Name: 巨噬细胞-肿瘤球状体共侵袭测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 了解巨噬细胞与肿瘤球状体在3D胶原I基质中的共侵袭测定方法。该实验利用人单核细胞来源的巨噬细胞与H1299 GFP肿瘤细胞共培养，研究KIF16B蛋白在肿瘤微环境中对细胞侵袭行为的影响机制。

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作者谨此感谢Andrea Mordhorst在细胞培养方面提供的出色技术支持，以及Martin Aepfelbacher的持续支持。SL实验室关于巨噬细胞侵袭的研究工作由德国研究基金会（CRC877/B13；LI925/13-1）资助。

本方案涉及使用来自供体血液样本的原代人巨噬细胞。根据汉堡-埃彭多夫大学医学中心的伦理准则，血液样本已采集，且供体已获得补偿。样本的进一步处理遵循既定的安全指南（例如，对未经检测的样本进行处理）。德国汉堡医学协会已认定本研究中对原代人巨噬细胞的操作无可异议。
1. 采用无支架方法生成 H1299 肿瘤球体（提前 3 天）
<ol>
	<li>在含有5% CO2的37 °C培养箱中，使用25 cm2细胞培养瓶（参见材料表）和癌细胞培养基（DMEM培养基 [Dulbecco's modified eagles' medium] + 1% 青霉素-链霉素 [pen-strep] + 10% 胎牛血清 [FBS] + 0.1 mM 非必需氨基酸 + 2 mM L-谷氨酰胺），将癌细胞培养至80%融合度。</li>
	<li>用Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤细胞一次，加入1 mL 0.25%含酚红的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液，孵育2分钟以使细胞脱落。加入2 mL癌细胞培养基终止酶反应，并在光学显微镜下检查细胞脱落情况。 
	注意：必须确保癌细胞充分分散，不得存在癌细胞团块。</li>
	<li>将细胞悬液转移至15 mL离心管中，在245 × g条件下离心5分钟。随后用移液器或泵吸去上清胰蛋白酶溶液，加入5 mL DPBS重悬沉淀进行洗涤，再在相同条件下离心一次。</li>
	<li>将沉淀重悬于5 mL癌细胞培养基中，使用血细胞计数板（如Neubauer计数板）进行细胞计数。将8,000个H1299-GFP细胞接种至96孔超低吸附培养板（参见材料表）中，每孔终体积为25 µL癌细胞培养基。</li>
	<li>将培养板置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育3天。在显微镜下检查类球体的均一性。对于密度较低或存在未贴附的单个癌细胞的类球体，不应用于后续实验。</li>
</ol>
2. 从供体血液样本制备原代人巨噬细胞
<ol>
	<li>若供体血液样本未立即用于细胞分离，则应将其在4 °C条件下振荡保存。</li>
	<li>将20 mL血液从输血袋转移至一个50 mL离心管中。</li>
	<li>随后，准备一个新的50 mL离心管，并加入15 mL淋巴细胞分离液（LSM）。</li>
	<li>小心地将20 mL血液加入含有LSM的离心管中，避免混合，然后在4 °C条件下以450 × g离心30分钟。</li>
	<li>在此期间，准备另一个新的50 mL离心管，并加入10 mL冷的罗斯韦尔帕克纪念研究所（RPMI）-1640培养基。</li>
	<li>离心结束后，将血液管中致密的白色层（&#34;buffy coat&#34;）转移至已准备好的含RPMI的离心管中，并用冷RPMI补足体积至50 mL。</li>
	<li>将悬液在4 °C条件下以450 × g离心10分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用10 mL冷RPMI重悬细胞。</li>
	<li>再次在4 °C条件下以450 × g离心10分钟，弃去上清液，并将沉淀重悬于50 mL RPMI中。</li>
	<li>再次在4 °C条件下以450 × g离心10分钟，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于1.5 mL冷单核细胞缓冲液（含0.5%人血清白蛋白和5 mM EDTA的25 mL DPBS溶液）中。</li>
	<li>将细胞悬液置于冰上，加入250 µL抗CD14磁珠，冰上孵育15分钟。</li>
	<li>通过在磁性分离架上安装过滤柱并加入900 µL单核细胞缓冲液进行平衡，以准备分离柱。</li>
	<li>将细胞悬液倒入过滤柱中，依靠重力使其流过并进入废液管。</li>
	<li>通过加入1 mL单核细胞缓冲液洗涤柱子，该柱子含有与磁珠结合的细胞。</li>
	<li>准备一个含有20 mL RPMI的新50 mL离心管，并将废液管替换为该管置于柱子下方。</li>
	<li>向柱子中加入3 mL单核细胞缓冲液，从磁性架上取下柱子，并装上推杆。</li>
	<li>将细胞压入已准备好的50 mL离心管中，并用RPMI补足体积至30 mL。</li>
	<li>在光学显微镜下对细胞进行计数（例如使用血细胞计数板），并通过添加RPMI调整细胞浓度至2 × 106 个细胞/mL。</li>
	<li>将1 mL细胞悬液接种至6孔板的每个孔中，在37 °C、5% CO2条件下孵育2–4小时。</li>
	<li>检查细胞是否已充分贴壁，并将RPMI更换为1.5 mL单核细胞完全培养基（含20%人血清和1%青霉素-链霉素的RPMI）。</li>
	<li>在孵育24小时后更换培养基。在此条件下，单核细胞将在6天内分化为巨噬细胞。</li>
</ol>
3. 巨噬细胞制备
<ol>
	<li>实验当天，根据各自的培养条件，使用适量的accutase消化巨噬细胞。例如，若细胞接种于6孔板中，则使用500 µL accutase。将细胞在溶液中孵育约40分钟，用2 mL DPBS洗涤一次，并用血细胞计数板进行计数。</li>
	<li>每形成一个类球体，将所需数量的巨噬细胞重悬于40 µL I型胶原混合液（2.5 mg/mL 大鼠尾部I型胶原I）中，并通过短暂涡旋混匀反应管。在已开展的实验中，200,000 个细胞/mL的浓度可显著影响癌细胞的侵袭能力。将胶原-细胞混合物置于冰上保存，因其在室温（RT）下会迅速发生聚合。</li>
</ol>
4. 共侵袭实验的设置
注意：根据成像腔室的格式、分析目的或相应的成像装置，可能需要将肿瘤类球体从超低吸附培养板转移，并调整胶原和培养基的用量。以下步骤描述了在15孔µ载片中对一个样本进行设置的操作流程。
<ol>
	<li>首先，加入 300 µL DPBS 洗涤类球体。剪去 1 mL 蓝色移液枪头的尖端，用 DPBS 吸取类球体。当类球体被吸入并沉降至枪头底部后，迅速将移液枪轻推至成像室底部，利用表面张力转移肿瘤类球体。 
	注意：需注意未修饰的枪头尖端可能产生摩擦，从而影响类球体的完整性。</li>
	<li>通过移液操作尽可能去除随类球体转移的残留 DPBS。</li>
	<li>迅速向含有 H1299-GFP 类球体的成像室中加入 40 µL I 型胶原/巨噬细胞混合液（见步骤 3.4）。</li>
	<li>将培养板转移至细胞培养箱中，在 37 °C、5% CO2 及湿润条件下孵育 30 分钟，使胶原混合物充分聚合。</li>
	<li>聚合完成后，小心向每孔中加入 25 µL 肿瘤细胞培养基，并在上述相同条件下于培养箱中继续孵育 3 天。如需观察，可在预定时间点使用激光扫描显微镜对活体样本进行成像。</li>
</ol>
5. 附加固定与染色
<ol>
	<li>为了进行免疫荧光染色，需将巨噬细胞和H1299-GFP类球体固定在I型胶原基质中。首先，使用泵小心吸除每个样本的上清液，避免接触基质。 
	注意：为避免破坏样本，也可通过手动移液方式去除上清液，而不使用泵。</li>
	<li>向每孔中加入50 µL 3.7%多聚甲醛（溶于DPBS），将样本置于冰上孵育5分钟。随后吸除固定液，并再次向每孔中加入50 µL新鲜固定液。此步骤有助于实现孔内更均匀的甲醛浓度。将样本在4 °C下孵育过夜。 
	注意：根据I型胶原混合物体积的不同，孵育时间可能延长至数小时。</li>
	<li>次日去除固定液，并根据成像腔室的体积，用DPBS重复洗涤至少两次。将样本在摇床上冰上短暂孵育5分钟，然后通过移液吸除DPBS。此时样本已准备好进行染色。</li>
	<li>将4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，1 mg/mL，用于细胞核染色）与鬼笔环肽568（phalloidin 568，用于F-肌动蛋白染色）按1:100的比例溶于DPBS中，加入样本中染色至少30分钟，成像前用DPBS洗涤两次。</li>
</ol>
6. 肿瘤生长不同参数的成像与分析
注意：以下步骤适用于固定样本或活细胞成像样本。
<ol>
	<li>观察肿瘤球体时，使用配备10倍物镜的倒置激光扫描显微镜，以便对球体大约下三分之一部分进行z轴层扫成像。 
	注意：由于样品较厚，使用双光子显微镜可能更具优势。为更佳地识别单个细胞，可能需要更高的激光功率和更长的曝光时间。</li>
	<li>采集图像后，使用Fiji（即ImageJ软件）对z轴层扫图像进行z轴投影合并。随后，对H1299-GFP信号通道应用自动阈值（例如Huang自动阈值）进行处理，并根据背景和信号强度情况对图像进行去斑处理以消除残余噪声。</li>
	<li>使用Fiji测量球体参数。
	<ol>
		<li>面积：使用魔棒工具测量球体大小。</li>
		<li>周长：在测量设置中包含周长参数。</li>
		<li>直径：在测量设置中包含Feret直径参数。</li>
		<li>圆形度：在测量设置中包含形态描述符参数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用Fiji测量单个癌细胞参数。
	<ol>
		<li>测量侵袭性癌细胞的数量。
		<ol>
			<li>使用魔棒工具选中球体中心区域并删除信号。此操作将从分析中去除球体本身以及仍附着在球体上的所有相连细胞信号。</li>
			<li>随后，使用分析颗粒工具或对所有剩余的独立信号进行定量。 
			注意：结果即为侵袭性癌细胞的数量。此外，结果还可反映癌细胞覆盖的代表性面积，并据此判断为集体侵袭或单细胞侵袭，具体取决于面积大小。为进一步验证侵袭性癌细胞数量，可将分析所得颗粒的掩膜叠加至DAPI通道，并对细胞核进行计数。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进一步使用GraphPad Prism或Microsoft Excel等统计软件对结果进行评估。 
	注意：本实验方案已被证明具有高度稳健性和灵活性。在本实验室中已使用超过50次，每次均采用至少3名供体的原代人源巨噬细胞，以考虑供体间的个体差异。在当前形式下，该方案的成功率可达90–95%。然而，由于实验体系较为复杂，不同实验结果可能存在差异，因为每个球体与巨噬细胞的相互作用均具有个体性。因此，建议至少重复实验3次，每次包含5个球体，以获得具有统计学意义的结果。</li>
</ol>

Examining Macrophage-Tumor Spheroid Interactions in a 3D Collagen Matrix Setup

<ol><li>Lendeckel, U., Venz, S., Wolke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%3A+shapes+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22ChemTexts%22%5BJournal%5D)">Macrophages: shapes and functions.</a> ChemTexts. 8 (2), 12(2022).</li>
<li>Dallavalasa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+tumor+associated+macrophages+%28TAMs%29+in+cancer+progression%2C+chemoresistance%2C+angiogenesis+and+metastasis+-+Current+status%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The role of tumor associated macrophages (TAMs) in cancer progression, chemoresistance, angiogenesis and metastasis - Current status.</a> Curr Med Chem. 28 (39), 8203-8236 (2021).</li>
<li>Pan, Y., Yu, Y., Wang, X., Zhang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+macrophages+in+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated macrophages in tumor immunity.</a> Front Immunol. 11, 583084(2020).</li>
<li>Boutilier, A. J., Elsawa, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Polarization+States+in+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Macrophage Polarization States in the Tumor Microenvironment.</a> Int J Mol Sci. 22 (13), 6995(2021).</li>
<li>Wenzel, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+transfer+of+cancer+cell+invasiveness+via+endosome-mediated+protease+shedding%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Intercellular transfer of cancer cell invasiveness via endosome-mediated protease shedding.</a> Nat Commun. 15 (1), 1277(2024).</li>
<li>Anfray, C., Ummarino, A., Calvo, A., Allavena, P., Torres Andon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+tumor-associated+macrophages+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment.</a> Methods Mol Biol. 2614, 93-108 (2023).</li>
<li>Hey, S., Wiesner, C., Barcelona, B., Linder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIF16B+drives+MT1-MMP+recycling+in+macrophages+and+promotes+co-invasion+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci+Alliance%22%5BJournal%5D)">KIF16B drives MT1-MMP recycling in macrophages and promotes co-invasion of cancer cells.</a> Life Sci Alliance. 6 (11), e202302158(2023).</li>
<li>Wu, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+cancer+cell+invasion%3A+Patterns+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Oncol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of cancer cell invasion: Patterns and mechanisms.</a> Transl Oncol. 14 (1), 100899(2021).</li>
<li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+insights+and+therapeutic+intervention+of+tumor+metastasis%3A+latest+developments+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Mechanism insights and therapeutic intervention of tumor metastasis: latest developments and perspectives.</a> Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 192(2024).</li>
<li>Li, G. N., Livi, L. L., Gourd, C. M., Deweerd, E. S., Hoffman-Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+morphological+changes+of+neuroblastoma+cells+in+response+to+three-dimensional+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Genomic and morphological changes of neuroblastoma cells in response to three-dimensional matrices.</a> Tissue Eng. 13 (5), 1035-1047 (2007).</li>
<li>Lin, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+cancer+cell+invasion+and+T-cell+cytotoxicity+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Monitoring cancer cell invasion and T-cell cytotoxicity in 3D culture.</a> J Vis Exp. 160, e61392(2020).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争利益。

癌细胞的侵袭仍然是一个重要的研究课题，但在伴有巨噬细胞等共侵袭免疫细胞的背景下，该领域尚未得到充分研究。集体性和单个癌细胞的侵袭是转移过程中的关键步骤，已被证明由于癌细胞对多个器官的多发性浸润而降低了癌症患者的生存率8,9。体内研究较为复杂，且仅限于具备动物饲养设施的实验室开展。此外，体内环境的控制或对特定因素的精确调控也十分困难。因此，在研究的初始阶段，迫切需要一种更易获取的实验系统来回答基本科学问题。
通过本文介绍的方法，我们建立了一种可进一步分析以下方面的研究手段：i）免疫细胞和ii）癌细胞行为，iii）实体球状体的生长与发育，以及iv）肿瘤微环境（TME）中细胞对细胞外基质（ECM）组分的影响。该方法可用于比较经修饰的巨噬细胞（例如通过siRNA处理特异性敲低某些调控因子）对实体球状体中单个癌细胞侵袭能力的影响。目前尚不明确肿瘤微环境的物理重构或分泌因子是否是导致所观察到的癌细胞行为的主要原因，仍需进一步深入分析。
此外，也可以对癌细胞本身进行操作，例如通过siRNA处理或敲除特定的调控因子。此外，通过比较在已识别的细胞轮廓内计数的细胞核数量，可以改进分析，从而更精确地确定侵袭性癌细胞的数量。
我们已使用该检测方法来确定肿瘤微环境（TME）中巨噬细胞对肿瘤细胞侵袭的影响。然而，也应注意肿瘤细胞可能通过培养基中的分泌因子影响巨噬细胞的活性。因此，通过免疫荧光染色结合特异性抗体检测巨噬细胞的变化（如极化状态的改变（M1 与 M2））也是一项值得开展的研究工作。过去的研究表明，单层培养的细胞与三维（3D）环境中培养的细胞在表达谱上存在显著差异10。
此外，对巨噬细胞亚群进行荧光激活细胞分选（FACS）并将其整合到实验流程中，可能具有指导意义。最后但同样重要的是，对巨噬细胞与癌细胞或肿瘤类球体表面相互作用的接触区域进行更详细的成像，可能有助于发现与三维侵袭和相互作用相关的其他机制。
值得注意的是，在加入胶原混合物后，类球体在孔中确切位置的精确控制尚无法完全实现。尤其是类球体下方胶原的量特别难以调控。目前已有其他方法可实现类球体的精确定位，例如将其置于琼脂糖模具顶部，适用于更高通量的样本11。然而，由于细胞因子的释放是一种普遍存在的机制，本多类球体检测中的所有类球体均会暴露于分泌的因子中，因此作用于单个类球体的免疫细胞数量难以控制。
该方案的一个基本局限性在于癌细胞系形成均匀类球体的能力，因此仅适用于部分细胞系。例如，MeWo 黑色素瘤细胞会形成不规则的、片状的三维结构，而不会形成均匀的类球体。
还应注意，该检测方法具有高度可适应性，其许多特性均可进行修改，例如细胞外基质材料、细胞数量，或通过向培养上清液中添加特定因子（如细胞因子）等。因此，该方法非常适用于初步研究 体外 癌症细胞与免疫细胞相互作用的研究，并可根据当前研究的具体科学问题进行定制。

巨噬细胞是先天免疫系统的重要组成部分，在许多病理条件下（如感染或损伤后清除细胞碎片）发挥着第一道防线的作用1。近几十年来，免疫细胞对癌症进展的影响已成为众多研究的重点。研究表明，巨噬细胞可通过与原发性肿瘤结合并转化为肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），从而促进转移2。当巨噬细胞暴露于癌细胞时，其基因表达谱可能发生改变，进而促进转移灶逃避免疫系统的监视3。此外，研究还发现，癌细胞可利用巨噬细胞在细胞外基质（ECM）中造成的缺陷，从原发肿瘤中逃逸；同时，巨噬细胞的行为也会受到分泌因子（包括细胞外囊泡（EVs））摄取的影响4,5。这种物理与化学因素之间的相互作用，要求开发新的方法来表征免疫细胞对肿瘤扩散及其周围微环境的影响。
研究转移过程中免疫细胞行为的不同方法已被开发出来 体内6。然而，对于所有实验而言&#160;包括动物在内的研究需要动物实验许可证和动物饲养设施；这些方法本身 already 需要大量的开发和准备工作。此外，分析过程通常较为复杂，尤其是在活细胞成像方面，因为并非所有样本都适用于大多数显微镜配置。为验证假设而开发新方法时，首先在经过验证的 体外 在科学和社会致力于实现无动物研究以减少实验动物牺牲数量的背景下，探索替代条件也具有必要性和紧迫性。
在最近的一项出版物中7我们研究了原代人巨噬细胞对肿瘤类球体中侵袭性癌细胞的影响。为此，我们建立了一种基于I型胶原的巨噬细胞-肿瘤类球体共侵袭实验体系。在此背景下，我们旨在阐明膜型1基质金属蛋白酶（MT1-MMP）在巨噬细胞中快速再循环通路的作用。我们检测了KIF16B缺失的巨噬细胞，此前我们已鉴定KIF16B为一种超程性驱动蛋白&#160;MT1-MMP 再循环的主要驱动因素，及其对实体球状体中 H1299-绿色荧光蛋白（GFP）细胞侵袭能力的影响。KIF16B 耗竭的巨噬细胞表面膜结合型 MT1-MMP 水平降低，而 H1299 细胞本身未接受任何处理。
据我们所知，目前尚未有类似方法被报道，可用于对巨噬细胞-肿瘤类球体共侵袭进行完整的成像与分析。尽管我们在最近的出版物7中重点关注了远离类球体的单个迁移细胞的分析，但该检测方法还可支持多种进一步的研究，例如侵袭性细胞束的数量、参与癌细胞-巨噬细胞相互作用的蛋白质、I型胶原降解的程度，或其他类球体特性（如其周长长度）。

<table><tbody><tr><td>15 &amp;micro;-载玻片血管生成实验板&amp;nbsp;</td><td>ibidi</td><td>81506</td><td></td></tr><tr><td>Accutase细胞消化液</td><td>Invitrogen</td><td>00-4555-56</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 标记鬼笔环肽&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>CD14 微珠</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Binder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>大鼠尾胶原 I 型&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 染色剂</td><td>AppliChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX 培养基</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 缓冲液</td><td>Anprotec</td><td>MS01Y71003</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Bio&amp;Cell</td><td>FBS. S 0613</td><td></td></tr><tr><td>Fiji 图像分析软件&amp;nbsp;</td><td>NIH</td><td>ImageJ 2 版本：2.3.0/1.53s</td><td></td></tr><tr><td>37% 甲醛溶液&amp;nbsp;</td><td>252549-500ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>H1299-GFP 细胞系</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>人血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5843</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP8 X 共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>淋巴细胞分离液（LSM）1077</td><td>PromoCell</td><td>C-44010</td><td></td></tr><tr><td>MS 分离柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸溶液&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素双抗溶液（Pen Strep）</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 培养基&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>81275-034</td><td></td></tr><tr><td>96 孔 TC 培养板，BIOFLOAT，R 型&amp;nbsp;</td><td>SARSTEDT</td><td>83,39,25,400</td><td></td></tr><tr><td>VORTEX-GENE 2 涡旋振荡器&amp;nbsp;</td><td>Scientific Industries</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

巨噬细胞-肿瘤类球体共侵袭实验

A Macrophage-Tumor Spheroid Co-Invasion Assay

免疫细胞与癌细胞之间的相互作用及其对转移的影响是癌症研究的重要方面。目前，仅有少数实验方案能够实现对这一过程的 体外 近似值 体内 我们提出一种新方法，用于观察人巨噬细胞对癌细胞侵袭性的影响，该方法采用嵌入三维（3D）Ⅰ型胶原基质中的H1299非小细胞肺癌细胞肿瘤球体。通过这种共培养体系，我们检测了在小干扰RNA（siRNA）介导的巨噬细胞调控因子敲低条件下，与对照组相比，癌细胞从肿瘤球体向3D基质中侵袭的变化。该方法可测定多种参数，如球体面积或侵袭性癌细胞数量，从而识别癌细胞侵袭能力的差异。本文介绍了该实验体系的构建，讨论了后续分析方法，以及该技术的优势与潜在局限性。

图1 显示了在I型胶原基质中培养不同天数的H1299-GFP球状体成像结果。在第0天拍摄的相应明场图像还显示了与球状体共培养的原代人巨噬细胞。实验第3天获得的代表性图像经处理后进行了放大。图中指出了可分析的不同参数，包括侵袭细胞数量、集体侵袭位点以及球状体周长。表格中列出了由该图像获得的分析结果。检测到的信号数量与视觉观察结果一致。未见中心球状体出现破裂，表明观察到的是真正的单个癌细胞侵袭，而非来源于球状体碎片的细胞。现在可通过统计分析对不同球状体及不同条件下的实验结果进行比较。
<img alt="H1299-GFP 类球体侵袭研究，巨噬细胞相互作用；含数据结果的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67374/67374fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：代表性结果。（上图）H1299-GFP 类球体在 I 型胶原基质中培养第 0 天、第 1 天、第 2 天和第 3 天的成像结果。（中左图）类球体的明场图像，显示共培养的原代人源巨噬细胞。（中右图）第 3 天采集的代表性图像，经处理后放大，展示可分析的不同参数（红色轮廓为类球体周长；手动勾画以增强可视化效果）。（下图）从中右图图像获得的分析结果。注意：巨噬细胞不可见，因仅记录 GFP 通道以阐明癌细胞行为。比例尺：100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67374/67374fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种研究原代人单核细胞来源的巨噬细胞与三维（3D）I型胶原基质中肿瘤球体相互作用的实验方案，可用于比较微环境的可溶性因素和物理特性对细胞侵袭的影响。

免疫细胞与癌细胞之间的相互作用及其对转移的影响是癌症研究的重要方面。迄今为止，仅有少数……

我们希望研究癌症细胞与免疫细胞之间的相互作用，以更深入地理解它们在转移过程中如何相互影响。在大多数情况下，体内模型是研究癌细胞在免疫系统背景下或针对系统中某些独立组分进行三维侵袭的常规方法。而本文介绍的方法能够分析细胞行为，既可模拟体内环境的复杂性，又可在显微镜下更直接地调控特定的环境特征。我们证明，当未改变的癌细胞与缺失马达蛋白KIF16B的巨噬细胞共培养时，其在三维I型胶原基质中的侵袭能力会降低。这表明KIF16B介导的巨噬细胞表面蛋白再循环在肿瘤微环境中发挥着作用。我们希望进一步优化该方法，以实现可视化巨噬细胞与癌细胞相互作用界面处的基质降解情况，从而更深入地理解其降解与黏附机制。首先，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，使用癌细胞培养基在25平方厘米的细胞培养瓶中培养H1299 GFP细胞，直至细胞融合度达到80%。用DPBS洗涤细胞一次，加入1毫升胰蛋白酶-EDTA作用2至3分钟，直至细胞脱落。加入2毫升癌细胞培养基以终止酶促反应。接下来，将离心管中的细胞悬液在15毫升离心管中以245 ×g离心5分钟。弃去含有胰蛋白酶溶液的上清液，然后用5毫升DPBS洗涤沉淀。离心后，将沉淀重悬于5毫升肿瘤细胞培养基中。使用血细胞计数板对细胞进行计数。将8,000个细胞转移至96孔超低吸附培养板中，最终体积为25 µL的肿瘤细胞培养基。于37°C和5% CO₂条件下培养细胞3天。三天后，在显微镜下检查类球体的均匀性。采集人血样本后，将输血袋中的20毫升血液转移至一个50毫升的反应管中。向一个新的50毫升试管中加入15毫升淋巴细胞分离液。小心地将20毫升血液转移至含有淋巴细胞分离液的离心管中，避免混匀，然后在4摄氏度下以450 ×g离心30分钟。离心期间，向一个新的50毫升离心管中加入10毫升冷的RPMI 1640培养基。离心结束后，将含血样本管中的致密白色层转移至已准备好的含RPMI的离心管中，并用冷RPMI补至50毫升。在4°C条件下，以450 ×g离心悬浮液10分钟，弃去上清液。用10毫升冷RPMI重悬沉淀，并用RPMI 1640补至50毫升。再次离心混合物，并将沉淀重悬于50毫升RPMI中。再次离心样品，并将细胞沉淀重悬于 1.5 毫升预冷的单核细胞缓冲液中。接着，在细胞悬液中加入 250 微升抗 CD14 MicroBeads，冰上孵育 15 分钟。孵育期间，通过将滤器连接至磁性分离架来准备分离柱。加入900微升单核细胞缓冲液至柱中以进行平衡。孵育后，将细胞悬液倒入滤膜上，使其依靠重力流过并进入废液管中。加入1毫升单核细胞缓冲液，洗涤含有与磁珠结合细胞的柱子。将柱子下方的废液管更换为含有 20 毫升 RPMI 的新 50 毫升离心管。向柱子中加入 3 毫升单核细胞缓冲液。从磁力架上取下柱子，并安装压头。将细胞压入已准备好的50毫升离心管中，并用RPMI补至30毫升。在光学显微镜下使用血细胞计数板（Neubauer计数室）对细胞进行计数，并用RPMI将细胞浓度调整为每毫升2×10⁶个细胞。每孔加入1毫升细胞悬液至6孔板中，于37°C、5% CO₂条件下孵育2至4小时。孵育后，检查细胞是否贴壁良好，并将 RPMI 替换为 1.5 毫升单核细胞培养基。继续孵育最多六天，直至单核细胞分化为巨噬细胞。在六孔板中从供体血液样本获得原代人巨噬细胞后，加入 500 微升 Accutase，孵育 40 分钟以解离巨噬细胞。然后加入500 µL培养基，转移至15 mL离心管中进行离心。随后用2 mL DPBS洗涤细胞一次，并使用血细胞计数板进行计数。将所需数量的巨噬细胞用40 µL I型胶原混合液稀释，并短暂涡旋混匀。为了清洗类球体，向96孔板的各孔中加入300微升DPBS。使用剪去末端的1毫升蓝色移液枪头吸取含有DPBS的类固醇。当类固醇沉降至枪头底部后，短暂地将移液器推至成像室底部，利用表面张力转移肿瘤类固醇。尽可能去除随类固醇转移的残留DPBS。迅速将40 µL I型胶原巨噬细胞混合液加入含有类固醇的成像室中。在37°C、5% CO₂及湿润条件下孵育30分钟，使胶原混合液充分聚合。聚合后，小心向每个孔中加入25 µL癌细胞培养基，并继续培养三天。在所需的时间点，使用激光扫描显微镜对活体样本进行成像。在侵袭的第三天，H1299 GFP类球体的面积测量为40,307平方微米，而类球体周长为1700.17微米，表明其随时间推移持续生长。观察到癌细胞从球状体中集体侵袭。共鉴定出51个孤立的颗粒，作为单个癌细胞侵袭的指标。该球状体的长宽比为1.10，圆形度为0.18，显示形变程度较低。

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癌症研究

巨噬细胞-肿瘤球状体共侵袭测定

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用于测量TGF-β诱导侵袭的球体侵袭实验

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肿瘤类球体中浸润性T细胞的三维共培养模型

侵袭周围正常组织是恶性肿瘤的一个显著特征。本文提供了一种简单且半自动化的微孔板检测方法，用于检测细胞对天然三维生物基质的侵袭能力，该方法已成功应用于多种人类晚期癌症模型。...

三维（3D）肿瘤球体侵袭实验

该方法用于评估癌细胞从类球体向周围三维基质的侵袭。类球体通过悬滴培养法生成，随后包埋于含有基底膜成分和I型胶原的基质中，继而监测类球体外的侵袭情况。...

一种用于在三维环境中评估癌细胞球体侵袭能力的实验方法

要理解癌症的恶性行为，需要建立准确的模型来研究肿瘤细胞与肿瘤微环境组分（如巨噬细胞）之间的相互作用。本文介绍了两种研究胶质母细胞瘤细胞与肿瘤相关巨噬细胞及小胶质细胞相互作用的方法，通过这些方法可评估其对胶质母细胞瘤侵袭能力的影响。...

共培养实验研究巨噬细胞和小胶质细胞对胶质母细胞瘤侵袭的促进作用

肿瘤微环境是癌症生长和侵袭的重要组成部分。为了模拟癌变的进展过程，需要一种具有生物学相关性的人源基质。本方案通过应用基于人源平滑肌瘤的基质，对体外三维球体侵袭实验进行了改进。此外，本方案还引入了一种基于计算机的细胞侵袭分析方法。...

基于完全人源肿瘤基质的三维球体侵袭实验

本文介绍了一种有效的体外实验方法，用于评估肿瘤细胞条件培养基吸引巨噬细胞的能力。...

体外实验研究肿瘤细胞与巨噬细胞的相互作用

本实验方案的目的是建立一种三维体外模型，用于在类似肿瘤组织的环境中研究癌相关成纤维细胞（CAFs）的分化过程，该模型可应用于多种分析系统，如免疫荧光、转录分析和活细胞成像。...

一种更接近生理条件的三维球体模型用于癌相关成纤维细胞分化与侵袭的体外研究

本文介绍一种利用可渗透膜支持物的方法，以促进研究肿瘤细胞通过非接触性旁分泌信号抑制免疫反应的机制。该系统适用于研究肿瘤分泌因子在抑制巨噬细胞活化中的作用。...

利用可渗透膜支持物共培养研究肿瘤分泌的旁分泌配体对巨噬细胞活化的影响

该方法可同时评估三维球状体实验中的癌细胞侵袭和T细胞介导的细胞毒性。球状体在无支架的琼脂糖多微孔模具中生成。共培养及包埋于I型胶原基质均在同一装置内完成，从而可实时监测癌细胞的侵袭行为以及T细胞介导的细胞毒性效应。...

在三维培养中监测癌细胞侵袭和T细胞毒性

本文介绍了一种球形体成像装置的制备方案。该装置可实现对癌细胞球形体的动态或长期荧光成像。本方案还提供了一种简单的图像处理流程，用于分析癌细胞的侵袭行为。...

三维球体模型中癌细胞侵袭的实时荧光成像与分析

了解巨噬细胞与肿瘤球状体在3D胶原I基质中的共侵袭测定方法。该实验利用人单核细胞来源的巨噬细胞与H1299 GFP肿瘤细胞共培养，研究KIF16B蛋白在肿瘤微环境中对细胞侵袭行为的影响机制。

巨噬细胞-肿瘤类球体共侵袭实验

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