巨噬细胞-肿瘤球状体共侵袭测定

我们想研究癌症和免疫细胞的相互作用，以更好地了解它们在转移过程中如何相互作用。在大多数情况下，体内模型是在免疫系统的背景下研究有关 3D 癌细胞侵袭的研究问题的常规方法，或者系统的孤立组件是重点。一种允许分析细胞行为的方法，它模拟了体内情况的复杂性，但允许在显微镜下更直接地纵特定的环境特征。

我们证明，当未改变的癌细胞与已耗尽运动蛋白 KIF16B 的巨噬细胞共培养时，它们将减少对 3D 胶原蛋白 I 基质的侵袭。这表明 KIF16B 驱动的巨噬细胞表面蛋白回收在肿瘤微环境中的作用。我们希望继续改进我们的方法，以允许在巨噬细胞癌细胞环境的界面处可视化基质降解，从而更好地了解降解和粘附机制。

首先，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的 25 平方厘米细胞培养瓶中用癌细胞培养基培养 H1299 GFP 细胞，直到它们达到 80% 汇合。用 DPBS 洗涤细胞一次，然后加入 1 毫升胰蛋白酶-EDTA，持续 2 至 3 分钟，直至细胞分离。通过添加 2 mL 癌细胞培养基来终止酶促反应。

接下来，将分离的细胞悬液放入 15 mL 试管中，以 245 G 离心 5 分钟。除去含有胰蛋白酶溶液的上清液，然后用 5 毫升 DPBS 洗涤沉淀。离心后，将沉淀重悬于 5 mL 癌细胞培养基中。

使用 Neubauer 室对细胞进行计数。将 8， 000 个细胞转移到最终体积为 25 μL 癌细胞培养基的 96 孔超低粘附板中。将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育三天。

三天后，在显微镜下检查球体的均匀性。采集人血样后，将 20 毫升血液从输液袋转移到 50 毫升反应管中。将 15 mL 淋巴细胞分离培养基加入新的 50 mL 试管中。

小心地将 20 毫升血液转移到含有淋巴细胞分离培养基的试管中，不要混合，然后将混合物在 4 摄氏度下以 450 G 离心 30 分钟。离心过程中，将 10 mL 冷 RPMI 1640 培养基加入新的 50 mL 试管中。离心后，将致密的白色相从含血管转移到准备好的含 RPMI 的试管中，并用冷 RPMI 填充至 50 mL。

悬浮液在 4 °C 下以 450 G 离心 10 分钟，然后弃去上清液。将沉淀重悬于 10 mL 冷 RPMI 中，并用 RPMI 1640 填充至 50 mL。再次离心混合物，然后将沉淀重新悬浮在 50 毫升 RPMI 中。

再次离心样品，并将细胞沉淀重悬于 1.5 mL 冷单核细胞缓冲液中。接下来，在细胞悬液中加入 250 μL 抗 CD14 MicroBeads，并在冰上孵育 15 分钟。在孵育过程中，通过将过滤器连接到磁性分离架上来制备分离柱。

向柱中加入 900 μL 单核细胞缓冲液进行平衡。孵育后，将细胞悬液倒入过滤器上，使其在重力作用入废液管。加入 1 mL 单核细胞缓冲液以洗涤含有与磁珠结合的细胞的色谱柱。

将柱下的废液管更换为含有 20 mLL RPMI 的新鲜 50 mLL 试管。向柱中加入 3 mL 单核细胞缓冲液。从磁力架上取下色谱柱并贴上邮票。

将细胞压入准备好的 50 毫升试管中，并用 RPMI 填充至 30 毫升。在光学显微镜下使用 Neubauer 计数室对细胞进行计数，并用 RPMI 将细胞数调整为每毫升 6 个细胞的幂次方 10 的两倍。将 1 毫升细胞悬液接种到 6 孔室的每个孔中，并在 37 摄氏度下与 5% 二氧化碳孵育 2 到 4 小时。

孵育后，检查细胞是否正确粘附，并用 1.5 毫升单培养基替换 RPMI。继续孵育长达 6 天，直到单核细胞分化为巨噬细胞。在六孔板中从供体血液样品中获得原代人巨噬细胞后，加入 500 μL Accutase，孵育 40 分钟以分离巨噬细胞。

然后加入 500 μL 培养基并转移到 15 mL离心管中进行离心。然后用 2 毫升 DPBS 洗涤细胞一次，并用 Neubauer 室计数。在 40 微升胶原蛋白 I 混合物中稀释所需数量的巨噬细胞，并短暂涡旋试管。

要清洗球体，请将 300 微升 DPBS 添加到 96 孔板的孔中。使用带有切割端的 1 毫升蓝色移液器吸头收集带有 DPBS 的类固醇。一旦类固醇进入吸头，将移液器短暂推到成像室的底部，以通过表面张力转移肿瘤类固醇。

尽可能多地去除与类固醇转移的残留 DPBS。将 40 微升胶原蛋白 I 巨噬细胞混合物迅速添加到含有类固醇的成像室中。在潮湿条件下，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育板 30 分钟，以充分聚合胶原蛋白混合物。

聚合后，小心地向每个孔中加入 25 μL 癌细胞培养基，并继续孵育 3 天。在所需的时间点使用激光扫描显微镜对活体样品进行成像。在侵袭的第 3 天，测量 H1299 GFP 球体面积为 40、307 平方微米，而球体周长为 1700.17 微米，表明随着时间的推移而增长。

观察到癌细胞从球体集体侵袭。鉴定出 51 个分离的颗粒，作为单个癌细胞侵袭的指标。椭球体保持 1.10 的纵横比和 0.18 的圆度，显示出低变形。