Name: 将光谱和质谱成像方法相关联，以可视化药物在软组织切片中的分布 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-20T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: 了解非线性光学光谱与质谱成像联用技术，用于软组织切片中药物分布的高分辨率可视化。该方法可无标记快速分析皮肤药物渗透与生物利用度，为局部给药制剂开发提供关键机制见解。

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本研究由 Haleon CH SARL 资助。NAB 和 RHG 的部分工作得到了美国卫生与公共服务部（HHS）食品药品监督管理局（FDA）通过财政援助奖项（1-U01-FD006533）的支持。本研究还由英国商业、能源与产业战略部通过英国国家测量系统项目 NMS/ID74 和 NMS/ST18 提供资助。本文内容仅代表作者观点，不一定代表 FDA/HHS 或美国政府的官方立场，亦不构成其认可。NAB 对分析测量科学社区（Community for Analytical Measurement Science）通过分析化学信托基金（Analytical Chemistry Trust Fund）资助的 2020 年 CAMS 研究员奖所提供的支持表示感谢。

伦理声明：人类皮肤样本由查尔斯河实验室（CRL）在英国爱丁堡从英国格拉斯哥的 Tissue Solutions Ltd 公司获得。所有匿名样本均依照采集国的法律和伦理标准获取，并已获得捐赠者或其近亲的伦理批准和知情同意。
1. 皮肤切片
使用冷冻切片机对皮肤组织进行切片。
<ol>
	<li>将处理过的皮肤圆片从 -20 °C 冰箱中取出，并从圆片中心切下一小块（约 1.0 cm × 1.0 cm）。</li>
	<li>将样品置于恒冷切片机的样品头中，覆盖在冷冻水滴上。请勿使用最佳切割温度（OCT）包埋剂或其他包埋介质。</li>
	<li>将刀片温度和样品温度分别设置为 -20 °C 和 -16 °C。</li>
	<li>切下 30 µm 厚的切片，并贴附于玻璃盖玻片（#1.5，Fisher Scientific）上。</li>
	<li>立即进行受激拉曼散射（SRS）和飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）检测；或者，也可将样品真空封装后于 -80 °C 保存。</li>
	<li>使用前干燥 20 分钟。</li>
</ol>
2. SRS 成像
使用相干拉曼显微镜进行SRS、SHG和TPEF显微成像。通过1031.2 nm的斯托克斯光束产生两个皮秒激光脉冲，并与可调谐的泵浦光束在空间和时间上重叠。以20 MHz频率调制的斯托克斯光束通过透射方式实现对受激拉曼损耗信号的检测。采用基于硅的探测器结合锁相放大器进行信号检测。另一通道用于收集二次谐波和发射荧光信号，使用光电倍增管进行探测。
<ol>
	<li>安装适用于多光子组织成像的物镜和聚光镜，在本例中使用一个浸水式40倍&#160;放大倍率物镜（1.1 NA）并配合一个短工作距离的空气聚光镜（0.9 NA）。</li>
	<li>将固定好的组织切片放置于SRS显微镜的样品台上，使组织位于载玻片与聚光镜相同的一侧。将物镜聚焦于组织切片上，然后优化聚光镜的高度。</li>
	<li>将激光功率设置为适当值，以获得良好的信噪比，同时避免损伤组织。在本示例中，样品处的泵浦光束功率约为10 mW，斯托克斯光束功率约为30 mW。有关SRS测量的实际考虑，请参见Tsikritsis et al 的研究4。</li>
	<li>以X1放大倍数采集整个切片的拼接图像，分辨率为512 ×&#160;512像素，对应成像范围为290 µm ×&#160;290 µm，成像速度为400 Hz，线平均为1，波数设定为2850 cm-1，对应CH2伸缩振动。</li>
	<li>在整张切片的拼接图像中选择一个感兴趣区域（ROI），需考虑以下因素：(i) 位于中心位置，避开样本边缘最外侧20%的区域，该区域可能存在未暴露于药物的皮肤，因在Franz扩散池装置中被夹紧所致；(ii) 组织表面足够平坦，可在同一光学深度层面进行观察；(iii) 具有明显的结构特征，以便在样品转移至飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）时便于视觉识别。</li>
	<li>在整个研究中对SRS及SHG/荧光探测器采用一致的增益设置，并采集以下区域的图像：(i) C-H伸缩振动区域（2945 cm-1、2850 cm-1和2650 cm-1，分别对应CH3、CH2以及非共振对照）；(ii) 指纹区域（1666 cm-1和1723 cm-1，分别对应酰胺I带和非共振对照）；(iii) 与所用药物相关的共振及非共振波数；在本示例中分别为1586 cm-1和1530 cm-1，对应C=C键振动和非共振对照。</li>
</ol>
SRS 成像后，立即将样品转移至 ToF-SIMS 装置进行分析。
3. 飞行时间二次离子质谱成像
采用30 keV的Bi3+一次离子束（束流为0.2 pA）进行飞行时间二次离子质谱成像。
<ol>
	<li>选择合适的采集参数；本示例中采用负离子极性模式，占空比时间为 100 ms，质荷比范围为 m/z 0–900，离子束直径为 5 µm。使用 20 eV、5 µA 的电子漫射枪进行电荷补偿。</li>
	<li>通过载物台宏扫描模式获取整体图像，以覆盖整个组织切片，视场大小根据组织尺寸而定（本例中为 2.5 至 3.0 mm ×&#160;8.5 至 9.0 mm）。该整体图像是由多个较小图像拼接而成的马赛克图像。本示例中，每个小图像的视场为 0.5 mm ×&#160;0.5 mm（256 ×&#160;256 像素），每个像素采集 1 次离子束信号，对应的离子剂量为 8.18 ×&#160;108 离子/cm2。</li>
	<li>采用相同方法，选择合适的视场采集感兴趣区域（ROI）图像；本例中视场为 1.0 mm ×&#160;0.5 mm，每帧每个像素采集 4 次，每区块采集 10 帧，对应的离子剂量为 1.31 ×&#160;1011&#160;离子/cm2。</li>
	<li>为确保质量控制，在检测每张皮肤切片前后，立即分析组织匀浆样本。使用 0.5 mm ×&#160;0.5 mm（256 ×&#160;256 像素）的视场，每个像素采集 1 次，每次扫描采集 1 帧，共进行 15 次扫描。该设置对应的离子剂量密度为 3.27 ×&#160;1010&#160;离子/cm2。</li>
	<li>采集完成后，可使用 H−、C−、C2− 和 C3− 离子对所得质谱数据进行校准。</li>
	<li>数据采集与提取使用 Surface Lab 7.1 软件完成。</li>
</ol>
4. 使用 MATLAB 进行图像配准和数据分析
<ol>
	<li>使用非负矩阵分解将SIMS和SRS图像各自降维至三个维度，以便作为红、绿、蓝三个颜色通道进行可视化。</li>
	<li>通过选择Matlab控制点选择工具 &#34;cpselect&#34;（Matlab, Mathworks, 2019b 及图像处理工具箱），在上述两幅非矩阵分解图像之间选择匹配的特征点。</li>
	<li>使用 &#34;cp2tform" 和 &#34;imtransform&#34; 函数执行图像配准，以SIMS数据作为固定图像，光学光谱数据作为移动图像，应用仿射变换。</li>
	<li>当在感兴趣药物的ToF-SIMS数据中检测到多个峰时，将这些峰的强度相加，以生成组合的药物离子强度。</li>
	<li>提取每个对应皮肤组织样本前后两组匀浆数据集的平均总离子计数。利用该对应值，对每幅皮肤图像中药物离子的ToF-SIMS数据强度进行归一化。</li>
	<li>配准完成后，通过将相应图像分配至RGB通道，生成光学光谱与SIMS数据的叠加图像：红色（CH2的SRS图像）、绿色（胶原蛋白的SHG图像）、蓝色（双氯芬酸的SIMS图像，包含质荷比m/z为214.04、216.04、250.02、252.02、294.01和296.01的多种离子信号）。</li>
</ol>

<ol><li>Belsey, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualisation+of+drug+distribution+in+skin+using+correlative+optical+spectroscopy+and+mass+spectrometry+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Visualisation of drug distribution in skin using correlative optical spectroscopy and mass spectrometry imaging.</a> J Control Release. 364, 79-89 (2023).</li>
<li>Pudlas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+spectroscopy%3A+A+noninvasive+analysis+tool+for+the+discrimination+of+human+skin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Raman spectroscopy: A noninvasive analysis tool for the discrimination of human skin cells.</a> Tissue Eng Part C Methods. 17 (10), 1027-1040 (2011).</li>
<li>Raman, C. V., Krishnan, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+type+of+secondary+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A new type of secondary radiation.</a> Nature. 121 (3048), 501-502 (1928).</li>
<li>Tsikritsis, D., Legge, E. J., Belsey, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+considerations+for+quantitative+and+reproducible+measurements+with+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Practical considerations for quantitative and reproducible measurements with stimulated Raman scattering microscopy.</a> Analyst. 147 (21), 4642-4656 (2022).</li>
<li>Sarri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulated+Raman+histology%3A+One+to+one+comparison+with+standard+hematoxylin+and+eosin+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Stimulated Raman histology: One to one comparison with standard hematoxylin and eosin staining.</a> Biomed Opt Express. 10 (10), 5378-5384 (2019).</li>
<li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+use+of+stimulated+Raman+scattering+in+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the use of stimulated Raman scattering in histopathology.</a> Analyst. 146 (3), 789-802 (2021).</li>
<li>Mansfield, J., Moger, J., Green, E., Moger, C., Winlove, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+specific+imaging+and+in-situ+chemical+analysis+of+articular+cartilage+with+stimulated+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Chemically specific imaging and in-situ chemical analysis of articular cartilage with stimulated Raman scattering.</a> J Biophotonics. 6 (10), 803-814 (2013).</li>
<li>Shi, L., Fung, A. A., Zhou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+stimulated+Raman+scattering+imaging+for+tissues+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Quant+Imaging+Med+Surg%22%5BJournal%5D)">Advances in stimulated Raman scattering imaging for tissues and animals.</a> Quant Imaging Med Surg. 11 (3), 1078-1101 (2021).</li>
<li>Brzozowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulated+Raman+scattering+microscopy+in+chemistry+and+life+science+-+development%2C+innovation%2C+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Stimulated Raman scattering microscopy in chemistry and life science - development, innovation, perspectives.</a> Biotechnol Adv. 60, 108003(2022).</li>
<li>Buchberger, A. R., Delaney, K., Johnson, J., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging%3A+A+review+of+emerging+advancements+and+future+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging: A review of emerging advancements and future insights.</a> Anal Chem. 90 (1), 240-265 (2018).</li>
<li>Seeley, E. H., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+of+proteins+in+tissues+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18126-18131 (2008).</li>
<li>Vanbellingen, Q. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-of-flight+secondary+ion+mass+spectrometry+imaging+of+biological+samples+with+delayed+extraction+for+high+mass+and+high+spatial+resolutions%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Time-of-flight secondary ion mass spectrometry imaging of biological samples with delayed extraction for high mass and high spatial resolutions.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (13), 1187-1195 (2015).</li>
<li>Singh, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ToF-SIMS+3D+imaging+unveils+important+insights+on+the+cellular+microenvironment+during+biomineralization+of+gold+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">ToF-SIMS 3D imaging unveils important insights on the cellular microenvironment during biomineralization of gold nanostructures.</a> Sci Rep. 10 (1), 261(2020).</li>
<li>Yoon, S., Lee, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+tissue+sample+preparation+for+time-of-flight+secondary+ion+mass+spectrometry+%28ToF-SIMS%29+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Converg%22%5BJournal%5D)">Biological tissue sample preparation for time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) imaging.</a> Nano Converg. 5 (1), 24(2018).</li>
<li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ToF-SIMS+methodology+for+analyzing+inter-tissue+lipid+distribution+variations+and+intra-tissue+multilevel+mass+spectrometry+imaging+within+a+single+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem+J%22%5BJournal%5D)">A ToF-SIMS methodology for analyzing inter-tissue lipid distribution variations and intra-tissue multilevel mass spectrometry imaging within a single rat.</a> Microchem J. 200, 110235(2024).</li>
<li>Louw, E. -V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+on+the+topical+and+transdermal+delivery+of+diclofenac+incorporated+in+nano-emulsions%2C+nano-emulgels%2C+and+a+colloidal+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Deliv+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Comparative study on the topical and transdermal delivery of diclofenac incorporated in nano-emulsions, nano-emulgels, and a colloidal suspension.</a> Drug Deliv Transl Res. 13 (5), 1372-1389 (2023).</li>
<li>Hummer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+topical+formulations+using+a+combination+of+in+vitro+methods+to+quantify+the+transdermal+passive+diffusion+of+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm%22%5BJournal%5D)">Optimization of topical formulations using a combination of in vitro methods to quantify the transdermal passive diffusion of drugs.</a> Int J Pharm. 620, 121737(2022).</li>
<li>Sjövall, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+distribution+of+skin+lipids+and+topically+applied+compounds+in+human+skin+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Imaging the distribution of skin lipids and topically applied compounds in human skin using mass spectrometry.</a> Sci Rep. 8 (1), 16683(2018).</li>
<li>Delvaux, X., Noël, C., Poumay, Y., Houssiau, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+human+epidermis+by+combining+tof-sims+and+multivariate+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biointerphases%22%5BJournal%5D)">Probing the human epidermis by combining tof-sims and multivariate analysis.</a> Biointerphases. 18 (1), 011002(2023).</li>
<li>Kolenc, O. I., Quinn, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+cell+metabolism+through+autofluorescence+imaging+of+nad+%28p%29+h+and+fad%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Evaluating cell metabolism through autofluorescence imaging of nad (p) h and fad.</a> Antioxid Redox Signal. 30 (6), 875-889 (2019).</li>
<li>Hanson, K. M., Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+and+quantification+of+ultraviolet-induced+reactive+oxygen+species+in+ex+vivo+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Observation and quantification of ultraviolet-induced reactive oxygen species in ex vivo human skin.</a> Photochem Photobiol. 76 (1), 57-63 (2002).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+skin+imaging+assessment+of+human+stress+during+head-down+bed+rest+using+a+portable+handheld+two-photon+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Non-invasive skin imaging assessment of human stress during head-down bed rest using a portable handheld two-photon microscope.</a> Front Physiol. 13, 899830(2022).</li>
<li>Brunetti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+morphologic+and+functional+imaging+for+diagnosis%2C+staging+and+follow+up+in+aids%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Q+J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Correlative morphologic and functional imaging for diagnosis, staging and follow up in aids: An overview.</a> Q J Nucl Med. 39 (3), 201-211 (1995).</li>
<li>Van Zyl, T., Van Rensburg, L. J., Naidoo, K., Merven, M., Opperman, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+imaging+and+histopathology+of+a+complicated+sinonasal+teratocarcinosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22SA+J+Radiol%22%5BJournal%5D)">Correlative imaging and histopathology of a complicated sinonasal teratocarcinosarcoma.</a> SA J Radiol. 27 (1), 2548(2023).</li>
<li>Huber, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+approach+of+MALDI+drug+imaging%2C+immunohistochemistry%2C+and+digital+image+analysis+for+drug+distribution+studies+in+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Novel approach of MALDI drug imaging, immunohistochemistry, and digital image analysis for drug distribution studies in tissues.</a> Anal Chem. 86 (21), 10568-10575 (2014).</li>
</ol>

MBB 是本研究资助机构 Haleon CH SARL 的雇员。

该方法结合非线性光学光谱与质谱成像，可在亚微米空间分辨率和高灵敏度下检测药物在软组织中的分布。重要的是，该成像过程无需使用可能产生干扰的标记物，而基于荧光的显微技术通常需要此类标记物。该工作流程的进一步验证包括对组织切片进行常规苏木精和伊红（H&amp;#38;E）染色，以阐明皮肤结构，并实现所得的受激拉曼散射（SRS）与二次离子质谱（SIMS）图像的配准1。通过对光学光谱数据应用聚类分析，可清晰区分皮肤形态，表明这种非靶向方法在区分皮肤层次方面优于传统的H&amp;#38;E染色组织学成像。这种新型的关联成像方法首次证实了局部使用扶他林凝胶后皮肤中双氯芬酸储库的存在，并首次实现了对其形成与生长动力学的监测。
飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）此前已被用于高灵敏度、高特异性地独立可视化人皮肤和重建表皮中渗透的药物以及内源性脂质18,19。将ToF-SIMS与受激拉曼散射（SRS）及二次谐波生成（SHG）联用，可进...

了解活性药物成分在局部或全身给药后于软性生物组织中分布的速率、程度及其驱动因素，对于阐明组织特异性药物摄取、代谢和清除的机制（即更深入理解药物药代动力学）至关重要。本文介绍一种新型的关联成像方法，将非线性光学光谱技术与质谱成像技术相结合，可在同一样本组织中无需标记即可可视化组织结构及局部药物的分布情况1。
拉曼光谱（RS）已成为一种有价值的工具，可用于在细胞和组织内以高空间分辨率和分子特异性绘制药物分布图2。RS依赖于样品对光的非弹性散射3，通过样品中分子的特征振动模式实现详细的化学表征，且无需使用外源性标记物。然而，生成高分辨率图像所需的长时间采集可能会影响敏感生物样品的完整性。此外，在探测较深组织层时，组织对光的散射和吸收会衰减拉曼信号，进一步限制其灵敏度。受激拉曼散射（SRS）显微技术相较于传统RS是一项重大进步，它利用脉冲激光激发并检测受激拉曼信号4。SRS显微技术能够实现二维和三维快速成像，并具有高空间分辨率；当与二次谐波产生（SHG）和双光子激发荧光（TPEF）显微技术联用时，可提供关于结缔组织、胶原蛋白和弹性蛋白的全面图像1,5,6,7,8,9。SHG显微是一种非线性光学技术，依赖于光与样品中非中心对称结构的相互作用，产生波长为入射光一半的信号。该技术特别适用于成像生物组织中如胶原蛋白等有序结构。TPEF是另一种非线性显微技术，其中两个低能量光子同时激发一个荧光分子，使其发出荧光。TPEF可在近红外波段进行激发，该波段能更深入穿透生物样品，从而实现深层组织成像并减少光损伤。
质谱成像（MSI）是一种强大的分析技术，它结合了质谱的能力与空间信息，能够无需标记地鉴定多种分子10,11,12。飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）通过用高能一次离子轰击样品表面，使表面释放出二次离子。这些二次离子随后被加速进入飞行时间分析器，在其中测定其质荷比。该分析可实现对分子碎片和同位素变异的高灵敏度和高分辨率鉴定。ToF-SIMS 在生物和药物研究中已展现出重要应用价值，可用于研究细胞13、组织14,15和器官15中的化学物质和生物分子。
SRS 和 ToF-SIMS 均已被独立用于研究药物在不同皮肤模型中的分布。然而，将这两种技术结合使用，发挥其互补优势，具有更高的价值。本研究描述了一种将光学显微技术（SRS、TPEF 和 SHG）与 ToF-SIMS 相结合的工作流程，以获得皮肤形态的亚微米空间分辨率图像（由光学方法提供），并叠加具有更高检测灵敏度的药物信号图像（由 ToF-SIMS 提供）。该方法已被用于解决一个具有挑战性的案例，即可视化商用外用制剂（Voltaren 凝胶）处理后离体皮肤组织中双氯芬酸的分布情况。成功的关键标准包括：具备高化学灵敏度以检测治疗浓度下的双氯芬酸，以及足够的空间分辨率以分辨皮肤结构。尽管通过一些繁琐且技术要求较高的方法（如胶带剥离后定量16，或开放流式微透析17）可在外用给药后定量测定不同皮肤层中的双氯芬酸含量，但这些方法无法阐明辅料依赖性的双氯芬酸分配、渗透、滞留及其在各皮肤层中的深度分布，而这些正是支持产品开发阶段的关键因素。
在进行下述测量方法之前，已在皮肤表面涂抹Voltaren Forte凝胶（含2.32%双氯芬酸二乙胺）或相应的安慰剂凝胶（由Haleon CH SARL提供），涂抹时间分别为4、12、16或24小时。去除残留制剂后，对同一批皮肤样本进行SRS和ToF-SIMS测量；该方法的完整细节详见原始论文1。

<table><tbody><tr><td>相干拉曼显微镜&amp;nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td>https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/</td><td></td></tr><tr><td>人皮肤样本&amp;nbsp;</td><td>Tissue Solutions Ltd, Glasgow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica CM 1850 冷冻切片机&amp;nbsp;</td><td>Leica Biosystems</td><td>https://www.leicabiosystems.com/en-fr/histology-equipment/cryostats/leica-cm1850/</td><td>已停产</td></tr><tr><td>PicoEmerald-S 激光系统</td><td>APE Berlin</td><td>https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/</td><td></td></tr><tr><td>飞行时间二次离子质谱仪 5（ToF SIMS 5）</td><td>IONToF GmbH</td><td>https://spectral.se/products/tof-sims-5</td><td></td></tr></tbody></table>

Correlative Optical Spectroscopy and Mass Spectrometry Imaging Methodology to Visualise Drug Distribution in a Soft Tissue Section

一种新型相关成像方法已得到开发，该方法结合亚微米级空间分辨率与基于光谱学和质谱成像的高灵敏度药物检测技术，用于可视化药物施用后在软组织中的化学物质分布。本示例中，该方法已在切除的皮肤组织上进行测试 体外 局部应用一种市售非甾体抗炎药物产品16小时。首先采用包括受激拉曼散射、二次谐波生成和双光子荧光显微在内的非破坏性光学光谱方法，对皮肤结构和形态进行成像。随后，利用飞行时间二次离子质谱法（ToF-SIMS）分析相同的皮肤组织样本，从而提高在表皮和真皮等最外层皮肤中检测双氯芬酸的灵敏度。通过设计图像配准方法，整合光学成像与质谱数据。该方法结合了无标记、高分辨率的组织结构可视化与高灵敏度的化学检测，为研究药物在皮肤中的分布以及潜在地在其他软生物组织中的分布提供了有力工具。

图1展示了基于特征的图像配准结果，显示了两个皮肤样本的SRS、SHG和SIMS配准叠加图像——其中一个样本使用安慰剂处理（图1a），另外两个样本分别使用Voltaren凝胶处理4小时（图1b）和16小时（图1c）。在该图像中，药物强度信号总和（来自ToF-SIMS测量）以蓝色表示，富含脂质的组织结构（特别是由SRS在2850 cm-1处CH2伸缩振动对比识别的角质层）以红色显示，富含胶原蛋白的组织区域（由SHG信号识别）以绿色表示。对感兴趣区域获取高分辨率图像的典型采集时间分别为：SRS最长240秒，SIMS最长800秒。然而，这些时间会根据所选区域的大小和像素驻留时间而变化。该方法可对双氯芬酸在后续皮肤层中的渗透进行直接且灵敏的可视化。应用4小时后，双氯芬酸出现在皮肤表层约50 µm深度范围...

本研究提出了一种利用非线性光学光谱与质谱成像技术对软组织中药物进行关联成像的方法。将高分辨率皮肤成像与高灵敏度药物检测相结合，为研究药物在皮肤中的分布提供了有力手段，这对于开发更优的局部外用产品至关重要。

一种新的关联成像方法，结合亚微米级空间分辨率，通过光谱学和质谱技术实现药物的高灵敏度检测……

我们正在开发相关光谱成像方法，以更深入地理解局部药物递送过程。目标是获得关于药物在皮肤各层中渗透及其生物利用度的新机制性认识。这些信息将有助于改进药品的配方设计和给药方案。本研究解决了当前在同时形成皮肤结构及其内部药物分布信息方面方法缺失的问题。通过高空间分辨率和高灵敏度的局部给药方式，可实现对药物分布的实时追踪。获取此类信息对于开发更优的局部外用产品至关重要。本方案提供了一种无需标记、快速、高分辨率的成像方法，相较于现有的传统技术，具有更高的化学灵敏度，可实现对皮肤中药物分布的可视化。所有这些信息均可从同一样本组织切片中提取。这些发现通过提出一种将光谱学与质谱技术相结合的可靠方法，推动了相关成像技术的发展。所开发的图像配准技术可确保数据集的精确定位，从而实现对药物在组织中分布情况的详细分析。这一进展有助于改进局部药物递送系统，并加深对组织间生物相互作用的理解。该研究提出了若干科学问题，包括制剂辅料如何影响药物转运、影响药物在不同类型皮肤中渗透的因素、药物的长期释放与清除动力学，以及拉曼光谱与质谱成像（MSI）相关成像技术在研究其他外用药物及软组织中其他物质方面的广泛应用。[旁白] 对于受激拉曼散射（SRS）显微镜，使用40倍水浸物镜，并配合短工作距离的空气冷凝镜。将固定好的皮肤组织切片置于SRS显微镜的样品台上，确保组织位于载玻片与冷凝镜相对的一面。将物镜聚焦于组织切片上，然后优化冷凝镜的高度。将激光功率设置为适当值，以获得良好的信噪比，同时避免损伤组织。接下来，获取对应于CH₂伸缩振动带的全组织切片马赛克图像。然后选择感兴趣区域，将成像参数设置为512 × 512像素分辨率，覆盖290 × 290微米的区域。使用400赫兹X1放大倍率的成像速度，线平均值设为1。现在对SRS和二次谐波生成（SHG）荧光探测器应用一致的增益设置。在2,850 cm⁻¹的CH伸缩振动区域（对应CH₂）采集图像。随后在1,666 cm⁻¹的指纹区域（对应酰胺I带）采集图像。完成SRS成像后，立即将皮肤样品转移至飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）装置。设置负离子极性，占空比时间为100毫秒，质荷比范围为0至900，离子束直径为5微米。使用20电子伏、25微安的电子淹没枪进行电荷补偿。使用载物台宏光栅模式获取整体图像，根据组织尺寸映射整个组织切片的视场。接下来，选择1 × 0.5毫米的视场，每像素每帧采集4次，每区块采集10帧，对应离子剂量为1.31 × 10¹¹ 离子/cm²。通过选择合适的视场，采集感兴趣区域的图像。设置0.5 × 0.5毫米的视场，分辨率为256 × 256像素。每像素采集1次，每次扫描1帧，共进行15次扫描，总离子剂量密度为3.27 × 10¹⁰ 离子/cm²，用于组织匀浆样品的质量控制检查。采集完成后，使用H、C、C₂和C₃离子对所得质谱进行校准。使用Surface Lab 7.1软件进行数据采集与提取。对于图像配准，通过非负矩阵分解将SIMS和SRS图像均降维至三维，并将其可视化为红、绿、蓝三色通道。使用MATLAB控制点选择工具CP Select，在两个非负矩阵分解图像之间选择匹配特征。利用CP2Tform和IMTRANSFORM函数执行配准。以SIMS数据为固定图像，光学光谱数据为移动图像，进行精细变换。对于在ToF-SIMS数据中检测到多个峰的目标药物，将这些峰的强度求和，以生成综合药物离子强度。从每个皮肤组织样品的两组匀浆数据集中提取平均总离子计数。利用该对应值，对每幅皮肤图像中的ToF-SIMS药物离子强度进行归一化处理。完成配准后，通过将相应的图像分配至RGB通道，叠加光学光谱与SIMS数据。在本研究中，涂抹Voltaren凝胶4小时后，皮肤上层约50微米区域内的药物信号较安慰剂处理组明显增强。在涂抹Voltaren凝胶16小时后，药物信号进一步延伸至皮肤更深层，表明药物在组织中的渗透性增强。

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将光谱和质谱成像方法相关联，以可视化药物在软组织切片中的分布

一种成像方法 离体 通过光学频率域成像（OFDI）对肺切除标本进行成像，并实现与组织病理学的精确对应，该方法对于建立肺部病理特异性的OFDI解读标准至关重要。此技术可推广应用于其他组织类型及成像技术，以获得精确的影像与组织病理学对应关系，从而实现准确的图像解读与评估。利用该技术建立的影像判读标准，可进一步用于未来影像评估研究。 体内...

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多模态成像与光谱纤维束微内窥镜平台用于无创、 体内 组织分析

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利用激光显微切割液相色谱质谱法（LCM-LC/MS）对肺结核病灶中药物的空间分布进行定量分析

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在癌症免疫治疗时代，人们对阐明肿瘤微环境动态的研究兴趣显著增加。本方案详细介绍了质谱成像技术的染色和成像步骤，可实现高度多重的空间分析。...

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帕金森病中神经肽的基质辅助激光解吸电离成像质谱分析

了解非线性光学光谱与质谱成像联用技术，用于软组织切片中药物分布的高分辨率可视化。该方法可无标记快速分析皮肤药物渗透与生物利用度，为局部给药制剂开发提供关键机制见解。

相关光学光谱与质谱成像方法用于可视化软组织切片中的药物分布

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