相关光学光谱与质谱成像方法用于可视化软组织切片中的药物分布

我们正在开发相关光谱成像方法，以更深入地理解局部药物递送过程。目标是获得关于药物在皮肤各层中渗透及其生物利用度的新机制性认识。这些信息将有助于改进药品的配方设计和给药方案。

本研究解决了当前在同时形成皮肤结构及其内部药物分布信息方面方法缺失的问题。通过高空间分辨率和高灵敏度的局部给药方式，可实现对药物分布的实时追踪。获取此类信息对于开发更优的局部外用产品至关重要。本方案提供了一种无需标记、快速、高分辨率的成像方法，相较于现有的传统技术，具有更高的化学灵敏度，可实现对皮肤中药物分布的可视化。所有这些信息均可从同一样本组织切片中提取。

这些发现通过提出一种将光谱学与质谱技术相结合的可靠方法，推动了相关成像技术的发展。所开发的图像配准技术可确保数据集的精确定位，从而实现对药物在组织中分布情况的详细分析。这一进展有助于改进局部药物递送系统，并加深对组织间生物相互作用的理解。

该研究提出了若干科学问题，包括制剂辅料如何影响药物转运、影响药物在不同类型皮肤中渗透的因素、药物的长期释放与清除动力学，以及拉曼光谱与质谱成像（MSI）相关成像技术在研究其他外用药物及软组织中其他物质方面的广泛应用。

[旁白] 对于受激拉曼散射（SRS）显微镜，使用40倍水浸物镜，并配合短工作距离的空气冷凝镜。将固定好的皮肤组织切片置于SRS显微镜的样品台上，确保组织位于载玻片与冷凝镜相对的一面。将物镜聚焦于组织切片上，然后优化冷凝镜的高度。将激光功率设置为适当值，以获得良好的信噪比，同时避免损伤组织。接下来，获取对应于CH₂伸缩振动带的全组织切片马赛克图像。然后选择感兴趣区域，将成像参数设置为512 × 512像素分辨率，覆盖290 × 290微米的区域。使用400赫兹X1放大倍率的成像速度，线平均值设为1。现在对SRS和二次谐波生成（SHG）荧光探测器应用一致的增益设置。在2,850 cm⁻¹的CH伸缩振动区域（对应CH₂）采集图像。随后在1,666 cm⁻¹的指纹区域（对应酰胺I带）采集图像。完成SRS成像后，立即将皮肤样品转移至飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）装置。设置负离子极性，占空比时间为100毫秒，质荷比范围为0至900，离子束直径为5微米。使用20电子伏、25微安的电子淹没枪进行电荷补偿。使用载物台宏光栅模式获取整体图像，根据组织尺寸映射整个组织切片的视场。接下来，选择1 × 0.5毫米的视场，每像素每帧采集4次，每区块采集10帧，对应离子剂量为1.31 × 10¹¹ 离子/cm²。通过选择合适的视场，采集感兴趣区域的图像。设置0.5 × 0.5毫米的视场，分辨率为256 × 256像素。每像素采集1次，每次扫描1帧，共进行15次扫描，总离子剂量密度为3.27 × 10¹⁰ 离子/cm²，用于组织匀浆样品的质量控制检查。采集完成后，使用H、C、C₂和C₃离子对所得质谱进行校准。使用Surface Lab 7.1软件进行数据采集与提取。对于图像配准，通过非负矩阵分解将SIMS和SRS图像均降维至三维，并将其可视化为红、绿、蓝三色通道。使用MATLAB控制点选择工具CP Select，在两个非负矩阵分解图像之间选择匹配特征。利用CP2Tform和IMTRANSFORM函数执行配准。以SIMS数据为固定图像，光学光谱数据为移动图像，进行精细变换。对于在ToF-SIMS数据中检测到多个峰的目标药物，将这些峰的强度求和，以生成综合药物离子强度。从每个皮肤组织样品的两组匀浆数据集中提取平均总离子计数。利用该对应值，对每幅皮肤图像中的ToF-SIMS药物离子强度进行归一化处理。完成配准后，通过将相应的图像分配至RGB通道，叠加光学光谱与SIMS数据。在本研究中，涂抹Voltaren凝胶4小时后，皮肤上层约50微米区域内的药物信号较安慰剂处理组明显增强。在涂抹Voltaren凝胶16小时后，药物信号进一步延伸至皮肤更深层，表明药物在组织中的渗透性增强。