用改良的线栓阻塞法进行，如 Chiang 等人先前所述13。
<ol>
	<li>将小鼠轻轻翻转至仰卧位，并在手术前15分钟经腹腔注射30%葡萄糖（7.2 mL/kg）或生理盐水。 
	注：假手术+葡萄糖组和MCAO+葡萄糖组小鼠接受腹腔注射葡萄糖；假手术+生理盐水组和MCAO+生理盐水组小鼠接受腹腔注射生理盐水。</li>
	<li>使用动物电推剪剃除颈部区域的毛发。用消毒棉签交替涂抹碘伏和70%乙醇清洁并消毒皮肤。在颈部覆盖无菌纱布，并剪开一个小口以暴露手术区域。 
	注：确保切口保持直线，以便最佳地观察颈总动脉。</li>
	<li>使用手术刀在颈部腹侧做一条1.5 cm长的正中切口。用手术镊分离皮下组织和浅筋膜。 
	注：确保切口保持直线，以便最佳地观察颈总动脉。</li>
	<li>在浅筋膜下方，定位下颌下腺以及由三块肌肉构成的倒三角区域：位于气管中线处的胸骨舌骨肌；具有光泽白色肌腱部分的二腹肌后腹；以及胸锁乳突肌。</li>
	<li>在倒三角区域内进行钝性分离，以识别并游离左侧颈总动脉（CCA）。</li>
	<li>使用眼科镊子分离紧邻CCA的迷走神经及血管周围的黏膜组织。在CCA上用5.0聚乙醇酸（PGA）可吸收缝线打一个活结，但保持缝线无张力。</li>
	<li>沿CCA向上分离，可见一个&#34;Y&#34;形分叉，将CCA分为颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）。</li>
	<li>进一步分离该分叉处，充分暴露ECA和ICA。在分叉远端的ECA周围用5.0 PGA可吸收缝线绕圈并牢固结扎。 
	注：确保永久结扎部位与血管分叉之间有足够的距离，以防在旋转ECA时缝线脱落。</li>
	<li>使用两个8 mm × 2 mm的光面微动脉夹，暂时夹闭CCA和ICA，以阻断血流从CCA流向ICA。</li>
	<li>拉紧ECA远端和CCA上的缝线结，使ECA段伸直。</li>
	<li>使用显微剪刀在ECA上两个缝线结之间做一个小切口。</li>
	<li>将一根硅胶包被的单丝缝合线（长30 mm，包被硅胶部分3–4 mm）插入ECA。在靠近分叉处的ECA上用第二根5.0 PGA可吸收缝线绕圈并轻微打结，防止单丝缝线回退。</li>
	<li>在永久结扎点远端完全切断ECA，并移除ICA上的动脉夹。</li>
	<li>将缝线退至CCA分叉处，然后小心回缩并旋转ECA残端。调整缝线插入方向，缓慢将其插入约9.0–10.0 mm，从CCA分叉进入ICA，以阻塞大脑中动脉（MCA）。</li>
	<li>收紧ECA周围的第二根PGA可吸收缝线，并移除CCA上的动脉夹。</li>
	<li>使用5.0 PGA可吸收缝线分别缝合肌肉层和皮肤层。在伤口处涂抹双氯芬酸&#160;钠&#160;凝胶和莫匹罗星软膏。</li>
	<li>将小鼠轻轻翻转至俯卧位，并重复步骤3.4，记录MCA闭塞后的血流情况。 
	注：MCAO后血流减少未达到基线值40%以上的小鼠将被排除在研究之外14。</li>
	<li>打开恢复笼的加热开关，将温度设定为37°C。在闭塞后期间（60分钟）将小鼠置于恢复笼中。</li>
</ol>
5. 单丝缝线移除与再灌注
<ol>
	<li>在阻塞期即将结束前，按照之前所述方法重新麻醉小鼠。</li>
	<li>使用微型动脉夹夹闭颈总动脉（CCA）。</li>
	<li>将单丝线部分从颈内动脉（ICA）撤出，直至硅胶包被的尖端在 ICA 中可见。</li>
	<li>在硅胶包被尖端上方的 ICA 处放置另一个微型动脉夹。</li>
	<li>完全撤出单丝线，并紧密结扎颈外动脉（ECA）残端。</li>
	<li>依次移除 ICA 和 CCA 上的微型动脉夹。</li>
	<li>使用 5.0 号 PGA 可吸收缝线逐层缝合肌肉和皮肤。</li>
	<li>将小鼠置于恢复室中，并持续观察直至其完全清醒。每 12 小时皮下注射美洛昔康（5 mg/kg）以缓解疼痛，最多给药 24 小时。</li>
</ol>
6. 血糖测量
注意：在以下时间点测量血糖水平：（1）MCAO 手术前即刻（基线），（2）插入单丝线后即刻（葡萄糖注射后 15 分钟），（3）插入单丝线后即刻撤出单丝线时（葡萄糖注射后 75 分钟）。
<ol>
	<li>用酒精棉球擦拭小鼠尾巴，使尾静脉充分充血。</li>
	<li>使用手术剪剪去尾尖1–2 mm。</li>
	<li>从尾根部向尾尖方向轻轻挤压，促使血液从切口处流出。</li>
	<li>将试纸的样品吸收槽置于血滴边缘。 
	注意：由于虹吸作用，血液将自动吸入试纸中。</li>
	<li>读取血糖仪数值并记录结果。 
	注意：葡萄糖注射后15分钟内血糖水平未升高至10 mmol/L以上的小鼠应予以剔除。</li>
	<li>用棉球清除多余血液，并施加压力以止血。</li>
</ol>
7. 氯化三苯基四氮唑（TTC）染色
<ol>
	<li>通过腹腔注射过量戊巴比妥（300 mg/kg）处死小鼠。</li>
	<li>一旦小鼠停止呼吸，立即将其固定于仰卧位。</li>
	<li>使用剪刀打开胸腔，并剪除膈肌以暴露心脏。</li>
	<li>将23 G注射针插入小鼠左心室，同时用剪刀剪开耳廓附件。</li>
	<li>灌注15 mL生理盐水，直至从耳廓附件流出的液体变得清澈透明。</li>
	<li>将小鼠断头，用剪刀剪开头皮以完全暴露颅骨。将剪刀尖端置于颅骨冠状缝前方约2 mm处，轻轻撬开颅骨。</li>
	<li>使用镊子完整取出小鼠脑组织。</li>
	<li>将脑组织置于啮齿类脑切片模具中，切成2 mm厚的冠状切片。</li>
	<li>将切片转移至24孔板中，加入2% TTC溶液，在37 °C孵育15分钟。</li>
	<li>启动扫描软件，将参数设置为1200 dpi分辨率，图像格式为JPG，用于图像分析。</li>
	<li>用弯头镊子将组织切片从24孔板中取出，并将其整齐排列在玻璃扫描板上。</li>
	<li>扫描组织切片，随后导出图像用于测量分析。</li>
	<li>通过校正组织肿胀来测量梗死面积。使用ImageJ软件15，用对侧半球的面积减去同侧未梗死区域的面积，计算梗死体积占对侧半球的百分比。有关梗死面积分析的更多细节，请参见Friedländer等人的研究16。</li>
</ol>
8. 大体观察
<ol>
	<li>重复步骤 7.1–7.8。</li>
	<li>用弯头镊子将脑组织切片从脑基质中取出，并将其排列在玻璃扫描板上。</li>
	<li>按照步骤 7.10 和 7.12 中所述方法扫描脑冠状切片。</li>
</ol>
9. 苏木精和伊红（H&amp;#38;E）染色
<ol>
	<li>重复步骤 7.1–7.4。缓慢灌注 15 mL 生理盐水，随后灌注约 15 mL 多聚甲醛（PFA）。</li>
	<li>重复步骤 7.6–7.7。用 4% PFA 在室温下固定脑组织 24 小时。</li>
	<li>将固定的脑组织放入自动组织脱水机中进行脱水、透明和浸蜡处理。</li>
	<li>将组织包埋于石蜡中，并使用切片机将脑组织切成 5 μm 厚的冠状切片。</li>
	<li>将切片浸入二甲苯中三次进行脱蜡，每次 8 分钟。然后依次将切片浸入浓度递减的乙醇溶液（100%、95%、90%、80%、70%），再转入蒸馏水中，每步持续 5 分钟。</li>
	<li>用苏木精溶液染色切片 3 分钟，随后将其浸入 5% 盐酸乙醇中分化 5 秒。</li>
	<li>将切片在伊红溶液中孵育 1 分钟，然后用梯度乙醇溶液（90%、95%、100%）和二甲苯进行脱水和透明处理。</li>
	<li>用中性树胶封片。</li>
	<li>在荧光显微镜下使用明场模式采集 H&amp;#38;E 染色脑切片的图像。</li>
</ol>
10. 伊文思蓝（EB）渗漏的测定
注意：有关此实验步骤的详细信息，请参见 Wang 等人17。
<ol>
	<li>注射2% (w/v) 伊文思蓝（EB）溶液（2 mL/kg） 通过 MCAO术后23小时尾静脉</li>
	<li>在EB注射一小时后，重复步骤7.1–7.7，并拍摄全脑照片。</li>
	<li>将脑组织置于啮齿类动物脑切片模具中，冠状切割成2 mm厚的切片。按照步骤7.10–7.12所述方法对脑组织冠状切片进行扫描，以观察伊文思蓝（EB）渗漏情况。</li>
	<li>将切片分为左右两部分，分别放入离心管中。</li>
	<li>将每份脑组织切片用三氯乙酸均质化，脑组织与三氯乙酸的比例为100 mg : 0.4 mL，三氯乙酸浓度为50%。</li>
	<li>4 °C 下孵育过夜后，将匀浆以 10,000 x g 离心 30 分钟 g （4 °C条件下）.</li>
	<li>将上清液转移至另一离心管中，并用乙醇稀释四倍。</li>
	<li>使用分光光度计在620 nm处测定上清液的吸光度。</li>
	<li>使用乙醇中EB的标准曲线（例如，31.25、62.5、125和250 ug/mL）将吸光度值转换为EB的浓度。 
	注意：结果以每克脑组织中伊文思蓝的微克数表示。</li>
</ol>
11. FITC-葡聚糖渗漏的测定
<ol>
	<li>在MCAO术后24小时，通过尾静脉注射&#160; FITC-Dextran&#160;（10 KDa，6 mg/mL，用0.01 M PBS稀释；4 mL/kg），使其在血液中循环10分钟。</li>
	<li>重复步骤7.1–7.7，进行灌注并取出完整脑组织。</li>
	<li>将脑组织在4%多聚甲醛（PFA）中室温避光固定24小时。</li>
	<li>将固定后的脑组织依次转移至10%、20%和30%梯度浓度的蔗糖溶液（用0.01 M PBS稀释）中进行脱水处理。</li>
	<li>使用最佳切割温度包埋剂（OCT）包埋脑组织，并切成30 μm厚的脑组织切片。用接种环将切片转移至载玻片上，并确保其牢固贴附于载玻片表面。</li>
	<li>使用含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂对脑组织切片进行封片。</li>
	<li>启动激光共聚焦显微镜及其控制软件。</li>
	<li>将载玻片固定在显微镜载物台上，使用200倍目镜定位梗死区域。</li>
	<li>将分辨率设为1024 × 1024，并调节增益值和曝光时间，以获得最清晰的图像。</li>
	<li>在激发波长为488 nm的条件下，采集脑梗死区域FITC-Dextran染色的图像。</li>
</ol>

Hyperglycemia-Enhanced Hemorrhagic Transformation in tMCAO-Induced Stroke

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作者无任何利益冲突需要披露。

本实验方案旨在建立一种可靠的缺血性卒中后出血性转化动物模型，可模拟高血糖条件下血管再通所引发的有害效应。在缺血性卒中的多种危险因素中，卒中发病后24小时内的血糖水平与脑损伤加重及死亡率升高呈正相关3,18。大量临床研究也表明，卒中后高血糖是出血性转化（HT）及神经功能预后不良的最重要危险因素之一19。在本方案中，20只小鼠中有19只在急性高血糖状态下成功诱导出HT，建模成功率约为95%。遗憾的是，其中有4只小鼠在大脑中动脉闭塞（MCAO）手术后24小时内因严重脑出血而死亡，因此未纳入后续分析。
高血糖诱导的出血性转化（HT）动物模型已被用于近期的临床前研究。Won 等人证明，在tPA治疗卒中的大鼠模型中，高血糖促进了HT的发生20。然而，Won的HT模型中的致病因素更为复杂，因为tPA本身可能增加HT的风险。相比之下，本方案采用急性高血糖联合大脑中动脉闭塞（MCAO）的方法，在小鼠中实现了较高的HT成功率。值得注意的是，不同高血糖诱导HT模型在葡萄糖浓度、缺血持续时间、模型可靠性以及HT发生率方面存在差异21,22,23,24。一些研究使用50%葡萄糖注射，诱导出显著更高的血糖水平（20–28 mmol/L），超过了卒中患者中通常观察到的范围。这些实验中的HT发生率在70%至73.3%之间，其中一个实验模型记录的死亡率为37.5%。相比之下，本实验方案采用30%葡萄糖注射诱导急性高血糖，使血糖水平维持在14.3 mmol/L至20.3 mmol/L之间，更符合临床患者血糖值的范围。此外，这些操作要求实验小鼠在手术前进行禁食，以将其术前基础血糖水平调节至约5 mmol/L；若未进行禁食，可能导致基础血糖水平升高至约10 mmol/L，进而引起血糖水平过高，并最终导致小鼠死亡率升高。
在最近的一项研究中，MacDougall 等人发现，高血糖会导致梗死体积增大，尤其是在 1 型糖尿病模型中25。本研究结果表明，在经历 60 分钟缺血后，给予葡萄糖处理组的梗死体积大于生理盐水对照组。该结果与先前一项实验一致，后者证明了高血糖对缺血半暗带区域梗死进展具有不利影响18。在本实验方案中，术前注射 30% 葡萄糖在 MCAO 术后 24 小时导致了脑点状出血。与大体分级结果一致，采用 H&amp;#38;E 染色的组织学分析显示，急性高血糖小鼠的缺血纹状体和皮层中存在显著的血细胞浸润。自然地，目前还有其他可用于评估出血性转化（HT）的方法，例如通过 ELISA 检测血红蛋白或磁共振成像（MRI）。尽管 HT 的病理生理机制尚不明确，但血脑屏障（BBB）破坏被认为是脑缺血后 HT 的主要原因26。因此，BBB 破坏可间接反映 HT 的严重程度。本方案采用伊文思蓝（EB）染色检测 BBB 通透性。EB 染色的脑切片可直观展示 BBB 通透性的变化，并允许对渗透至脑组织中的 EB 染料含量进行定量测定。近年来，其他示踪剂如荧光素钠和 FITC-葡聚糖已被广泛用于评估神经系统疾病动物模型中的 BBB 通透性27,28。因此，我们还进行了葡聚糖染色实验，通过观察 FITC-葡聚糖的渗漏程度，更详细地描绘血管内皮损伤的位置和范围。
当前方案存在若干不可忽视的局限性。首先，大脑中动脉闭塞（MCAO）手术对操作者的技术水平要求较高。必须确保栓塞线及时进入大脑中动脉（MCA），并准确控制阻塞的位置和深度。满足这些要求需要实验操作者接受 extensive 的培训。其次，由于出血性转化（HT）可能加重脑损伤，术后护理对于提高实验动物的存活率至关重要。最后，需要认识到，临床脑卒中患者通常具有多种 HT 风险因素，例如糖尿病、高血压、心房颤动和年龄29。因此，现有的动物模型无法完全模拟这些风险因素所涉及的复杂机制。
综上所述，本方案在脑缺血-再灌注小鼠模型中有效复制了由急性高血糖引发的出血性转化。该模型具有良好的可重复性、高度稳定性以及较高的动物存活率，适用于出血性转化的临床前研究广泛使用。

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Erratum: A Mouse Model of Hemorrhagic Transformation Induced by Acute Hyperglycemia Combined with Transient Focal Ischemia

脑梗死是全球成人致残的首要原因，也是成人死亡的第二大原因1。急性期在脑梗死的进展过程中起着关键作用，是疾病治疗的关键时间点。早期及时恢复半暗带区域的血流对于防止脑细胞进一步死亡至关重要，溶栓治疗和介入治疗是急性脑梗死（ACI）治疗的主要手段。然而，出血性转化（HT）是溶栓和介入治疗后常见的严重并发症，在缺血性卒中患者中发生率为15%–30%，在一定程度上限制了这些疗法的应用2,3。HT的发生显著增加了死亡和致残的风险，影响ACI的预后。因此，深入研究HT的病理机制并确定有效的治疗靶点具有重要的临床意义。
目前，线栓法诱导的中动脉闭塞（MCAO）常被用作啮齿类动物脑出血（HT）的研究模型4。长时间的血管阻塞可导致累及皮层和纹状体的大面积脑梗死，进而可能引发继发性脑出血。线栓法MCAO无需开颅，具有高度可重复性，所产生的局灶性脑损伤及脑出血情况与人类脑卒中相似。然而，该机械性模型存在一些明显缺点，包括早期死亡率高和长期存活率低5。另一种常用的脑出血模型是溶栓模型，该模型首先在目标血管内诱导血栓形成，随后使用溶栓药物（如rt-PA、华法林）溶解血栓，以模拟缺血性脑卒中后临床溶栓治疗过程中发生的脑出血6,7。尽管该模型在很大程度上复制了临床溶栓治疗的病理过程，但由rt-PA或华法林诱导的脑出血动物模型操作复杂，且伴随较高的动物死亡率，出血的发生率和部位也存在较大变异性。为了推动脑梗死后脑出血的基础与临床转化研究，建立一种可重复性强、操作简便且稳定性高的脑出血动物模型至关重要。
高血糖是脑缺血/再灌注（I/R）后出血性转化（HT）的重要促成因素8。多项回顾性研究分析了接受机械取栓治疗患者的临床数据，发现入院时血糖水平升高与自发性HT发生率升高相关3。在糖尿病性卒中患者中，高血糖显著增加HT风险，并导致更严重的神经功能缺损9,10。研究人员通过在糖尿病动物模型中实施大脑中动脉阻塞（MCAO）来诱导脑I/R，从而建立HT模型。然而，糖尿病-MCAO模型实验周期长、操作复杂且成本较高11,12。通过腹腔注射葡萄糖诱导急性高血糖，并将其与线栓法建立的脑I/R模型相结合，可建立一种可靠的HT模型。该方法操作简便，出血部位稳定，能有效模拟卒中后高血糖的临床特征。然而，不同研究中在缺血时间、葡萄糖浓度等关键条件上存在显著差异，且模型的稳定性及HT发生率不一致。
本研究团队广泛采用急性高血糖-大脑中动脉闭塞（MCAO）方法建立出血性转化（HT）模型。此外，我们开展了一系列系统实验，探讨缺血时间、血糖浓度、HT发生率及动物死亡率之间的关系。这些实验最终确定了构建脑梗死后HT模型的最佳条件。本研究提供了一种通过腹腔注射30%葡萄糖联合栓塞性MCAO建立急性高血糖诱导HT模型的详细实验方案。

<table><tbody><tr><td>2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108380</td><td>TTC 染色用染料</td></tr><tr><td>24 孔培养板</td><td>Corning Incorporated</td><td>CLS3527</td><td>TTC 染色用容器</td></tr><tr><td>30% 葡萄糖注射液</td><td>Kelun Pharmaceutical</td><td>H42021188</td><td>急性高血糖诱导</td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛</td><td>武汉赛维尔生物科技有限公司&lt;br/&gt;</td><td>G1101</td><td>组织固定</td></tr><tr><td>5.0 聚乙醇酸可吸收缝合线</td><td>金环医疗有限公司</td><td>KCR531</td><td>手术器械</td></tr><tr><td>96 孔培养板</td><td>Corning Incorporated</td><td>CLS3596</td><td>伊文思蓝（EB）含量测定</td></tr><tr><td>麻醉机</td><td>Midmark Corporation</td><td>VMR</td><td>动物麻醉</td></tr><tr><td>含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂</td><td>碧云天生物技术</td><td>P0131</td><td>组织切片封片</td></tr><tr><td>全自动组织脱水&amp;nbsp;&lt;br/&gt; 机</td><td>Leica Biosystems</td><td>TP1020</td><td>组织脱水</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Leica Biosystems</td><td>STELLARIS 5</td><td>图像采集</td></tr><tr><td>双氯芬酸钠凝胶</td><td>马应龙药业</td><td>H10950214</td><td>动物镇痛</td></tr><tr><td>伊红染色液</td><td>赛维尔科技</td><td>G1001</td><td>苏木精-伊红（H&E）染色用染料</td></tr><tr><td>伊文思蓝</td><td>阿拉丁</td><td>E104208</td><td>EB 染色</td></tr><tr><td>眼用凝胶</td><td>广州药业</td><td>H44023098</td><td>手术材料</td></tr><tr><td>异硫氰酸荧光素标记葡聚糖（FITC-dextran）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60842-46-8</td><td>血脑屏障通透性评估</td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td>图像采集</td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM1900</td><td>用于制备冷冻切片</td></tr><tr><td>血糖仪</td><td>鱼跃</td><td>580</td><td>血糖测量</td></tr><tr><td>苏木精染色液</td><td>Servicebio</td><td>G1004</td><td>苏木精-伊红（H&E）染色用染料</td></tr><tr><td>碘</td><td>Lircon</td><td>20020059</td><td>手术材料</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Rwd Life Science</td><td>R510-22-10</td><td>动物麻醉</td></tr><tr><td>激光多普勒血流仪</td><td>Moor Instruments</td><td>moorVMS</td><td>血流监测</td></tr><tr><td>大脑中动脉闭塞（MCAO）缝线</td><td>Rwd Life Science</td><td>907-00023-01</td><td>手术材料</td></tr><tr><td>美洛昔康</td><td>勃林格殷格翰</td><td>J20160020</td><td>动物镇痛</td></tr><tr><td>显微外科器械套装</td><td>Rwd Life Science</td><td>SP0003-M</td><td>手术设备</td></tr><tr><td>切片机</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HM325</td><td>组织切片制备</td></tr><tr><td>切片机刀片</td><td>Leica Biosystems</td><td>819</td><td>组织切片制备</td></tr><tr><td>莫匹罗星软膏</td><td>葛兰素史克</td><td>H10930064</td><td>动物抗感染</td></tr><tr><td>中性树胶</td><td>Absin 生物科学</td><td>abs9177</td><td>H&E 染色封片剂</td></tr><tr><td>石蜡包埋中心</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EC 350</td><td>制备石蜡包埋块</td></tr><tr><td>戊巴比妥钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3761</td><td>动物安乐死</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>碧云天生物技术</td><td>C0221A</td><td>组织切片冲洗</td></tr><tr><td>扫描仪</td><td>EPSON</td><td>V330</td><td>组织扫描</td></tr><tr><td>剃毛器</td><td>深圳市科多斯电器有限公司</td><td>CP-9200</td><td>手术设备</td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1510-02362</td><td>伊文思蓝（EB）含量测定</td></tr><tr><td>蔗糖溶液</td><td>上海麦克林生化科技</td><td>57-50-1</td><td>组织脱水</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>组织包埋介质</td></tr><tr><td>三氯乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6399</td><td>伊文思蓝（EB）含量测定</td></tr></tbody></table>

一种由急性高血糖联合短暂局灶性缺血诱导的出血性转化小鼠模型

A Mouse Model of Hemorrhagic Transformation Induced by Acute Hyperglycemia Combined with Transient Focal Ischemia

出血性转化（HT）是缺血性卒中（IS）后溶栓治疗可能引发的一种严重并发症，限制了重组组织型纤溶酶原激活剂（rt-PA）在临床中的应用。遗憾的是，目前临床上尚无针对HT的有效干预措施。因此，迫切需要建立稳定可靠的实验动物模型，以阐明HT的发病机制并开发有效的干预策略。本研究提出了一种通过急性高血糖联合短暂性局灶性脑缺血（tMCAO）诱导小鼠HT模型的实验方案。雄性C57BL/6J小鼠注射30%葡萄糖以诱导高血糖，随后接受60分钟tMCAO并进行再灌注。在MCAO术后24小时评估脑梗死体积、血脑屏障（BBB）完整性及颅内出血程度。结果显示，葡萄糖注射可导致短暂性高血糖（14.3–20.3 mmol/L），显著增加脑梗死体积和HT发生率。苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色显示，高血糖小鼠梗死区域内存在明显的出血性病灶。此外，高血糖小鼠表现出更严重的BBB破坏，表现为伊文思蓝（EB）和FITC-葡聚糖渗漏加剧。综上所述，在tMCAO小鼠模型中，急性高血糖可稳定且一致地引发肉眼可见的HT。该可重复模型为研究HT的病理机制及开发相应治疗干预手段提供了有价值的工具。

本研究的实验流程如 图1所示。简言之，小鼠接受线栓法诱导的MCAO处理60分钟，随后进行再灌注。在MCAO前15分钟，通过腹腔注射给予葡萄糖（生理盐水中含30%葡萄糖，7.2 mL/kg体重）。在基线期（葡萄糖注射前）、MCAO结束后即刻以及再灌注时分别测定血糖水平。再灌注24小时后，处死小鼠并采集脑组织，用于梗死体积、血脑屏障渗漏及组织病理学分析。如图2所示，四组小鼠的基线血糖水平相似。然而，接受葡萄糖注射的小鼠其血糖水平显著高于生理盐水组小鼠。 
如图3A所示，假手术+生理盐水组和假手术+葡萄糖组脑切片中未观察到明显梗死，而TTC染色清晰显示两个MCAO组脑切片中均存在显著的脑梗死。此外，在不同MCAO组中，注射葡萄糖的小鼠较注射生理盐水的小鼠表现出更大的梗死体积。根据统计分析，MCAO+生理盐水组和MCAO+葡萄糖组的梗死体积分别为20.8% ± 0.8%和45.1% ± 1.6%（图3B）。
大体观察显示，MCAO+生理盐水组和假手术+生理盐水/葡萄糖组的左侧脑半球均未出现出血。相比之下，MCAO+葡萄糖组的缺血侧脑半球可见多发性点状出血（图4A）。连续冠状面脑组织切片的扫描图像显示，MCAO+葡萄糖组的出血灶分布于皮层和纹状体的梗死区域内（图4A）。此外，采用H&amp;E染色的组织学分析表明，MCAO+葡萄糖组的皮层和纹状体梗死区域有显著的血细胞浸润（图4B）。相反，在MCAO+生理盐水组或假手术+生理盐水/葡萄糖组中均未观察到血细胞浸润。
如图5A所示，假手术+葡萄糖组小鼠脑切片中未观察到伊文思蓝（EB）渗漏。然而，两个MCAO组均因EB渗漏而出现明显的蓝色染色。此外，与注射生理盐水的小鼠相比，注射葡萄糖的小鼠在MCAO术后24小时EB通透性增加。与假手术+生理盐水组相比，MCAO+生理盐水组的EB含量显著升高（4.2 µg/g ± 1.8 µg/g vs. 28 µg/g ± 0.7 µg/g，p &lt; 0.01），而在MCAO+葡萄糖组中EB含量进一步升高（28 µg/g ± 0.7 µg/g vs. 65.5 µg/g ± 6.0 µg/g，p &lt; 0.01）（图5B）。如图5C所示，与MCAO+生理盐水组相比，MCAO+葡萄糖组缺血性大脑皮层和纹状体中FITC-葡聚糖的渗漏更为明显。
<img alt="MCAO 实验时间线、葡萄糖水平检测、TTC 和伊文思蓝染色、显微镜分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67371/67371fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图 1：实验流程示意图。 在 MCAO 手术前，小鼠经腹腔注射 30% 葡萄糖或生理盐水，并在手术过程中监测血糖水平。再灌注 24 小时后，处死小鼠进行病理学和组织学分析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67371/67371fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="血糖水平图，MCAO实验结果，MCAO后时间对葡萄糖浓度的影响。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67371/67371fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2：注射30%葡萄糖后不同时间点血糖水平的变化。 数据以均值 ± 标准差表示。N = 10–20。***p &lt; 0.001，与假手术+生理盐水组比较。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67371/67371fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="大鼠脑梗死分析、TTC染色比较、MCAO模型、梗死体积结果柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67371/67371fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：高血糖加重再灌注后24小时的缺血性脑损伤。（A）TTC染色冠状切片的代表性图像，正常脑组织呈粉红色，缺血性梗死区域呈灰白色。比例尺 = 5 mm。（B）梗死体积的统计分析。数据以均值 ± 标准差表示。N = 3。***p &lt; 0.001，与假手术+生理盐水组比较；##p &lt; 0.01，与MCAO+生理盐水组比较。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67371/67371fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="脑切片分析；缺血性损伤比较；MCAO模型；葡萄糖效应；组织学图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67371/67371fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图4：高血糖增加了再灌注后24小时出血性转化（HT）的风险。（A）大体观察和冠状切片的代表性图像。星号表示可见的出血灶。比例尺 = 5 mm。（B）代表性H&amp;E染色半脑图像（上图）及放大图像（下图）。半脑图像比例尺 = 200 µm；放大图像比例尺 = 20 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67371/67371fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="脑切片研究 MCAO-葡萄糖；照片图版与图表；免疫荧光成像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67371/67371fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图 5：高血糖在再灌注后 24 小时加重了血脑屏障的破坏。（A）伊文思蓝渗漏的代表性图像。比例尺 = 5 mm。（B）缺血半球伊文思蓝渗漏的统计分析。数据以均值 ± 标准差表示，N = 3，**p &lt; 0.01，***p &lt; 0.001，与假手术+生理盐水组比较，##p &lt; 0.01，与MCAO + 生理盐水组比较。（C）FITC-葡聚糖染色的缺血脑皮层和纹状体的代表性图像。比例尺 = 10 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67371/67371fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本研究提出了一种利用急性高血糖C57BL/6小鼠进行大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）建立出血性转化（HT）高度可重复动物模型的实验方案。

出血性转化（hemorrhagic transformation, HT）是缺血性卒中（ischemic stroke, IS）后溶栓治疗可能引发的一种严重并发症，并可导致……

本研究旨在提供一套全面且详细的实验方案，通过在急性高血糖的C57BL/6小鼠中实施大脑中动脉阻塞再灌注，建立一种高度可重复的人类脑卒中转化动物模型。与其他技术相比，我们的实验方案表现出良好的重复性、高稳定性以及低动物死亡率，适用于出血性转化的临床前研究中的广泛应用。未来，我们的研究重点将是探讨出血性转化对神经系统功能的影响，并探索其潜在机制。[讲师] 首先，用75%乙醇擦拭手术平台及周围工作区域。打开加热开关，将温度设置为37摄氏度。将麻醉后的小鼠仰卧位放置于手术平台上，并用胶带固定其四肢。然后，在手术操作开始前15分钟，向小鼠腹腔注射30%葡萄糖或生理盐水。使用手术刀沿颈部中线作一长约1.5厘米的横向切口。在倒三角区域进行钝性分离，以识别并游离左侧颈总动脉。使用眼科镊子分离位于颈总动脉旁的迷走神经以及血管周围的黏膜组织。用5-0聚乙醇酸可吸收缝线在颈总动脉上打一个松绕环，保持缝线无张力。随后，沿颈总动脉向上分离。现在，分离颈动脉分叉处，充分暴露颈外动脉和颈内动脉。在分叉远端的颈外动脉上绕过并紧密结扎一根5-0聚乙醇酸可吸收缝线。接下来，使用两个轻型显微锯齿状动脉夹，暂时夹闭颈总动脉和颈内动脉，以阻断血流。然后，牵拉位于颈外动脉远端和颈总动脉上的缝线结，使颈外动脉段拉直。现在，使用显微剪刀在颈外动脉上两个缝线结之间做一个小切口。将一根长30毫米、表面涂有硅胶的单丝缝线插入颈外动脉。在靠近分叉处的颈外动脉上，用第二根5-0聚乙醇酸可吸收缝线绕环并轻微打结，以防止单丝缝线回退。随后，完全切断永久结扎点远端的颈外动脉，并移除颈内动脉上的动脉夹。接下来，将缝线回撤至颈总动脉分叉处。小心牵拉并旋转颈外动脉残端。调整缝线方向，将其从颈总动脉分叉处插入颈内动脉约9至10毫米，以阻塞大脑中动脉。然后，收紧围绕颈外动脉的第二根聚乙醇酸可吸收缝线，并移除颈总动脉上的动脉夹。在对小鼠再次麻醉后，使用微型动脉夹夹闭颈总动脉。将单丝缝线从颈内动脉部分回撤，直至硅胶涂层的尖端透过颈内动脉壁可见。然后，在硅胶涂层尖端上方的颈内动脉处放置另一个微型动脉夹。完全撤出单丝缝线，并紧密结扎颈外动脉残端。最后，分别移除颈内动脉和颈总动脉上的微型动脉夹。首先，用酒精浸湿的棉球擦拭小鼠尾巴，使尾静脉充分充血。使用手术剪在尾尖处剪去1至2毫米。从尾根部向尾尖方向轻轻挤压，以促进血液从切口流出。然后，将试纸的样本吸收槽置于血滴边缘。读取血糖仪数值并记录结果。对于脑血流量测定，将激光多普勒血流仪探头垂直对准左侧顶骨颅骨表面，直至读数稳定，并记录该值。在处死MCAO小鼠后取出脑组织，将其置于啮齿类动物脑组织切片模具中，并切成2毫米厚的冠状切片。将切片转移至24孔板中，加入2% 2,3,5-三苯基氯化四氮唑溶液，在37摄氏度下孵育15分钟。之后，用弯头镊子从24孔板中取出组织切片，并将其整齐排列在玻璃扫描板上。用苏木精溶液对固定后的脑切片染色3分钟。将切片浸入5%盐酸酒精中5秒进行分化。然后，使用梯度乙醇溶液和二甲苯对切片进行脱水和透明处理。用中性树胶封片。在MCAO术后23小时，向小鼠注射2%伊文思蓝溶液并取脑。在组织匀浆并离心后，将上清液转移至另一离心管中，并用乙醇稀释四倍。使用分光光度计在620纳米波长下测定上清液的吸光度。在MCAO术后24小时，经尾静脉注射FITC-葡聚糖，使其在血液中循环10分钟。在脑组织固定后，使用最佳切割温度化合物包埋脑组织，并切成30微米厚的切片。使用接种环将切片转移至载玻片上，确保其附着于载玻片表面。使用含4',6-二脒基-2-苯基吲哚的封片剂封固脑组织切片。与生理盐水组相比，注射葡萄糖的小鼠在MCAO术后血糖水平显著升高。假手术加生理盐水组和假手术加葡萄糖组的脑切片中均未观察到明显梗死。MCAO加葡萄糖组的大脑梗死体积显著大于MCAO加生理盐水组。MCAO加葡萄糖组的缺血半球中可见多发点状出血，而其他组中未见此类现象。MCAO加葡萄糖组的皮质和纹状体梗死区域中可见显著的血细胞浸润。与MCAO加生理盐水组相比，MCAO加葡萄糖组的伊文思蓝通透性和FITC-葡聚糖渗漏明显更高。

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