雌性黑腹果蝇种系干细胞壁龛的扩展实时成像

在这里，我们提供了一个详细的方案，用于对果蝇卵巢生态位中种系干细胞 （GSC） 的不对称分裂进行实时成像。我们使用普遍表达光谱体蛋白 Par-1 的绿色荧光蛋白 （GFP） 融合的转基因系。

我们对发现控制细胞干性的新细胞和分子机制感兴趣。我们的主要目标是破译干细胞如何避免在生态位中分化。由于我们在实验条件下工作，因此必须保持组织完整性以确保 GSC 获得生理行为。

我们的方案维持了一个健康和功能性的 GSC 生态位，能够像在体内一样监测分裂的 GSC。使用长寿命成像使我们能够研究 GSC 的整个细胞周期和光谱体动力学。具体来说，我们成功地表征了整个细胞周期中的光谱体变化，这是以前使用固定图像或较短成像周期难以完成的任务。

知道如何在不影响其动力学的情况下进行主要实验，使我们能够探索生态位细胞如何交流。我们想研究由 mRNA（干细胞生物学中的代谢酶）之间的直接相互作用介导的基因表达和细胞代谢的调节机制。首先，制备 100 微升等分试样的链霉素青霉素抗生素混合物，浓度为每毫升 10， 000 单位。

准备该程序所需的所有其他试剂并适当储存。收集一到两天大的果蝇，表达与 GFP 融合的普遍和组成型表达的 par one 到新管中。解剖前，将果蝇在 25 摄氏度的培养箱中培养两天。

将 3 微升的特定 Cell-Tak 粘合剂滴在 35 毫米聚-D-赖氨酸涂层板的盖玻片中心。立即将等体积的 0.1 摩尔碳酸氢钠（pH 值为 8）加入 3 微升胶粘剂滴中。用移液管混合溶液。

要完全蒸发，请将板与盖子一起在室温下孵育 20 分钟。然后将板在 4 摄氏度下存放过夜。第二天解冻板后，用 6 微升高压灭菌器纯水小心洗涤 3 次，不要接触和干扰粘合层。

让水在室温下完全蒸发 5 到 10 分钟。首先，培养果蝇并准备带有涂层的玻璃底板。然后用 70% 乙醇清洁三孔解剖皿、镊子和解剖针。

向解剖皿的三个孔中的每一个孔中加入大约 200 微升的林格溶液。使用镊子，在胸部和腹部的交界处抓住果蝇雌性。轻轻撕开后腹部的角质层并将其向后拉以露出卵巢。

解剖卵巢后，将它们转移到下一个孔中，以减少组织残留物或解剖碎片的污染。在带有 LED 照明的立体显微镜下，使用一对细镊子固定整个卵巢，第二对抓住晚期卵室。轻轻伸展，直到肌肉鞘破裂并滞后。

使用镊子，将 15 至 20 个无肌肉鞘的卵巢一个接一个地转移到含有 200 微升林格培养基的第三个孔中。用 200% Tween 20 预湿 0.1 微升吸头，以防止卵巢粘在吸头壁上。在室温下，使用预先润湿的尖端将 6 微升含有无肌肉鞘卵巢的林格溶液转移到准备好的粘合板上。

使用解剖针或镊子，小心地将卵巢压到林格滴剂的底部，以确保与粘合表面接触。接下来，向 MatTek 板中加入 3 毫升施耐德培养基，补充有 15% FBS 和 0.6% 链霉素青霉素抗生素混合物。将平面上包含无肌肉鞘卵巢的板运输到显微镜站。

将板放在转盘显微镜或共聚焦显微镜的 63 倍物镜上。聚焦样品并为每个锗选择中间的 Z 平面。要配置实验参数，请将捕获类型设置为 3D time lapse。

将激光功率调整到最大值的 70%。将激发波长设置为 488 纳米。Z 堆栈范围为 30 微米，Z 堆栈之间的距离为 1.2 微米。

设置时间点之间的间隔为每 10 分钟一次，持续时间为 17 小时。如果可用，请使用 multi-position 选项重新定义样本的 XY。选择每个天竺葵中间的 Z 平面，以便 Z 堆栈将在此位置居中并开始采集。

使用 Imaris 或 Image J 软件及时并沿 Z 轴分析图像，以可视化光谱体形态的变化。要创建影片，请在每个时间点手动选择最佳 Z 平面。在 G2 MG1 阶段，圆形 G2 光谱区的强 GFP par 1 信号显着降低。

在早期前期，GFP 第一段离开光谱体并填充细胞质，表明种系干细胞进入有丝分裂。在有丝分裂和核膜重组后，GFP par 1 信号在圆形 G1 Spectro 循环中逐渐恢复。Denovo 版的 GFP par 1 到圆形 G1 光谱体导致形成塞、棒和融合光谱体形态。