活/死染色法用于定量麦卢卡蜂蜜处理后伤口致病菌中的可存活但不可培养细胞

本研究项目旨在探讨麦卢卡蜂蜜对细菌生理学的影响。近期研究进一步揭示了麦卢卡蜂蜜对细菌生理的抗菌作用。我们的初步研究结果表明，经麦卢卡蜂蜜处理的细菌会进入耐药性、可存活但不可培养的休眠状态，但其进入该状态的程度低于经传统抗生素处理的细菌。

根据我们的实验，比较麦卢卡蜂蜜和常规抗生素诱导的活的非可培养状态（VBNC）细菌的表达谱将十分有意义。首先，取含有冷冻菌株的小瓶，依次打开，并用无菌接种棒刮取少量冷冻细菌，接种至相应标记的Luria-Bertani（LB）琼脂平板上。

更换小瓶盖后迅速放入冰箱。在37摄氏度下孵育细菌培养物18至24小时。次日，使用血清学移液管将两毫升LB肉汤转移至两支无菌试管中。

将接种环在本生灯火焰中灭菌。然后从LB琼脂平板上取四分之一环细菌，转移至含有LB肉汤并已做好相应标记的试管中。将试管置于约37摄氏度、250 RPM的振荡培养箱中，在有氧条件下培养18至24小时。

在设置麦卢卡蜂蜜和抗生素对细菌的处理时，取10微升细菌培养物加入10毫升穆勒-欣顿肉汤中，以获得1:1,000稀释度的细菌培养物，其浓度约为每毫升10的6次方个菌落形成单位。使用稀释后的培养物为每种细菌制备三个样品：一个未经处理的对照组、一个经麦卢卡蜂蜜处理的样品和一个经抗生素处理的样品。将麦卢卡蜂蜜和抗生素分别加入相应的试管中。

取0.1毫升和0.5毫升未处理样本，分别转移至无菌微量离心管中，用于T=0样本的活菌平板计数和活/死染色。随后，将未处理对照组、麦卢卡蜂蜜处理组和抗生素处理组样本置于37°C摇床培养箱中，在250 RPM条件下有氧培养24小时。用LB肉汤对T=0时间点的未处理样本进行十倍系列稀释，以获得可用于活菌平板计数的可计数细胞数量。

将每种稀释后的样品各取50微升，涂布于一个LB琼脂平板的一半区域。将琼脂平板置于37摄氏度、有氧条件下培养24小时。次日，从培养箱中取出LB琼脂平板。

选择含有约25至150个菌落的稀释平板，准确计数菌落数量。使用菌落形成单位公式计算每毫升中可培养细胞的数量。在第三天，向0.5毫升T等于零的未处理活/死染色对照样品中加入0.5毫升0.85%氯化钠。

每个样品中加入 1.5 µL SYTO 9 和 1.5 µL 碘化丙啶。然后向每个样品中加入 3 µL 混合液。将样品在 21 °C 避光孵育 15 分钟。

取六微升染色后轻轻混匀的样品，转移至一次性血细胞计数板中，使用荧光显微镜配合异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate）或 FITC 滤光片及 40X 物镜进行观察。拍摄一张同时显示血细胞计数板网格线和绿色细胞的图像。每份样品计数六个视野中的绿色细胞，并记录网格尺寸，用于计算单位体积内的绿色细胞数量。

最后，通过从使用活/死染色法测得的每毫升活细胞数中减去使用活菌平板计数法获得的每毫升可培养细胞数，计算出可存活但不可培养细胞的数量。在第四天，从培养箱中取出未经处理、麦卢卡蜂蜜处理和抗生素处理的细菌培养物后，分别取每种样品0.1毫升和0.5毫升至微量离心管中，用于活菌平板计数和活/死染色。该图显示了使用活菌平板计数法和活/死染色法测定的金黄色葡萄球菌（S.aureus）和铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）培养物中的可培养细胞数和活细胞数。

结果显示，在未处理组和麦卢卡蜂蜜处理组中检测到的可存活且可培养细胞数量无显著差异。经妥布霉素处理的金黄色葡萄球菌（S.aureus）培养物中，可培养细胞数量少于可存活细胞，但该差异不具统计学显著性。仅经美罗培南处理的铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）显示出可培养细胞数量相对于可存活细胞的统计学显著减少。