Name: 活/死染色，用于定量麦卢卡蜂蜜处理的伤口致病细菌中的活细胞但不可培养的细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-25T12:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: 了解活死染色法用于定量麦卢卡蜂蜜处理后伤口致病菌的活细胞但不可培养细胞状态。该方法比较蜂蜜与传统抗生素对细菌生理的影响，为抗菌研究提供替代策略。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由东华盛顿大学两项资助支持：A.R.C. 获得的教师科研与创造性成果资助，以及本科生科研资助 &amp;#38; 创意活动资助金授予 L.T.B。Bill 和 Connie Cross 捐款给 EWU，用于购买配备数字相机的 Leica DMIL 倒置荧光显微镜。

由于P. aeruginosa（ATCC9721）和S. aureus（ATCC29213）被归类为生物安全二级病原体，实验操作必须在受限进入的实验室内进行，并配备生物安全柜，以用于可能产生飞溅或气溶胶的操作，例如振荡和离心培养物。在本实验方案的所有步骤中，均需穿戴个人防护装备（PPE），包括实验服、防护眼镜和手套。实验中使用的所有试剂和设备均列于材料表中。
1. 无菌肉汤和琼脂培养基的制备
<ol>
	<li>准备LB（Luria Bertani）培养基、MH（Mueller Hinton）培养基、NaCl（0.85%）、抗生素及玻璃器皿。
	<ol>
		<li>根据制造商说明配制液体培养基，若配制固体培养基则加入1.5%的琼脂粉。将0.85 g NaCl溶于100 mL去离子水（dH2O）中，配制0.85% NaCl溶液。在容器上贴好高压灭菌指示胶带，放入耐高压灭菌的容器中，根据所用液体体积选择合适的液体程序进行高压灭菌。</li>
		<li>高压灭菌程序完成后，将琼脂培养基冷却至约60 °C，然后倒入无菌培养皿中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用去离子水（dH2O）配制100 μg/mL的抗生素妥布霉素（tobramycin）和美罗培南（meropenem）储备液，用于后续稀释及细菌处理。使用5 mL无菌注射器连接0.2 μm无菌滤器对抗生素储备液进行除菌过滤。
	<ol>
		<li>将除菌后的抗生素储备液分装成多个小份，于-20 °C保存，以避免因反复冻融导致活性下降。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 从 -80 °C 复苏保存的 Staphylococcus aureus 和 Pseudomonas aeruginosa 菌株（第1天）
<ol>
	<li>准备从-80 °C冻存管中划线接种少量冻存菌株至Luria Bertani（LB）琼脂平板所需的材料。包括多根无菌木签和一个已标记菌种名称及日期的LB琼脂平板。</li>
	<li>打开-80 °C超低温冰箱，迅速取出目标菌株冻存管并立即关闭冰箱门。依次打开每根冻存管，用无菌木签刮取少量冻存细菌，接种到相应标记的LB琼脂平板上。盖好管盖，并迅速将冻存管放回-80 °C超低温冰箱。</li>
	<li>将接种后的LB琼脂平板倒置（琼脂面朝上），在37 °C、有氧（大气）条件下培养18–24小时。培养结束后，用封口胶带密封接种好的LB琼脂平板，并置于4 °C保存，保存时间不超过一周。根据实验需要，每周从-80 °C冻存菌种中重新接种新鲜细菌培养物。</li>
</ol>
3. 金黄色葡萄球菌（S. aureus）和铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的处理前准备（第2天）
<ol>
	<li>准备每种菌株的LB液体培养基培养所需材料，包括小型无菌试管、5 mL刻度移液管、无菌LB液体培养基和接种环。同时准备用于刻度移液管的手动或电动移液器、本生灯和摇床培养箱。</li>
	<li>在本生灯火焰旁操作，使用刻度移液管将2 mL LB液体培养基转移至两支无菌试管中。将接种环在本生灯火焰上灭菌后，从LB琼脂平板上取四分之一环细菌，转移至相应标记的含LB液体培养基的试管中。
	<ol>
		<li>将试管置于37 °C摇床培养箱中，在有氧条件下振荡（约250 rpm）培养18–24小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 准备MH并设置MH及抗生素对S. aureus和P. aeruginosa的处理（T = 0）（第3天）
<ol>
	<li>准备实验所需材料，包括 Mueller Hinton 肉汤和琼脂平板、第 2 天的 LB 肉汤细菌培养物、无菌试管、置于冰上的抗生素储备液、移液器（P20、P200 和 P1000）及吸头、15 mL 离心管、刻度移液管及移液器、微量离心管。
	<ol>
		<li>在实验当天新鲜配制 25% 和 50% 的 MH 储备溶液。根据 MH 的密度（1.47 g/mL），在无菌 15 mL 管中称取适量 MH，并加入适量无菌 Mueller Hinton 肉汤。通过将管子置于温水中并根据需要颠倒混匀，使 MH 重新悬浮。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在无菌 15 mL 管中，将过夜培养的细菌培养物用 Mueller Hinton 肉汤稀释 1:1000（约 106 CFU/mL），即取 10 μL 细菌培养物加入 10 mL Mueller Hinton 肉汤中。
	<ol>
		<li>使用稀释后的培养物为每种细菌制备三个样本：未处理对照组、&#160;MH 处理组（最低抑菌浓度，MIC）和抗生素处理组（S. aureus 使用妥布霉素，P. aeruginosa 使用美罗培南，均为 MIC 浓度）。</li>
		<li>按照 表 1&#160; 和 表 2 中所示体积，向各样本中加入稀释后的细菌培养物、MH 和相应的抗生素。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分别取 0.1 mL 和 0.5 mL 的未处理样本转移至无菌微量离心管中，用于 T = 0 样本的活菌平板计数（步骤 5）和活/死染色（步骤 6）。
	<ol>
		<li>将未处理对照组、MH 处理组以及抗生素处理组（妥布霉素或美罗培南）在 37 °C、有氧条件下于摇床（250 rpm）中孵育 24 小时。对 T = 0 的未处理样本进行活菌平板计数（步骤 5）和活/死染色（步骤 6）操作。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 使用活菌平板计数法测定样品中的可培养细胞（第3-5天）
<ol>
	<li>第4天，在样品孵育24小时后，分别取0.1 mL和0.5 mL各样品至微量离心管中，用于活菌平板计数和活/死染色（步骤6），这些样品即为T = 24 h样品。</li>
	<li>在采集当天对 T = 0 和 T = 24 h 的样品进行活菌平板计数，将活菌平板计数样品在 LB 肉汤中进行10倍系列稀释，以获得可计数的细胞数量（约25–150个）。
	<ol>
		<li>涂布50 &#956;每种稀释样品各取 L 涂布于 &#189; LB 琼脂平板的。将 LB 琼脂平板在 37 ℃ 有氧条件下孵育 &#176;C 培养 24 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>次日，从培养箱中取出LB琼脂平板，选择菌落数约为25–150的稀释平板。准确计数平板上的菌落数量，并使用菌落形成单位（CFU）公式（CFU/mL = 计数的菌落数 /（涂布体积，mL）×（稀释倍数））计算每毫升中可培养的细胞数量。 
	注意：T = 0 样品将于第3天接种平板，第4天进行分析；T = 24 h 样品将于第4天接种平板，第5天进行分析。</li>
</ol>
6. 使用活/死染色法和荧光显微镜测定样品中的活细胞（第3或第4天）
<ol>
	<li>准备活/死染色所需的材料，包括0.85%无菌NaCl（用于维持细胞适宜的渗透压环境）、移液器（P20、P200和P1000）、无菌移液器吸头、细菌用活/死染色试剂盒以及一次性血细胞计数板。准备配备异硫氰酸荧光素（FITC）滤光片的荧光显微镜，用于检测染色活细胞的SYTO 9染料。</li>
	<li>向以下各活/死染色样品中加入0.5 mL的0.85% NaCl：所有未稀释的T = 0样品、未稀释的T = 24 h MH处理样品和抗生素处理样品，以及T = 24 h未处理对照样品的1:1000稀释液。
	<ol>
		<li>注意：所有样品的最终活细胞计数需乘以2，而稀释后的T = 24 h未处理对照样品需乘以1000。每份样品中加入1.5 μL SYTO 9和1.5 μL碘化丙啶，混匀后向每份样品中加入3 μL混合染液。将样品置于21 °C避光孵育15分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将每份染色后并轻轻混匀的样品取6 μL转移至一次性血细胞计数板，使用配备FITC滤光片和40倍物镜的荧光显微镜观察，并拍摄一张同时显示血细胞计数板网格线和绿色活细胞的照片。
	<ol>
		<li>对每份样品的六个视野中的绿色细胞进行计数，记录网格的尺寸，以便计算单位体积内的绿色细胞数量。 
		注：当前实验中每个视野的尺寸为1.05 mm × 0.6 mm × 0.1 mm，对应体积为0.063 mm3或6.3 × 10-5 mL。为获得每毫升的活细胞数，将计数得到的活细胞数除以6.3 × 10-5 mL，再乘以2（若为T = 24 h未处理对照样品，则乘以2000）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 确定活的但不可培养细胞（VBNCs）的数量
注意：使用活菌平板计数法获得的可培养细胞数量和活/死染色法获得的活细胞数量来确定VBNC细胞的数量。
<ol>
	<li>通过从每毫升活细胞数中减去可培养细胞数/mL来计算VBNCs/mL。</li>
	<li>使用Wilcoxon配对检验比较每种处理的VBNCs/mL或&#160;可培养细胞数/mL与活细胞数/mL。</li>
</ol>

<ol><li>Spoering, A., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms+and+planktonic+cells+of+Pseudomonas+aeruginosa+have+similar+resistance+to+killing+by+antimicrobials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Biofilms and planktonic cells of Pseudomonas aeruginosa have similar resistance to killing by antimicrobials.</a> J Bacteriol. 183 (23), 6746-6751 (2001).</li>
<li>Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+Pseudomonas+aeruginosa+strains+producing+high+levels+of+persister+cells+in+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Emergence of Pseudomonas aeruginosa strains producing high levels of persister cells in patients with cystic fibrosis.</a> J Bacteriol. 192 (23), 6191-6199 (2010).</li>
<li>Li, L., Mendis, N., Trigui, H., Oliver, J. D., Faucher, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+the+viable+but+non-culturable+state+in+human+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22F+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The importance of the viable but non-culturable state in human bacterial pathogens.</a> F Microbiol. 5, 00258(2014).</li>
<li>Reygaert, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+the+antimicrobial+resistance+mechanisms+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22AIMS+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An overview of the antimicrobial resistance mechanisms of bacteria.</a> AIMS Microbiol. 4 (3), 482-450 (2018).</li>
<li>Ayrapetyan, M., Williams, T. C., Baxter, R., Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viable+but+nonculturable+and+persister+cells+coexist+stochastically+and+are+induced+by+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Viable but nonculturable and persister cells coexist stochastically and are induced by human serum.</a> Infect Immun. 83 (11), 4194-4203 (2015).</li>
<li>Cabral, D. J., Wurster, J. I., Belenky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+persistence+as+a+metabolic+adaptation%3A+Stress%2C+metabolism%2C+the+host%2C+and+new+directions%5BTitle%5D)+AND+%22PHARH2%22%5BJournal%5D)">Antibiotic persistence as a metabolic adaptation: Stress, metabolism, the host, and new directions.</a> PHARH2. 11 (1), 11010014(2018).</li>
<li>Heidelberg, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+aerosolization+on+culturability+and+viability+of+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Effect of aerosolization on culturability and viability of gram-negative bacteria.</a> Appl Environ Microbiol. 63 (9), 3585-3588 (1997).</li>
<li>Cook, K. L., Bolster, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+Campylobacter+jejuni+and+Escherichia+coli+in+groundwater+during+prolonged+starvation+at+low+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Survival of Campylobacter jejuni and Escherichia coli in groundwater during prolonged starvation at low temperatures.</a> J Appl Microbiol. 103 (3), 573-583 (2007).</li>
<li>Xu, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+viability+of+nonculturable+Escherichia+coli+and+Vibrio+cholerae+in+the+estuarine+and+marine+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Microbl+Ecol%22%5BJournal%5D)">Survival and viability of nonculturable Escherichia coli and Vibrio cholerae in the estuarine and marine environment.</a> Microbl Ecol. 8 (4), 313-323 (1982).</li>
<li>Qi, Z., Huang, Z., Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+differences+of+biofilm+and+planktonic+Pseudomonas+aeruginosa+in+viable+but+nonculturable+state+induced+by+chlorine+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Total+Environ%22%5BJournal%5D)">Metabolism differences of biofilm and planktonic Pseudomonas aeruginosa in viable but nonculturable state induced by chlorine stress.</a> Sci Total Environ. 821, 153374(2022).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+on+the+Viable+but+Non-culturable+%28VBNC%29+state+formation+of+staphylococcus+aureus+and+its+control+in+food+system%5BTitle%5D)+AND+%22F+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Study on the Viable but Non-culturable (VBNC) state formation of staphylococcus aureus and its control in food system.</a> F Microbiol. 11, 599739(2020).</li>
<li>Oryan, A., Alemzadeh, E., Moshiri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+properties+and+therapeutic+activities+of+honey+in+wound+healing%3A+A+narrative+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Viability%22%5BJournal%5D)">Biological properties and therapeutic activities of honey in wound healing: A narrative review and meta-analysis.</a> J Tissue Viability. 25 (2), 98-118 (2016).</li>
<li>Lusby, P. E., Coombes, A. L., Wilkinson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bactericidal+Activity+of+different+honeys+against+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Med+Res%22%5BJournal%5D)">Bactericidal Activity of different honeys against pathogenic bacteria.</a> Arch Med Res. 36 (5), 464-467 (2005).</li>
<li>Mandal, M. D., Mandal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Honey%3A+Its+medicinal+property+and+antibacterial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Pac+J+Trop.+Biomed%22%5BJournal%5D)">Honey: Its medicinal property and antibacterial activity.</a> Asian Pac J Trop. Biomed. 1 (2), 154-160 (2011).</li>
<li>Carter, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+Manuka+Honey%3A+No+longer+so+alternative%5BTitle%5D)+AND+%22F+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic Manuka Honey: No longer so alternative.</a> F Microbiol. 7, 00569(2016).</li>
<li>Cooper, R. A., Molan, P. C., Harding, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sensitivity+to+honey+of+Gram-positive+cocci+of+clinical+significance+isolated+from+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The sensitivity to honey of Gram-positive cocci of clinical significance isolated from wounds.</a> J Appl Microbiol. 93 (5), 857-863 (2002).</li>
<li>George Narelle May, C., Keith, F. Antibacterial Honey: In-vitro activity against clinical isolates of MRSA, VRE, and other multiresistant Gram-negative organisms. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGeorge+Narelle+May%2C+C+%22HMP+Global+Learning+Network%22">HMP Global Learning Network</a>. , https://www.hmpgloballearningnetwork.com/site/wounds/article/7751 (2007).</li>
<li>Blair, S. E., Cokcetin, N. N., Harry, E. J., Carter, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unusual+antibacterial+activity+of+medical-grade+Leptospermum+honey%3A+Antibacterial+spectrum%2C+resistance+and+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Soc+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The unusual antibacterial activity of medical-grade Leptospermum honey: Antibacterial spectrum, resistance and transcriptome analysis.</a> Eur Soc Clin Microbiol. 28 (10), 1199-1208 (2009).</li>
<li>Cooper, R. A., Jenkins, L., Henriques, A. F. M., Duggan, R. S., Burton, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+bacterial+resistance+to+medical-grade+manuka+honey%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Soc+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Absence of bacterial resistance to medical-grade manuka honey.</a> Eur Soc Clin Microbiol. 29 (10), 1237-1241 (2010).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Honey+can+inhibit+and+eliminate+biofilms+produced+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Honey can inhibit and eliminate biofilms produced by Pseudomonas aeruginosa.</a> Sci Rep. 9 (1), 18160(2019).</li>
<li>Bischofberger, A. M., Pfrunder Cardozo, K. R., Baumgartner, M., Hall, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+honey+resistance+in+experimental+populations+of+bacteria+depends+on+the+type+of+honey+and+has+no+major+side+effects+for+antibiotic+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Evol+Appl%22%5BJournal%5D)">Evolution of honey resistance in experimental populations of bacteria depends on the type of honey and has no major side effects for antibiotic susceptibility.</a> Evol Appl. 14 (5), 1314-1327 (2021).</li>
<li>Cunningham, E., O'Byrne, C., Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+weak+acids+on+Listeria+monocytogenes+survival%3A+Evidence+for+a+viable+but+nonculturable+state+in+response+to+low+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Control%22%5BJournal%5D)">Effect of weak acids on Listeria monocytogenes survival: Evidence for a viable but nonculturable state in response to low pH.</a> Food Control. 20 (12), 1141-1144 (2009).</li>
<li>Kogure, K., Simidu, U., Taga, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tentative+direct+microscopic+method+for+counting+living+marine+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A tentative direct microscopic method for counting living marine bacteria.</a> Can J Microbiol. 25 (3), 415-420 (1979).</li>
<li>Albertini, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+multiparameter+analysis+for+Vibrio+alginolyticus+viable+but+nonculturable+state+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Cytom+J+Int+Soc+Anal+Cytol%22%5BJournal%5D)">Use of multiparameter analysis for Vibrio alginolyticus viable but nonculturable state determination.</a> Cytom J Int Soc Anal Cytol. 69 (4), 260-265 (2006).</li>
<li>Nocker, A., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+approaches+toward+preferential+detection+of+viable+cells+using+nucleic+acid+amplification+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Novel approaches toward preferential detection of viable cells using nucleic acid amplification techniques.</a> FEMS Microbiol Lett. 291 (2), 137-142 (2009).</li>
<li>Trevors, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viable+but+non-culturable+%28VBNC%29+bacteria%3A+Gene+expression+in+planktonic+and+biofilm+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Viable but non-culturable (VBNC) bacteria: Gene expression in planktonic and biofilm cells.</a> J Microbiol Methods. 86 (2), 266-273 (2011).</li>
<li>Ankley, L. M., Monteiro, M. P., Camp, K. M., O'Quinn, R., Castillo, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manuka+honey+chelates+iron+and+impacts+iron+regulation+in+key+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+App+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Manuka honey chelates iron and impacts iron regulation in key bacterial pathogens.</a> J App Microbiol. 128 (4), 1015-1024 (2020).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案可用于检测经最低抑菌浓度（MIC）的MH及常规抗生素处理后，伤口致病菌中处于活但不可培养（VBNC）状态的细胞群体。方案中的关键步骤包括：在实验当天配制MH稀释液，防止活/死染色过程中样品损失，以及正确计算分析体积。在本研究及其他相关研究中，S. aureus 和 P. aeruginosa 的MH MIC值系通过实验测定27。为开展1%-20% MH浓度范围的测试，实验中使用培养基配制了25%或50%的MH储备液。有趣的是，随着稀释样品存放时间延长，其抑菌效果略有增强，导致MIC值降低（Carlson，未发表观察结果）。100%&#160;MH&#160;的存放时间似乎不影响其有效性，但此现象尚未经过系统验证。为避免MH活性出现差异，25%和50%的稀释液均在实验当日 freshly 配制。
在多次实验中，由于可存活细胞数量少于可培养细胞数量，计算出的VBNC细胞数为负值。由于所有可培养细胞均为可存活细胞，因此不可能出现可存活细胞数量少于可培养细胞数量的情况。推测在收集处理后样品进行活/死细...

处于可存活但不可培养（VBNC）休眠状态的细菌可耐受抗生素治疗，并导致反复发作且有时致命的感染性疾病1,2,3我们更为熟悉的是抗生素耐药性，其发生是由于 通过 可遗传的基因改变4该基因改变可通过多种机制赋予对特定抗生素的耐药性，包括限制抗生素的摄入、增加抗生素的外排、修饰抗生素的作用靶点或使抗生素失活。4相比之下，处于休眠状态的细菌通过降低其代谢水平，表现出更广泛且不具遗传性的抗生素耐受性2,3抗生素靶向特定的代谢过程，包括DNA复制和细胞壁合成，但对代谢失活的活的非可培养（VBNC）细胞无效4在大多数细菌群体中，VBNC细胞以极低的数量随机存在，与其基因完全相同的抗生素敏感型同胞共存。5然而，环境应激因素（包括抗生素暴露）可诱导敏感细菌细胞进入对抗生素耐受的活的非可培养（VBNC）状态3,6抗生素处理会杀死种群中对抗生素敏感的细胞，而休眠的活的非可培养（VBNC）细胞则会存活下来。顾名思义，VBNC细胞无法在适合其代谢活跃同类生长的培养基上培养。然而，这些细胞的膜结构和遗传物质并未受损，并且具有繁殖能力7,8当抗生素被移除后，需要特定的刺激因素（如营养物质、温度或宿主因子）来唤醒处于休眠状态的活的非可培养细胞（VBNC），并恢复其生长。3,9许多致病性细菌物种中均有休眠但可存活细胞（VBNC）的报道，包括 P. aeruginosa 和 S. aureus, 伤口感染的主要致病因子10,11.
蜂蜜因其抗菌特性长期以来被用于医疗领域，包括伤口治疗12。麦卢卡蜂蜜（MH）源自麦卢卡灌木（Leptospermum scoparium）的花蜜，以其广谱杀菌活性而著称（综述见13,14,15）。它能够有效杀灭大多数经测试的人类致病菌，包括对传统抗生素具有可遗传耐药性的细菌菌株，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin Resistant Staphylococcus aureus）和耐万古霉素肠球菌（Vancomycin-Resistant Enterococcus）16,17。此外，细菌对MH产生诱导性耐药的情况较为罕见，仅在暴露于蜂蜜的铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）生物膜以及在逐步增加浓度的特定蜂蜜成分中培养的大肠杆菌（Escherichia coli）中被检测到18,19,20,21。这表明MH的抗菌机制与传统抗生素不同，可能诱导更少甚至不产生活的非可培养（VBNC）细胞。本研究通过比较MH与传统抗生素对VBNC菌群的影响，验证了这一假设。
VBNC 细胞必须与其具有代谢活性的可培养细胞以及死亡细胞区分开来。可培养细胞的数量可通过活菌平板计数法进行测定，该方法将细胞转移至常规培养基中，并孵育足够长的时间，使其发生足够多次的细胞分裂，从而形成可观察到的菌落。目前已开发出多种方法，可根据细胞膜的完整性及低水平的转录活性来区分 VBNC 细胞与死亡细胞。通过底物和荧光染料摄取实验，结合显微镜或流式细胞术，可直接对细胞进行计数，并以颜色指示细胞膜是否完整22,23。呼吸活性检测法依赖于完整细胞膜中存在的电子传递链，也可用于区分活细胞与死细胞24。此外，还发展了结合 DNA 修饰染料的定量 PCR（qPCR）方法，该染料可阻止 DNA 扩增；只有来自活细胞的 DNA 才能被扩增，因为完整的细胞膜可阻止染料进入25。尽管 VBNC 细胞处于休眠状态，但仍维持低水平的基因转录，这一特性也可用于通过逆转录 PCR 与死亡细胞相区分26。
本研究建立了一种检测方法，用于定量分析经MH处理后两种致伤口感染的病原菌——S. aureus 和 P. aeruginosa 中的活的但不可培养（VBNC）细胞。该方法描述了使用MH和传统抗生素处理细菌，并通过活菌平板计数法和活/死染色法来检测可培养细胞和活细胞。这一简便且经济的实验方案将有助于分析MH是否能够诱导多种细菌病原体产生耐药性VBNC细胞。

<table><tbody><tr><td>穆勒-欣顿肉汤</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>B12322</td><td></td></tr><tr><td>劳里亚-伯塔尼（LB）肉汤&amp;nbsp;</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP142602</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco 琼脂</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0812-07-1</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>S3014-500g</td><td></td></tr><tr><td>美罗培南</td><td>TargetMol</td><td>T0224</td><td></td></tr><tr><td>妥布霉素</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2514</td><td></td></tr><tr><td>金黄色葡萄球菌&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>ATCC29213</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;铜绿假单胞菌</td><td>ATCC</td><td>ATCC9721</td><td></td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>Eppendorf</td><td>M13520000</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H2200-H&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Manukaguard 麦卢卡蜂蜜</td><td>Amazon</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>DMIL 倒置荧光显微镜&amp;nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td>11521265</td><td></td></tr><tr><td>数码相机</td><td>Leica Microsystems</td><td>12730522</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Genesee Scientific</td><td>28-103</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管</td><td>Diagnocine</td><td>DP-LB0100005, DP-LB010010</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Aid 移液器</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>本生灯</td><td>Fisher Scientific</td><td>S48108</td><td></td></tr><tr><td>Rainin 移液管</td><td>Pipette.com</td><td>L-20, L-200, L-1000</td><td></td></tr><tr><td>天平</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS603S</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Falcon</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>接种环</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-104-5</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2618-1</td><td></td></tr><tr><td>玻璃涂布棒</td><td>自制</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>细菌活/死染色试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>L7012</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Biologix Research Company</td><td>SKU 80-1500/P80-1500</td><td></td></tr><tr><td>锡箔纸</td><td>Costco</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>图表绘制软件</td><td>GraphPad</td><td>NA</td><td>使用 GraphPad Prism 绘制图表并进行统计分析。</td></tr></tbody></table>

活/死染色法用于定量麦卢卡蜂蜜处理后伤口致病菌中的可存活但不可培养细胞

Live/Dead Staining for Quantifying Viable but Not Culturable Cells in Manuka Honey-Treated Wound-Causing Bacteria

细菌对抗生素的耐药性和耐受性对全球健康构成重大威胁。导致抗生素耐药性和耐受性的机制分别包括基因突变、获得耐药基因，以及转变为可存活但不可培养（VBNC）状态和其他休眠状态。尽管VBNC细胞在基因上与其非耐药性同类完全相同，但它们通过保持代谢不活跃来逃避抗生素的作用。抗生素仅在其靶向过程（如DNA复制或转录）处于活跃状态时才有效。由于环境压力因素（尤其是抗生素）可促使细菌进入休眠状态，因此需要替代性的抗菌剂以最小化或防止这种反应。麦卢卡蜂蜜（Manuka Honey, MH）对多种细菌具有抗菌效果，且极少引发耐药性的产生。其多方面的抗菌机制使其成为治疗细菌感染的重要抗菌剂。本研究通过检验“MH诱导的VBNC细胞数量少于传统抗生素”这一假设，探讨MH在抑制抗生素耐药性发展方面的抗性能力。为验证该假设，建立了一种实验方案：使用MH或传统抗生素（妥布霉素或美罗培南）的最低抑菌浓度处理引起伤口感染的细菌Staphylococcus aureus和Pseudomonas aeruginosa，随后采用活菌平板计数法检测具有代谢活性的可培养细胞，并结合活/死染色法检测所有存活细胞。VBNC细胞数量等于存活细胞总数减去可培养细胞数。在部分实验中，可培养细胞数高于存活细胞数，导致VBNC细胞数为负值；因此未直接比较VBNC细胞数量。取而代之的是，对每种处理条件下的可培养细胞数与存活细胞数进行比较。只有经妥布霉素处理的P. aeruginosa显示出可培养细胞数显著少于存活细胞数，表明其VBNC细胞数量较高。该方案快速简便，可用于评估MH在其他致病菌中诱导VBNC细胞形成的能力。

当受到抗生素处理等应激因素影响时，细菌可进入“可存活但不可培养”（VBNC）状态，由于其对抗生素具有耐受性，可能导致感染反复发生。由于MH是一种广谱抗菌剂，且极少检测到对其产生耐药性的情况，因此推测MH诱导产生的VBNC细菌数量少于传统抗生素。本文所述方法用于定量两种引起伤口感染的细菌——S. aureus 和 P. aeruginosa——所形成的VBNC细胞数量。VBNC细胞数量等于通过活/死染色法测定的活细胞数减去通过活菌平板计数法测定的可培养细胞数。表3展示了在指定时间点和处理条件下分别检测到的 S. aureus 和P. aeruginosa的VBNC细胞平均数量。此类实验面临的一个挑战是，当测定的活细胞数量低于可培养细胞数量时，会导致VBNC细胞数量为负值。根据定义，所有可培养细胞均为活细胞，因其具备增殖并形成菌落的能力。为此，我们通过统计分析判断每种处理条件下可培养细胞数与活细胞数之间是否存在显著差异，以解决该问题。对于经抗生素处理的S. aureus和P. aeruginosa，其...

本方案描述了一种定量测定麦卢卡蜂蜜处理的细菌培养物中存活但不可培养细胞（VBNC）的方法。

细菌对抗生素的耐药性和耐受性对全球健康构成重大威胁。导致抗生素耐药性和……

本研究项目旨在探讨麦卢卡蜂蜜对细菌生理学的影响。近期研究进一步揭示了麦卢卡蜂蜜对细菌生理的抗菌作用。我们的初步研究结果表明，经麦卢卡蜂蜜处理的细菌会进入耐药性、可存活但不可培养的休眠状态，但其进入该状态的程度低于经传统抗生素处理的细菌。根据我们的实验，比较麦卢卡蜂蜜和常规抗生素诱导的活的非可培养状态（VBNC）细菌的表达谱将十分有意义。首先，取含有冷冻菌株的小瓶，依次打开，并用无菌接种棒刮取少量冷冻细菌，接种至相应标记的Luria-Bertani（LB）琼脂平板上。更换小瓶盖后迅速放入冰箱。在37摄氏度下孵育细菌培养物18至24小时。次日，使用血清学移液管将两毫升LB肉汤转移至两支无菌试管中。将接种环在本生灯火焰中灭菌。然后从LB琼脂平板上取四分之一环细菌，转移至含有LB肉汤并已做好相应标记的试管中。将试管置于约37摄氏度、250 RPM的振荡培养箱中，在有氧条件下培养18至24小时。在设置麦卢卡蜂蜜和抗生素对细菌的处理时，取10微升细菌培养物加入10毫升穆勒-欣顿肉汤中，以获得1:1,000稀释度的细菌培养物，其浓度约为每毫升10的6次方个菌落形成单位。使用稀释后的培养物为每种细菌制备三个样品：一个未经处理的对照组、一个经麦卢卡蜂蜜处理的样品和一个经抗生素处理的样品。将麦卢卡蜂蜜和抗生素分别加入相应的试管中。取0.1毫升和0.5毫升未处理样本，分别转移至无菌微量离心管中，用于T=0样本的活菌平板计数和活/死染色。随后，将未处理对照组、麦卢卡蜂蜜处理组和抗生素处理组样本置于37°C摇床培养箱中，在250 RPM条件下有氧培养24小时。用LB肉汤对T=0时间点的未处理样本进行十倍系列稀释，以获得可用于活菌平板计数的可计数细胞数量。将每种稀释后的样品各取50微升，涂布于一个LB琼脂平板的一半区域。将琼脂平板置于37摄氏度、有氧条件下培养24小时。次日，从培养箱中取出LB琼脂平板。选择含有约25至150个菌落的稀释平板，准确计数菌落数量。使用菌落形成单位公式计算每毫升中可培养细胞的数量。在第三天，向0.5毫升T等于零的未处理活/死染色对照样品中加入0.5毫升0.85%氯化钠。每个样品中加入 1.5 µL SYTO 9 和 1.5 µL 碘化丙啶。然后向每个样品中加入 3 µL 混合液。将样品在 21 °C 避光孵育 15 分钟。取六微升染色后轻轻混匀的样品，转移至一次性血细胞计数板中，使用荧光显微镜配合异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate）或 FITC 滤光片及 40X 物镜进行观察。拍摄一张同时显示血细胞计数板网格线和绿色细胞的图像。每份样品计数六个视野中的绿色细胞，并记录网格尺寸，用于计算单位体积内的绿色细胞数量。最后，通过从使用活/死染色法测得的每毫升活细胞数中减去使用活菌平板计数法获得的每毫升可培养细胞数，计算出可存活但不可培养细胞的数量。在第四天，从培养箱中取出未经处理、麦卢卡蜂蜜处理和抗生素处理的细菌培养物后，分别取每种样品0.1毫升和0.5毫升至微量离心管中，用于活菌平板计数和活/死染色。该图显示了使用活菌平板计数法和活/死染色法测定的金黄色葡萄球菌（S.aureus）和铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）培养物中的可培养细胞数和活细胞数。结果显示，在未处理组和麦卢卡蜂蜜处理组中检测到的可存活且可培养细胞数量无显著差异。经妥布霉素处理的金黄色葡萄球菌（S.aureus）培养物中，可培养细胞数量少于可存活细胞，但该差异不具统计学显著性。仅经美罗培南处理的铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）显示出可培养细胞数量相对于可存活细胞的统计学显著减少。

livedead-staining-for-quantifying-viable-but-not-culturable-cells

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

活/死染色，用于定量麦卢卡蜂蜜处理的伤口致病细菌中的活细胞但不可培养的细胞

本视频介绍了一种从冈比亚按蚊细胞系中纯化沃尔巴克氏体（Wolbachia...

在无细胞培养基中维持沃尔巴克氏体

来源：Anderson, Q. L., 等。一种高通量、高内涵、基于液体的C. elegans病理系统。J. Vis. Exp. (2018)该视频展示了一种基于液体的检测方法，其中将基因改造的C.

评估致病菌诱导的 C. elegans 幼虫死亡率

来源：Calatayud Arroyo, M., et al. 在体外肠道宿主-微生物界面评估合成细菌群落的存活能力。J. Vis. Exp.

基于荧光的口腔厌氧菌活力评估

视频展示了 体外 使用人中性粒细胞共培养的调理吞噬杀伤试验...

针对细菌病原体的调理吞噬杀伤活性评估

本视频展示了一种用于研究细胞外基质（ECM）硬度对黏附细胞细菌感染影响的实验方法。将不同硬度的聚丙烯酰胺水凝胶覆盖胶原蛋白后，分层置于多孔板中，以模拟生理条件下ECM的硬度。将人内皮细胞接种于水凝胶表面，并用经基因工程改造、可在细胞内表达荧光蛋白的单核细胞增生性李斯特菌（Listeria...

一种研究细胞外基质刚度对细菌感染影响的检测方法

细菌致病性研究的核心在于确定微生物在接触真核细胞后是否能够存活以及其存活机制。本文概述了使用荧光染料检测单个细菌在宿主细胞内及与宿主细胞相关时活力状态的实验方案。...

用于测定与哺乳动物细胞相关的细菌活力的荧光显微镜方法

生物膜感染对化学治疗表现出高度耐受性。单一检测方法无法全面反映生物膜的复杂性，因此需要采用多种互补的检测手段。我们介绍一种针对金黄色葡萄球菌（S.

适用于天然化合物库筛选的抗生物膜检测平台

采用简单的ATP检测法和活/死染色法，对经头孢曲松处理后的Neisseria...

抗生素敏感性的定量检测 淋病奈瑟菌 使用ATP利用型商用检测试剂盒和活/死细胞染色检测聚集体

本文介绍了一种在细胞水平上分析动物组织中细菌基因表达的方法。该方法为研究细菌群体在感染过程中响应组织环境而产生的表型多样性提供了资源。...

一种基于荧光的方法用于研究感染组织中的细菌基因调控

该方案描述了一种逐步建立的详细方法 离体 感染的绵羊皮肤伤口模型 金黄色葡萄球菌该高通量模型能更真实地模拟感染过程 体内...

一种新型高通量 离体 用于测试新型抗生素的绵羊皮肤伤口模型

本文介绍了一种定量检测酵母样品在胁迫后存活率的实验方案。该检测方法采用两种荧光染料SYTO...

一种优化的LIVE/DEAD染色联合流式细胞术用于定量酵母细胞应激后的存活率

了解活死染色法用于定量麦卢卡蜂蜜处理后伤口致病菌的活细胞但不可培养细胞状态。该方法比较蜂蜜与传统抗生素对细菌生理的影响，为抗菌研究提供替代策略。

活/死染色法用于定量麦卢卡蜂蜜处理后伤口致病菌中的可存活但不可培养细胞

探索更多视频