Name: 雌性黑腹果蝇种系干细胞壁龛的扩展实时成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-20T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: 了解黑腹果蝇卵巢壁龛中生殖系干细胞的扩展实时成像方法。该方案利用GFP融合标记技术，实现对整个细胞周期及spectrosome动态变化的连续监测，为研究干细胞维持机制提供重要工具。

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感谢 Acaimo González Reyes 和 María Olmedo López 对本文手稿提出的宝贵意见。本研究由 PID2021-125480NB-I00（H. S-G）、安达卢西亚政府资助的“&#34;Ayudas a la contratación de personal Investigador Doctor&#34;（J. G-M）、塞维利亚大学第六和第七个研究促进计划（VI 和 VII PPIT-塞维利亚大学）资助的“&#34;Ayuda a proyectos de investigación precompetitivos&#34;（P. R-R），以及塞维利亚大学第六个研究促进计划（VI PPIT-塞维利亚大学）资助的“&#34;Contrato de Acceso de I+D+i&#34;（P. R-R）提供支持。我们谨向生物学家公司（Company of Biologists Ltd）致谢，感谢其慷慨授权，允许我们共享改编自原始出版物的图像（doi:10.1242/DEV.199716）。

注意：步骤 1.4 必须至少提前 2 天完成。步骤 2.1 和 2.2 可提前 1 天完成。
1. 实验前准备 I
<ol>
	<li>准备链霉素/青霉素抗生素混合液（10,000 U/mL 青霉素和 10 mg/mL 链霉素）的 100 µL 分装液，于 -20 °C 保存，直至使用。</li>
	<li>使用经高压灭菌的纯水配制以下 15 mL 溶液，4 °C 保存，并在一个月内使用完毕：碳酸氢钠（NaHCO3）0.1 M，pH 8.0，以及 0.1% Tween 20。</li>
	<li>在超净工作台中配制以下培养基和溶液，以避免污染。使用无菌滤芯吸头和离心管。
	<ol>
		<li>将未稀释的胎牛血清（FBS）以 2 mL 分装，于无菌条件下保存在 -20 °C，直至使用。</li>
		<li>配制添加了 15% FBS 和 0.6% 链霉素/青霉素抗生素混合液的 Schneider's Drosophila 培养基。以 7 mL 分装，4 °C 保存。每份分装液足够用于两块 MatTek 培养皿（见第 2 节）。
		<ol>
			<li>配制 Ringer 溶液（128 mM NaCl、2 mM KCl、1.8 mM CaCl2、4 mM MgCl2、35.5 mM 蔗糖、5 mM Hepes，溶于高压灭菌的纯水中；pH 6.9）。以 1 mL 分装，于 -20 °C 保存，直至使用。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将表达与 GFP 融合的 Par-1 蛋白（poly Ubiquitin-mGFP6::par-1 品系）且羽化后 1–2 天的果蝇收集至含有添加酵母粉的果蝇饲料的新离心管中。在 25 °C 培养箱中培养 2 天后进行解剖。 
	注意：此步骤可使用任何带有荧光标记的目标报告基因品系完成。</li>
</ol>
2. 玻璃底板包被与准备
<ol>
	<li>在35 mm多聚-D-赖氨酸包被的培养皿（玻璃底皿，参见材料表）的盖玻片中央放置3 µL特定的Cell-Tak黏附剂（下文简称细胞与组织黏附剂），无需手动涂布。使用无菌枪头。 
	注意：细胞与组织黏附剂应保存在4 °C。若实验涉及两种遗传条件（通常为对照和突变条件），在同一玻璃底皿中放置两个独立且间距足够的黏附剂液滴。这可确保两种遗传背景在相同条件下成像。</li>
	<li>紧随其后，按照生产商建议，小心地向3 µL黏附剂液滴中加入等体积（本实验方案中为3 µL）的0.1 M NaHCO3（pH 8.0），并通过移液混匀。</li>
	<li>为实现完全蒸发，将培养皿在室温（RT）孵育20分钟，然后于4 °C过夜保存，次日使用。或者，将制备好的培养皿在37 °C孵育25分钟直至完全蒸发，并直接进入下一步操作。两种情况下均需保持培养皿加盖。使用无菌枪头。</li>
	<li>使用前，将制备好的玻璃底皿置于实验台静置15–20分钟，使其恢复至室温（RT）。</li>
	<li>小心清洗制备好的培养皿3次，避免触碰或扰动黏附层。每次清洗时加入6 µL经高压灭菌的纯水，然后使用洁净枪头吸除水分，共清洗三次，以去除NaHCO3溶液残留物。</li>
	<li>将清洁并制备好的培养皿加盖置于室温&#160;静置5–10分钟，使其水分完全蒸发，同时进行组织解剖操作，加盖以防止灰尘颗粒污染。</li>
</ol>
3. Drosophila 卵巢解剖及卵管分离与装片
注意：卵巢解剖在林格氏液（而非 Schneider 培养基）中进行，且不添加胎牛血清（FBS），以防止蛋白质干扰组织样本与粘附剂之间的贴附。
<ol>
	<li>使用70%乙醇在开始前清洁三孔解剖皿、镊子和解剖针。</li>
	<li>在三个孔中各加入足量的任氏液（约 200 µL）。</li>
	<li>在第一个孔中，使用两对镊子按照标准操作程序，将5只饲喂酵母的雌性个体的卵巢解剖至200 µL林格氏液中10,11. 抓住 果蝇 用镊子夹住雌性个体胸部与腹部交界处，然后轻轻撕开腹部后端的角质层，并拉开腹部角质层，直至两侧卵巢暴露。</li>
	<li>将解剖得到的卵巢转移至第二孔中，以减少其他组织残余物或解剖过程中产生的碎屑污染。</li>
	<li>在体视显微镜（8X-13.5X放大倍数，配备发光二极管（LED）照明）下，使用尖头镊子去除15-20个卵管的肌鞘。用一对镊子固定整个卵巢组织，另一对镊子平稳夹住一个晚期卵室，轻轻拉伸，直至肌肉断裂并留在后方。 
	注意：必须避免因接触卵巢的这一区域而对卵原区造成损伤。去除发育阶段超过8-9期的卵室。</li>
	<li>用镊子将15-20个去肌鞘的卵管逐个转移至第三个孔中，该孔内含有200 µL林格氏液。</li>
	<li>用移液器吸取0.1% Tween 20预润湿20–200 µL吸头，以防止卵巢管黏附于吸头的塑料内壁。</li>
	<li>使用预先润湿的枪头，将含有去滤泡膜卵管的6 µL林格氏液转移至已准备好的粘附板（室温保存）。 
	注意：避免移液枪头与粘附层接触，以防在卵巢管沉积后（下一步）发生卵原区脱落。约有30%的卵原区无法正常粘附。</li>
	<li>为确保移植的卵巢管粘附于粘附表面，使用解剖针或镊子轻轻按压卵巢管，使其沉降至任氏液液滴底部，直至接触粘附表面。 
	注意：一旦卵管小叶沉降后，不要试图重新排列。</li>
	<li>小心地向MatTek培养皿中加入3 mL添加了15% FBS和0.6%链霉素/青霉素抗生素混合液的Schneider培养基（步骤1.3）。为防止卵管脱落，应沿培养皿边缘每次缓慢加入1 mL，分次添加。</li>
	<li>将含有去肌鞘卵管的培养板在平坦表面上运送至显微镜工作站。</li>
</ol>
4. 使用共聚焦显微镜进行活体成像
<ol>
	<li>将样品置于转盘显微镜或共聚焦显微镜的63倍物镜下（也可使用类似设备），并对样品进行聚焦。为每个卵原囊选择中间的z平面。</li>
	<li>设置以下实验参数：采集模式：三维时间序列成像；激光功率：70/100；激发波长：488 nm；z轴堆栈范围：30 µm；z轴层间距离：1.2 µm；持续时间：17 h；时间点间隔：每10分钟一次。</li>
	<li>若设备支持多点成像功能，可重新定义样品的XY坐标，并为每个卵原囊选择其中心Z平面，以便z轴堆栈以此位置为中心进行采集。开始图像采集。 
	注意：由于卵原囊的正常宽度为30 µm，每个z轴堆栈将包含约25–27个切片。根据共聚焦显微镜型号的不同，可在每10分钟的时间间隔内对至少25个卵原囊进行成像。通常使用40x/1.30 NA或63x/1.40 NA油浸式平场复消色差物镜。</li>
	<li>利用Imaris或ImageJ（Fiji）软件12,13对图像在时间和Z轴方向上进行分析，以观察谱系体形态的特定变化。图1B'展示了观察中的具体时间点。制作动态图像时，需在每个时间点手动选择最佳的Z平面。</li>
</ol>

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

<ol><li>Li, L., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+niche%3A+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Stem cell niche: structure and function.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 605-631 (2005).</li>
<li>Drummond-Barbosa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+physiological+control+of+germline+stem+cell+lineages+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Local and physiological control of germline stem cell lineages in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 213 (1), e234(2019).</li>
<li>Eliazer, S., Buszczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+a+niche%3A+studies+from+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Finding a niche: studies from the Drosophila ovary.</a> Stem Cell Res Ther. 2 (6), 45(2011).</li>
<li>Rojas-Ríos, P., Guerrero, I., González-Reyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoneme-mediated+delivery+of+Hedgehog+regulates+the+expression+of+bone+morphogenetic+proteins+to+maintain+germline+stem+cells+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoneme-mediated delivery of Hedgehog regulates the expression of bone morphogenetic proteins to maintain germline stem cells in Drosophila.</a> PLoS Biol. 10 (4), e1001298(2012).</li>
<li>Rojas-Ríos, P., González-Reyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+the+plasticity+of+stem+cell+niches%3A+a+general+property+behind+tissue+homeostasis+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: the plasticity of stem cell niches: a general property behind tissue homeostasis and repair.</a> Stem Cells. 32 (4), 852-859 (2014).</li>
<li>Deng, W., Lin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrosomes+and+fusomes+anchor+mitotic+spindles+during+asymmetric+germ+cell+divisions+and+facilitate+the+formation+of+a+polarized+microtubule+array+for+oocyte+specification+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Spectrosomes and fusomes anchor mitotic spindles during asymmetric germ cell divisions and facilitate the formation of a polarized microtubule array for oocyte specification in Drosophila.</a> Dev Biol. 189 (1), 79-94 (1997).</li>
<li>Huynh, J. R., Shulman, J. M., Benton, R., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAR-1+is+required+for+the+maintenance+of+oocyte+fate+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">PAR-1 is required for the maintenance of oocyte fate in Drosophila.</a> Development. 128 (7), 1201-1210 (2001).</li>
<li>Villa-Fombuena, G., Lobo-Pecellín, M., Marín-Menguiano, M., Rojas-Ríos, P., González-Reyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+Drosophila+ovarian+niche+shows+spectrosome+and+centrosome+dynamics+during+asymmetric+germline+stem+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the Drosophila ovarian niche shows spectrosome and centrosome dynamics during asymmetric germline stem cell division.</a> Development (Cambridge). 148 (18), dev199716(2021).</li>
<li>De Cuevas, M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+Drosophila+fusome+and+its+implications+for+oocyte+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the Drosophila fusome and its implications for oocyte specification.</a> Development. 125 (15), 2781-2789 (1998).</li>
<li>Wong Li, C., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Drosophila+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of Drosophila ovaries.</a> J Vis Exp. (1), 52(2006).</li>
<li>Merkle, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection%2C+fixation%2C+and+standard+staining+of+adult+Drosophila+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Dissection, fixation, and standard staining of adult Drosophila ovaries.</a> Methods Mol Biol. 2626, 49-68 (2023).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleach+correction+ImageJ+plugin+for+compensating+the+photobleaching+of+time-lapse+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences.</a> F1000Res. 9, 95(2020).</li>
<li>Duan, T., Cupp, R., Geyer, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+female+germline+stem+cells+undergo+mitosis+without+nuclear+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila female germline stem cells undergo mitosis without nuclear breakdown.</a> Curr Biol. 31 (7), 1602-1610 (2021).</li>
<li>Aldaz, S., Escudero, L. M., Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+imaginal+disc+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila imaginal disc development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (32), 14217-14222 (2010).</li>
<li>Dye, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+and+live+imaging+of+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cultivation and live imaging of Drosophila imaginal discs.</a> Methods Mol Biol. 2540, 275-285 (2022).</li>
<li>Sohr, A., Du, L., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+Drosophila+wing+imaginal+disc+culture+and+furin+inhibitor+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Ex vivo Drosophila wing imaginal disc culture and furin inhibitor assay.</a> Bio Protoc. 9 (16), e3336(2019).</li>
<li>Anllo, L., Plasschaert, L. W., Sui, J., DiNardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+reveals+hub+cell+assembly+and+compaction+dynamics+during+morphogenesis+of+the+Drosophila+testis+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Live imaging reveals hub cell assembly and compaction dynamics during morphogenesis of the Drosophila testis niche.</a> Dev Biol. 446 (1), 25-34 (2019).</li>
<li>Gärthner, S. M. K., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culture+of+Drosophila+pupal+testis+and+single+male+germ-line+cysts%3A+dissection%2C+imaging%2C+and+pharmacological+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culture of Drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment.</a> J Vis Exp. 91, e51868(2014).</li>
<li>Wilcockson, S. G., Ashe, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+ovarian+germline+stem+cell+cytocensor+projections+dynamically+receive+and+attenuate+BMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically receive and attenuate BMP signaling.</a> Dev Cell. 50 (3), 296-310 (2019).</li>
<li>Jackson, J. A., Imran Alsous, J., Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+nurse+cell+behavior+in+late+stages+of+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Live imaging of nurse cell behavior in late stages of Drosophila oogenesis.</a> Methods Mol Biol. 2626, 191-206 (2023).</li>
<li>Díaz de la Loza, M. C., Díaz-Torres, A., Zurita, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+levels+regulate+tissue+migration+and+anterior-posterior+polarity+during+egg+morphogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Laminin levels regulate tissue migration and anterior-posterior polarity during egg morphogenesis in Drosophila.</a> Cell Rep. 20 (1), 121-133 (2017).</li>
<li>Christophorou, N., Rubin, T., Bonnet, I., Piolot, T., Arnaud, M., Huynh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-driven+nuclear+rotations+promote+meiotic+chromosome+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule-driven nuclear rotations promote meiotic chromosome dynamics.</a> Nat Cell Biol. 17 (11), 1388-1398 (2015).</li>
<li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+excitation-contraction+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cardiac excitation-contraction coupling.</a> Nature. 415 (6868), 198-205 (2002).</li>
<li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).</li>
<li>Zielke, N., Korzelius, J., van Straaten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fly-FUCCI%3A+a+versatile+tool+for+studying+cell+proliferation+in+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Fly-FUCCI: a versatile tool for studying cell proliferation in complex tissues.</a> Cell Rep. 7 (2), 588-598 (2014).</li>
<li>Hinnant, T. D., Alvarez, A. A., Ables, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+remodeling+of+the+cell+cycle+accompanies+differentiation+in+the+Drosophila+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Temporal remodeling of the cell cycle accompanies differentiation in the Drosophila germline.</a> Dev Biol. 429 (1), 118-131 (2017).</li>
<li>Hsu, H. J., LaFever, L., Drummond-Barbosa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet+controls+normal+and+tumorous+germline+stem+cells+via+insulin-dependent+and+-independent+mechanisms+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Diet controls normal and tumorous germline stem cells via insulin-dependent and -independent mechanisms in Drosophila.</a> Dev Biol. 313 (2), 700-712 (2008).</li>
<li>Andersen, D., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+ovarian+muscle+contraction+and+oocyte+growth+on+egg+chamber+elongation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Influence of ovarian muscle contraction and oocyte growth on egg chamber elongation in Drosophila.</a> Development (Cambridge). 143 (8), 1375-1382 (2016).</li>
<li>Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mononuclear+muscle+cells+in+Drosophila+ovaries+revealed+by+GFP+protein+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps.</a> Dev Biol. 314 (2), 360-372 (2008).</li>
<li>Ables, E. T., Drummond-Barbosa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+E+controls+Drosophila+female+germline+stem+cell+maintenance+independently+of+its+role+in+proliferation+by+modulating+responsiveness+to+niche+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Cyclin E controls Drosophila female germline stem cell maintenance independently of its role in proliferation by modulating responsiveness to niche signals.</a> Development (Cambridge). 140, 4267-4276 (2013).</li>
<li>Lin, H., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+stem+cell+division+and+egg+chamber+development+in+transplanted+Drosophila+germaria%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Germline stem cell division and egg chamber development in transplanted Drosophila germaria.</a> Dev Biol. 159 (1), 140-152 (1993).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

在此，我们介绍一种用于监测的方案 黑腹果蝇 GSC 生态位长达一段时间，最长可达 16 小时。大多数用于成像的方案 果蝇 生物过程 离体 关注较短的时间窗口，并可在成虫盘中找到多个实例15,16,17，胚胎性腺18,19 或卵巢20,21,22,23图像采集的持续时间当然取决于所研究的发育过程。而瞬时事件的发生时间范围可能从毫秒到秒不等，具体取决于细胞类型和生理条件。24，其他过程（如细胞分裂）可能需要数小时甚至数天的连续拍摄才能观察到。特别是细胞周期的 果蝇 雌性GSCs的完成大约需要12-14小时25. 在 Villa-Fombuena 等人（2021）的研究中8，通过谱系体形态变化的研究确定，完整周期的持续时间估计为15.5 h。将该成像方法与染色质标记和/或Fly-FUCCI技术相结合26 结果显示，神经胶质瘤干细胞（GSC）通常每15.5小时分裂一次，细胞周期各时相的平均持续时间为：M期（圆形，22分钟）、G1期（圆形G1、栓状和杆状，3.45小时）、S期（融合状，43分钟）和G2期（融合状、感叹号状及圆形，10.5小时）。有关细胞周期各时相持续时间的原始数据见于Villa-Fombuena等人的研究。8这些观察结果与先前利用固定成像分析GSC细胞周期和 fusome 形态的研究一致25,27,28.&#160;此外，这 体内 该方法有助于解析异常的GSC分裂和/或链状体动态对下游卵细胞选择所造成的影响，因为融合体在这些过程中发挥着关键作用。此外，本方案还可用于分析已知或新发现的突变体中GSC的分裂速率。
长时间连续成像涉及一系列需要考虑的关键问题，主要是组织完整性和功能的维持，以及样本荧光信号的保存。维持干细胞微环境细胞的适宜环境条件至关重要，以避免功能异常、应激反应、细胞周期阻滞或细胞死亡。在本研究的条件下，即使成像时间超过12小时，生殖干细胞（GSCs）仍能够进入有丝分裂，这是反映组织健康状态的关键指标。因此，我们推断培养的生殖囊泡在大部分成像过程中均保持了其结构完整性和生物学功能。同样，由于GFP:Par-1蛋白在整个细胞周期中持续新生成（见Villa-Fombuena等，2021）8，加之我们将图像采集频率降低至每10分钟一次，因此即使在影片接近结束时的时间点，仍保留足够的荧光信号用于后续分析。无论如何，样本的光漂白问题可通过诸如“bleach correction”等插件进行潜在校正13。
模拟一个合适的环境 离体，昆虫组织在成像期间可在添加特定补充物的 Schneider 培养基中维持数小时。重要的是，本方案除胎牛血清（FBS）外，不使用任何生长因子或果蝇提取物。先前研究表明，许多原始生殖细胞（GSCs）通常停滞于 G2 期，并通过高水平胰岛素诱导进入 M 期25因此，我们不在培养条件中添加胰岛素，以避免对GSC细胞周期产生异常刺激。在解剖液中添加FBS也可减少卵室在卵巢管转移过程中黏附于移液枪头或玻璃培养皿的几率。21最后，使用抗生素适用于长时间成像，以避免细菌和/或真菌增殖。培养皿中微生物的过度生长可能改变组织的稳态，从而影响细胞分裂。本方案中，培养基含有抗生素混合物（通常添加浓度为1%（100 U/mL 青霉素和100 µg/mL 链霉素））。同样，长时间孵育可能影响抗生素的效力，因此可考虑更换培养基以防止抗生素降解。
Drosophila 卵巢尖端被一层管状的肌鞘包裹，必须去除该肌鞘以消除此类组织典型的蠕动、旋转和收缩运动29,30。因此，去除肌鞘有助于更清晰地观察报告基因信号，允许使用共聚焦显微镜的设置参数以最小化荧光漂白和光损伤，并实现高时间分辨率成像。然而，肌鞘对组织稳态的具体作用目前尚不清楚，因此其去除可能在某种程度上影响生殖干细胞（GSC）微环境的正常功能。该实验体系的另一个缺点是，在成像过程中卵巢尖端可能从粘附表面脱落，并在周围培养基中漂移，导致图像在不同时间点之间发生位移，甚至在单次z轴扫描过程中出现偏移。若发生此类情况，可使用ImageJ中的不同插件（如图像配准方法）来校正样品的移动12。
总之，我们设计了一种获取活体卵原囊长时间成像视频的方法。尽管该方法已实现对生殖干细胞（GSC）细胞周期的详细界定，并揭示了谱系体动态变化与GSC细胞周期各阶段之间的关联，但我们意识到本实验方案存在一些固有局限性。首先，成像过程是在一种人工培养环境中进行的，其环境条件并不能完全模拟体内真实情况。 体内 条件。然而，我们在不同细胞周期阶段观察到的纺锤体形态结果与先前其他研究者利用固定组织所报道的结果相似31我们相信该方案在很大程度上重现了 体内 条件。其次，尽管组织完整性和功能在长达16小时的培养后似乎未受影响，但我们尚未对此进行仔细评估。理想情况下，可将拍摄后的尖端体移植回雌性腹部，观察其是否能够像对照尖端体一样产生新的卵室。32本研究中使用的活体成像方法是分析生殖干细胞不对称分裂的有力工具，尤其适用于 果蝇 卵巢生物学研究。此外，该方法特别适用于对化学化合物、生长因子或营养物质进行药理学研究，因为这些物质可直接添加至培养基中。同时，我们可将实验组和对照组样本置于同一块培养板中，从而最大限度地减少实验内的技术性差异。

活体成像技术在获取直接实验证据方面具有重要作用。结合先进的共聚焦显微镜技术与方法学的优化，能够以高精度探究多种生物学事件。优化实验方案中的各个环节，如组织操作与解剖、样品制备与保存以及显微镜采集参数设置，对于最大限度提高实验结果的可靠性与稳健性至关重要。本文介绍一种用于长时间成像监测样品的实验方案，特别侧重于 黑腹果蝇 卵巢。该 黑腹果蝇 卵巢是研究多种发育过程的优良模型系统。作为果蝇的生殖器官之一，该器官 黑腹果蝇 包含一个定义明确的成体干细胞微环境。该GSC微环境在成年期维持雌性配子的发育。 果蝇 卵巢由大约18个卵管组成，其中卵室在生殖腺瘤中发育。在每个生殖腺瘤的顶端，2-4个生殖干细胞（GSCs）由一个体细胞微环境维持，该微环境主要由8-10个细胞组成的末端丝、5-8个帽细胞组成的环状结构以及2-3个前部护送细胞构成。图1A该体细胞微环境为生殖干细胞（GSCs）提供维持其干性、调控增殖及防止分化的关键信号和物理支持。1,2,3,4,5.
生殖干细胞（GSCs）通常进行不对称分裂，产生一个新的干细胞，该干细胞保持与体细胞微环境的接触，以及一个子细胞——囊胚细胞（cystoblast, CB），后者失去与体性帽细胞的直接接触并发生分化。GSCs和CB均含有一种高度动态的胞质细胞器，称为链状体（spectrosome），其主要功能是在有丝分裂过程中正确引导有丝分裂纺锤体的方向6。CB经历4次不完全的胞质分裂，形成一个由16个细胞组成的囊，其中有一个生殖系细胞特化为卵细胞，其余15个细胞则成为滋养细胞。CB中的链状体发育为一种分支状结构，称为融合体（fusome），将这16个相互连接的生殖系细胞连为一体。链状体富含小囊泡以及细胞骨架蛋白，例如丝氨酸-苏氨酸激酶Par-1和膜组分Hu-li tai shao（Hts）7。在GSC细胞周期中，链状体通过新增物质而生长，并发生形态变化，从而可用于识别G1期、S期、G2期和M期（图1B）8,9。
我们最近建立了一种果蝇（Drosophila）生殖囊ex vivo培养方法，可实现对生殖干细胞（GSC）长达16小时的活体成像。由于这些细胞平均每个15.5小时分裂一次8，该方法使得能够记录GSC细胞周期的大部分过程。因此，结合其他工具，我们的培养方法揭示了GSC细胞周期中纺锤体体（spectrosome）的形态变化，并实现了对体内不同细胞周期时相持续时间的分析in vivo8（图1C）。本文中，我们提供了该延长活体成像方法的详细实验方案，并配有逐步演示的视频，以说明具体操作流程（图2）。

<table><tbody><tr><td>9孔玻璃板</td><td>康宁&amp;nbsp;</td><td>7220-85</td><td>n/a</td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3881</td><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;sub&gt;&amp;middot;&lt;/sub&gt;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O；制备任氏液</td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>康宁&amp;nbsp;</td><td>354240</td><td>用于将细胞或组织切片粘附到多种表面，包括塑料、玻璃、金属、FEP聚合物及生物材料。</td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子&amp;nbsp;</td><td>精细科学</td><td>11252-20</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Dumont #55 镊子&amp;nbsp;</td><td>精细科学</td><td>11255-20</td><td>尺寸 0.05 mm × 0.02 mm，长度 11 cm</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td>合格，热灭活，欧盟批准，南美来源&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>玻璃底培养皿</td><td>MatTek</td><td>P35GC-1.5-10-C</td><td>35 mm 培养皿，1.5 号盖玻片，10 mm 玻璃直径&amp;nbsp;聚-D-赖氨酸包被</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td>制备林格氏液</td></tr><tr><td>氯化镁&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028</td><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;；制备任氏液</td></tr><tr><td>持针器</td><td>Roboz&amp;nbsp;</td><td>RS-6061</td><td>轻质中空不锈钢手柄；4 3/4&quot; 长。</td></tr><tr><td>尼康 SMZ18 双目显微镜&amp;nbsp;</td><td>尼康</td><td></td><td>https://www.microscope.&lt;br/&gt; healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15140122</td><td>10,000 U/mL</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td>KCl；用于配制任氏液</td></tr><tr><td>Schneider's Drosophila 培养基</td><td>Biowest&amp;nbsp;</td><td>L0207</td><td>昆虫细胞培养基</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8875&amp;nbsp;</td><td>NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;; &amp;ge;99.5%，粉末</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888</td><td>氯化钠；用于配制任氏液</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9378</td><td>&amp;ge;99.5%（气相色谱）；用于配制林格氏液</td></tr><tr><td>钨解剖针</td><td>Roboz&amp;nbsp;</td><td>RS-6064</td><td>0.25 mm，超细，1 微米尖端（每包 10 个）</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td>分子生物学用黏性液体</td></tr><tr><td>酵母粉</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51475</td><td>n/a</td></tr></tbody></table>

延长活体成像果蝇雌性drosophila melanogaster生殖系干细胞微环境

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

活体成像技术能够对细胞动态过程进行详细且实时的分析。Drosophila 卵巢是研究多种发育过程动态变化的优良模型，这些过程包括细胞分裂、干性维持、分化、迁移、凋亡、自噬、细胞黏附等。近期，我们建立了一种延长的ex vivo培养与雌性Drosophila GSC微环境活体成像方法。以携带GFP::Par-1转基因的Drosophila品系为例，该方法可实现GSC在其微环境中不对称分裂的可视化，并可描述细胞周期中谱系体（spectrosome）形态的动态变化。本文中，我们提供了一种详细的Drosophila 卵巢前体区（germaria）ex vivo培养方案，可实现对雌性GSC微环境的长期观察。重要的是，该方案广泛适用于利用多种已在果蝇品系库或Drosophila研究领域中可用的荧光标记目标蛋白进行GSC活体成像的研究。

通过这一扩展的活体成像方案，我们能够在无明显生物学干扰的情况下，记录女性生殖干细胞（GSCs）在其生态位内发生的不对称有丝分裂。为此，我们使用在整个生殖腺中普遍表达GFP::Par-1蛋白的样本，该蛋白可在GSC细胞周期中区分五种不同的纺锤极体形态：圆形、塞状、杆状、融合状和感叹号状。图1B,C）。更详细地观察发现，圆形-G2期成镜体具有强烈的GFP:Par1信号（图1C，图a）在G2-M-G1期显著减少。重要的是，利用该转基因品系还可可视化观察到精原干细胞（GSC）进入有丝分裂的过程，因为大多数GFP::Par-1在早前期会离开纺锤极体并充满细胞质图1C，图b）。此外，细胞质中的GFP::Par-1可实现对核膜通透（NEP）步骤的精确定位8,14，因为此时GFP信号进入核质（图1C，图b）。有丝分裂结束后，随着核膜重建，GFP:Par1信号在圆形G1期谱系体中逐渐恢复图1C，图c）。 从头合成 将GFP:Par1物质添加到圆形G1期谱系体中可促进栓塞结构的形成图1C，面板 d），标尺（Bar）图1C，面板 e）以及融合（图1C，图f）谱系体形态。最后，GFP:Par1标记可用于观察感叹号状谱系体（exclamation mark spectrosome）图1C，图e），这是由于在胞质分裂过程中，除了收缩性肌动球蛋白环外，还形成了富含微管的蛋白质结构——中间体。
<img alt="生殖系干细胞分化阶段；谱系体形态；细胞周期阶段示意图；显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67389/67389fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：活体 GSC 中谱系体周期动态。（A）生殖系干细胞（GSC，黄色）微环境的示意图，包含末端丝细胞（TFCs，蓝色）、过渡细胞（TC，红色）、帽细胞（CpCs，紫色）和护送细胞（ECs，灰色）。GSC 含有一种特征性细胞器，称为谱系体（绿色）。在 GSC 细胞周期中，谱系体形态经历从球形到拉长形，再回到球形的循环。GSC 分裂产生一个子细胞，即囊胚细胞（CB，橙色），该细胞脱离微环境，也含有球形谱系体。CB 连续同步分裂四次，每次胞质分裂不完全，形成由融合体连接的 2、4、8 和 16 细胞囊。(B) 表示细胞周期中不同谱系体形态的示意图。（B'）预期可观察到各类谱系体形态的时间。（C）一段持续 17 小时的录像中 GFP::Par-1 信号在 GSC 微环境中的时间点图像。时间 0 分钟（0'）对应核膜通透化（NEP）。图中展示了五种不同的谱系体形态（白色和绿色箭头）：圆形（G2 和 G1 期均有；图 a 和 c）、塞状（图 d）、杆状（图 e）、融合状（图 f）以及感叹号状（图 e，绿色箭头）。最后一种谱系体形态属于图中 70' 时刻所示的第二个 GSC（绿色虚线）。GSC 由黄色和绿色虚线圈出。GSC 分裂后产生的 CB 由橙色虚线圈出。比例尺：10 µm。图 A 和图 B 经 Villa-Fombuena 等人8许可改编。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67389/67389fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="果蝇卵巢管分离示意图；步骤：MatTek样本制备、解剖、成像；生物学方法" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67389/67389fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2用于延长活细胞成像的 Cell-Tak 黏附剂安装方法 果蝇 生发中心 (1) 使用粘合剂制备玻璃底培养皿的逐步操作流程。2) 概述 果蝇 在林格氏液中解剖卵巢并分离单个无肌卵巢管。3将去除肌鞘的卵巢小管转移至玻璃底培养皿中。4用添加补充物的Schneider培养基填充玻璃底培养皿。5使用倒置共聚焦显微镜对卵原巢进行10小时至16小时的成像。该图经 Villa-Fombuena 等人许可改编。8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67389/67389fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本文提供了一种详细的实验方案，用于对Drosophila卵巢微环境中生殖系干细胞（GSCs）的不对称分裂进行活体成像。我们使用了一种转基因品系，该品系普遍表达一种绿色荧光蛋白（GFP）与谱斑体蛋白Par-1的融合蛋白。

延长活体成像果蝇雌性Drosophila melanogaster生殖系干细胞微环境

活体成像技术能够对细胞动态过程进行详细且实时的分析。果蝇卵巢是研究……的理想模型。

我们致力于发现调控细胞干性的新细胞与分子机制。我们的主要目标是解析干细胞如何在微环境中避免分化。由于我们在实验条件下开展工作，因此必须保持组织完整性，以确保生殖干细胞（GSCs）表现出生理性的行为。本方案可维持健康且功能完整的GSC生态位，从而实现对分裂中的GSC进行监测，其状态与体内情况一致。通过延时活细胞成像技术，我们能够研究GSC的整个细胞周期及中心体样结构（spectrosome）的动态变化。具体而言，我们成功地描述了细胞周期各阶段中中心体样结构的形态变化，而这一任务在此前使用固定样本图像或较短时间成像的方法中难以实现。掌握如何在不干扰其动态变化的情况下进行主要实验，使我们能够探索微环境细胞之间的通讯机制。我们希望研究由mRNA与代谢酶直接相互作用介导的基因表达调控机制以及干细胞生物学中的细胞代谢调控。首先，配制链霉素-青霉素抗生素混合液，浓度为每毫升10,000单位，分装为每份100微升。准备好该实验所需的所有其他试剂，并妥善保存。收集表达泛素启动子驱动的、持续表达的 Par one-GFP 融合蛋白的一至二日龄果蝇，转移至新离心管中。将果蝇在 25 °C 培养箱中培养两天，随后进行解剖。在35毫米多聚-D-赖氨酸包被的培养皿盖玻片中央，加入3 µL特定的Cell-Tak黏附剂液滴。立即向该3 µL黏附剂液滴中加入等体积的0.1 M碳酸氢钠溶液（pH为8）。用移液器混匀溶液。为实现完全蒸发，将带盖的培养板在室温下孵育20分钟，然后于4摄氏度保存过夜。次日将培养板解冻后，用6微升经高压灭菌的纯水小心洗涤三次，注意不要接触和扰动黏附层。在室温下放置5到10分钟，使水完全蒸发。首先，培养果蝇并准备包被的玻璃底培养皿。然后用70%乙醇清洗三孔解剖皿、镊子和解剖针。在解剖皿的三个孔中各加入约 200 微升林格溶液。用镊子夹住果蝇雌性的胸部与腹部交界处。轻轻撕开腹部后端的角质层并向后拉开，以暴露卵巢。解剖卵巢后，将其转移至下一个孔中，以减少组织残余物或解剖碎片的污染。在配备LED照明的体视显微镜下，使用一对精细镊子固定整个卵巢，用另一对镊子夹住一个晚期卵室。轻轻拉伸，直至肌鞘断裂并滞后分离。用镊子将15至20个去肌鞘的卵巢逐个转移至第三个孔中，孔内含有200 µL林格氏液。用0.1% Tween 20预润湿200 µL枪头，以防止卵巢粘附在枪头壁上。使用预润湿的枪头，将含有去肌鞘卵巢的6 µL林格氏液转移至室温下准备好的黏附板中。使用解剖针或镊子，小心地将卵巢组织压至林格氏液滴的底部，以确保其与粘附表面充分接触。接着，向MatTek培养皿中加入3毫升Schneider培养基，该培养基需添加15%胎牛血清（FBS）和0.6%链霉素-青霉素抗生素混合液。将含有去肌鞘卵巢组织的培养皿在水平面上运送至显微镜观察台。将培养板置于转盘共聚焦显微镜或激光共聚焦显微镜的 63 倍物镜下。对样品进行调焦，并为每个锗选择中间的 Z 平面。设置实验参数时，将采集模式设为 3D 时间序列。将激光功率调整至最大值的70%。激发波长设置为488纳米。Z轴扫描范围设为30微米，Z轴扫描间距设为1.2微米。将时间点间隔设置为每10分钟，持续时间为17小时。如有条件，使用多位置选项重新定义样本的XY坐标。选择每个卵原茎体中部的Z平面，使Z轴层扫以此位置为中心，并开始采集图像。使用 Imaris 或 Image J 软件对图像进行时间和 Z 轴方向的分析，以观察谱系体形态的变化。为生成视频，需在每个时间点手动选择最佳的 Z 平面。在 G2 MG1 期，圆形 G2 谱系区强烈的 GFP par one 信号显著减弱。在早前期，GFP-Par-1 离开纺锤体并充满细胞质，表明生殖系干细胞进入有丝分裂。经过有丝分裂及核膜重新形成后，GFP-Par-1 信号在圆形的 G1 期纺锤体中逐渐恢复。GFP-Par-1 重新定位于圆形 G1 期纺锤体，导致出现点状、杆状以及融合的纺锤体形态。

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科研

JoVE Journal

Developmental Biology

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