Name: 动脉粥样硬化中主动脉组织的三维成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: 学习使用组织透明化与多光子显微技术对小鼠主动脉进行三维成像，研究动脉粥样硬化进展中外周神经系统与斑块的相互作用，揭示细胞结构变化，为心血管疾病研究提供新方法。

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本工作由德国研究基金会（DFG）SFB1123/Z1项目、德国心血管研究中心（DZHK）DZHK 81X2600282项目以及Corona基金会授予SKM的资助项目（S199/10087/2022）提供经费支持；同时获得ERA-CVD（PLAQUEFIGHT）01KL1808项目以及德国政府对Easemedcontrol R &amp;#38;D GmbH and Co. KG公司AJRH的资助项目支持。

本研究遵循当地和国家动物使用与护理委员会的指南进行。实验中使用了C57BL/6J背景的高脂血症雄性Apoe-/-小鼠，这些小鼠在标准啮齿类动物饲料喂养下，随着年龄增长会自发形成动脉粥样硬化。
1. 主动脉组织整体成像与TDE透明化处理
<ol>
	<li>组织制备
	<ol>
		<li>准备麻醉剂，剂量为每公斤体重150 mg的氯胺酮（Ketamine）和每公斤体重30 mg的赛拉嗪（Xylazine）（参见 材料表每只小鼠进行腹腔注射以深度麻醉，并通过深部疼痛测试无反应来确认麻醉程度。 
		注意：注射剂的浓度和体积如下：氯胺酮 100 mg/mL；赛拉嗪 20 mg/mL；注射体积为氯胺酮与赛拉嗪按体积比 50:50 混合，剂量为 3 µL/g。</li>
		<li>将小鼠置于覆盖有手术纸巾的泡沫板上，用胶带将其四肢固定于仰卧位。用75%乙醇消毒胸部（参见 材料表）并使用1 mL一次性注射器通过左心室采血，以清除血液，从而获得更佳的灌注效果。 
		注意：也可通过开胸术采集心脏血液。</li>
		<li>在胸部正中做切口以暴露心脏，并在右心房做一小切口，以便进行经心脏灌注。通过左心室向小鼠灌注 10 mL 5 mM 乙二胺四乙酸（EDTA；参见 材料表) 磷酸盐缓冲液（PBS）中孵育 5 分钟，随后用 20 mL PBS 冲洗 5–10 分钟，直至血液完全排出。最后，用 10 mL 4%&#160;多聚甲醛&#160;（PFA）固定 20 分钟。 
		注意：所有操作均可在室温下使用蠕动灌注泵进行，压力为100–125 mm Hg。灌注针通过与采血相同的孔插入小鼠心脏。</li>
		<li>使用手术器械去除内脏器官，包括脾脏、肝脏、肺脏以及胃肠道和生殖器官，保留心脏、主动脉和肾脏完整。 原位. 
		注意：用于解剖和摘除器官的手术器械包括解剖剪、精细虹膜剪、弹簧剪、钝头镊、弯头镊和弯头精细镊。</li>
		<li>在解剖体视显微镜（30-40倍放大）下暴露从升主动脉至髂总动脉分叉的整个主动脉。仔细去除胸腺及脂肪组织，避免损伤主动脉。 
		注意：务必小心，避免剪断主动脉。对于 Apoe-/- 小鼠，保留主动脉周围最少的血管周围脂肪组织以维持连接结构。</li>
		<li>将整个主动脉收获至盛有 PBS 的培养皿中。使用虹膜剪或弹簧剪沿指示的顺序和方向将主动脉纵向剖开，分离为主动脉的不同节段，以暴露内膜表面。 图1A 用于TDE透明化处理。</li>
		<li>固定 正面 将主动脉以Y形放置在平坦的黑色蜡板上，如图所示 图1A用4%多聚甲醛后固定&#160;4 °C 过夜 
		注意：在固定前将主动脉固定在石蜡板上，以避免后续步骤中发生折叠和卷曲。</li>
		<li>松开主动脉并将其转移至 PBS 中，用 PBS 充分清洗主动脉，每次 5 分钟，共清洗 5 次。 
		注意：每次清洗时，将主动脉转移至装有 PBS 的不同试管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>抗体染色 平面视图 主动脉 
	注意：所有孵育步骤均在 2 mL 带锁管中于室温下轻柔旋转或振荡进行。
	<ol>
		<li>将固定的主动脉转移至封闭液中，封闭和透化处理 2 小时。 
		注意：封闭液的配方根据一抗和二抗的不同而有所差异。例如，封闭液：CD16/32（1:100稀释，终浓度为0.5 mg/mL），10%正常驴血清，2% Triton X-100，溶于PBS中（参见 材料表)</li>
		<li>将主动脉与上述封闭液中的初级抗体（步骤1.2.1）共同孵育，例如CD3e（1:100稀释）、NF200（1:200稀释）和B220（1:200稀释），孵育时间为24小时（参见 材料表用 PBS 清洗主动脉，每次 5 分钟，共清洗 5 次。</li>
		<li>在10%正常驴血清（1:300稀释）和4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI；1 mg/mL）中加入二抗，于主动脉中4℃孵育过夜（见 材料表用 PBS 清洗主动脉，每次 5 分钟，共清洗 5 次，然后将主动脉置于 PBS 中，4 °C 保存，直至进行组织透明化处理。 
		注意：每次清洗时，将主动脉转移至装有 PBS 的不同试管中。在步骤 1.2.3 中，用铝箔覆盖试管以避光。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>TDE 组织透明化 
	注意：所有孵育步骤均在2 mL安全锁扣管中进行，于室温下轻轻旋转，并用铝箔包裹避光。TDE（见 材料表工作液具有高渗透性，应在通风橱中小心操作。废液应根据当地法规收集并妥善处理。
	<ol>
		<li>将染色的主动脉转移至20% TDE工作液中，孵育1小时。</li>
		<li>将主动脉转移至47% TDE工作液中，孵育12小时。再将主动脉转移至60% TDE工作液中，孵育24–36小时，直至样品在可见光下变得透明，以匹配折射率。</li>
		<li>将主动脉置于60% TDE中，在室温避光条件下保存直至成像。 
		注意：短期孵育（例如步骤 1.3.1）需每 30 分钟更换一次工作液，长期孵育（例如步骤 1.3.2）需每 4 小时更换一次工作液。各步骤的孵育时间可根据组织大小进行调整，以获得更好的抗体渗透或透明化效果。对于 Apoe-/- 当小鼠主动脉周围包绕脂肪组织时，应适当延长孵育时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像观察TDE清除主动脉
	<ol>
		<li>使用市售的双面粘性矩形成像间隔垫片，厚度为0.2 mm（参见 材料表）。将组织固定于洁净的载玻片上，并转移已清除周围组织的主动脉。确保 正面 主动脉外膜朝向盖玻片。 
		注意：轻轻敲击 正面 主动脉平铺，以血管外膜侧朝上 正面 使用斜角镊子将主动脉置于上方。如有必要，可堆叠多个成像间隔孔以匹配组织大小。</li>
		<li>用60% TDE溶液滴加至主动脉样本上进行封片。小心地将盖玻片贴附于样本孔中，避免样本与盖玻片之间产生气泡。 
		注意：在盖上盖玻片前，需用针小心去除气泡。封片剂不宜过多，以免样本漂动。</li>
		<li>使用倒置型共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）仪器（参见 材料表配备20倍浸油物镜（多相，数值孔径：0.75）。 
		注意：共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）可实现高达70 µm深度的体积成像，且具有更高分辨率，适用于分析主动脉外膜中神经直径及神经-免疫细胞相互作用。</li>
		<li>选择20倍/0.75数值孔径的浸油物镜。根据所用染料调整混合光电二极管探测器。调节显示设置，并选择1024 × 1024像素的XY成像格式。 
		注意：油浸物镜比水浸物镜的信号采集效果更佳。</li>
		<li>在盖玻片上的主动脉部位均匀滴加含甘油的浸油。将63倍物镜粗调至接近样品，直至其接触浸油/盖玻片。</li>
		<li>将63倍物镜在显微镜下微调，以定位目标区域。从外膜侧采集Z轴层扫图像。 正面 以2-4 µm的步长对主动脉进行深度达60 µm的三维成像。</li>
		<li>使用样本信息、扫描信息命名文件，并保存数据。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用多光子显微镜成像TDE清除的主动脉
	<ol>
		<li>按照步骤 1.4.1-1.4.2 安装 表面（en face） 载玻片上的主动脉。</li>
		<li>使用直立式多光子显微镜（参见 材料表配备20倍物镜（水浸，数值孔径：1.00，工作距离 = 2 mm），可实现深达1.5 mm的三维成像。</li>
		<li>从基底侧以10–15 µm的步长采集Z轴层扫图像，深度至700 µm。按照步骤1.4.7中的方法命名文件并保存数据。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 全身免疫染色与iDISCO组织透明化
<ol>
	<li>组织制备
	<ol>
		<li>按照上述步骤1.1.1-1.1.3进行麻醉、固定小鼠和灌注。</li>
		<li>使用手术器械去除皮肤和内脏器官，包括脾脏、肝脏、肺脏以及胃肠道和生殖器官，保留心脏、主动脉和肾脏完整。 原位.</li>
		<li>解剖膈肌水平以上的身体部位，并将下半部分用4% PFA在4 °C固定1-2天。 
		注意：在50 mL离心管中进行固定、洗涤和孵育步骤，并置于轻轻旋转的摇床上。更换溶液时使用新的离心管，重复2-3次。</li>
		<li>在室温下彻底洗涤样本，每次10分钟，共3次。 
		注意：每次将主动脉转移至装有 PBS 的不同试管中。</li>
		<li>将样本在20%透明化脑/体成像鸡尾酒溶液及计算分析（CUBIC）溶液中孵育48小时以进行脱色。 
		注意：配制20% CUBIC溶液时，将25 g尿素溶解于15 mL Triton X-100和28 mL Quadrol中，再用PBS定容至100 mL。由于试剂具有刺激性，应在通风橱中配制（参见 材料表).</li>
		<li>在室温下用 PBS 洗涤样本，每次 1 小时，共洗涤五次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>抗体染色 
	注意：所有孵育步骤均在50 mL带安全锁的离心管中进行，于4 °C下轻柔旋转或振荡孵育。
	<ol>
		<li>在 PBS-明胶-Triton X-100-血清（PGST）溶液中孵育样品过夜，以实现通透和封闭。 
		注意：封闭液根据所用抗体的不同而有所差异。例如，封闭液：PBS-明胶-Triton X-100-血清（PGST，参见 材料表PBS 溶液：含 0.2% 猪皮明胶、0.5% Triton X-100 和 5% 山羊血清</li>
		<li>在PGST溶液中加入一抗孵育样本，例如NF200（1:200稀释，参见 材料表在4 °C下轻轻振荡孵育10–12天。随后在室温下用PGST缓冲液漂洗样品，每次1小时，共5次。</li>
		<li>在4 °C下，将样本在PGST中与二抗溶液（1:300稀释）和DAPI（1 mg/mL）共同孵育7天。</li>
		<li>在PGST中于室温下彻底清洗样本，每次1小时，共5次。将样本转移至PBS中，并将主动脉置于4 °C的PBS中保存，以用于后续步骤。 
		注意：在步骤 2.2.3–2.2.4 中，用铝箔覆盖试管以避光。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>改良的iDISCO组织透明化 
	注意：透明化过程中，应使用铝箔覆盖管子，以避免因直接暴露于自然光或人工光源下导致信号漂白或淬灭。DISCO 透明化过程中使用的所有有机试剂均有危害，所有透明化步骤均须在通风橱中进行。操作试剂时应穿戴实验服、手套和口罩，以避免吸入以及与皮肤和眼睛接触。透明化产生的废液应收集并倒入通风橱内的适当废液容器中。
	<ol>
		<li>将步骤 2.2.4 中染色的样品转移至一系列浓度递增的四氢呋喃（THF，参见 材料表用于脱水的各工作液，即50%、70%、90%和100%（两次100%）。每个浓度孵育12小时。 
		注意：在通风橱中，将四氢呋喃试剂（99%–100%）用蒸馏水稀释，配制成不同浓度的工作液。每6小时更换一次工作液。</li>
		<li>将样品转移至无水二氯甲烷（DCM，参见 材料表）溶液中孵育3小时以去除脂质。</li>
		<li>将样品转移至折射率匹配的苯甲醇-苯甲酸苄酯（BABB）工作液中（参见 材料表孵育3–6小时，直至组织在可见光下呈半透明且大部分透明。 
		注意：配制BABB工作液时，取1份苯甲醇与2份苯甲酸苄酯（1:2）于玻璃瓶中混合。在通风橱中轻轻摇晃5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用光片显微镜对iDISCO透明化组织进行成像 
	注意：一旦样本达到最佳透明度，应立即进行成像。可使用光片显微镜，例如 ultramicroscope-II（参见 材料表），用于成像。将最终的透明化溶液BABB溶液加入成像储液槽中。注意避免将BABB溅到仪器上，以免损坏设备。
	<ol>
		<li>使用1倍空气物镜拍摄覆盖整个样本宽度的低倍图像。将样本从透明溶液中轻轻转移到纸巾上，并短暂干燥。 
		注意：使用钝头镊子，避免挤压样本。</li>
		<li>根据样本/组织的大小选择合适尺寸的样品台，并使用速干胶将样本背面固定在样品台上。 
		注意：等待1-2分钟，直至样品牢固地附着在样品台上。</li>
		<li>用BABB溶液填充光片显微镜的成像储液池，并将样本轻轻放入其中。调整样本夹持装置，确保样本与光片垂直并得到适当照明。</li>
		<li>降低物镜以聚焦样品，并在聚焦过程中调整显示设置，以正确观察样品。在显微镜软件中选择合适的光片（s），并调节其宽度，使整个视野得到均匀照明。 
		注意：在采用双侧激光照明的超显微镜系统中，首先对准并聚焦一侧的激光。待两侧均设置完毕后，同时开启双侧激光，以观察来自两侧照明的融合扫描图像。</li>
		<li>选择远红通道（680 nm）以成像NF200染色的神经结构，选择自体荧光通道（488 nm）以成像未染色的主动脉和结缔组织。根据荧光信号强度调整激光功率，以获得最佳信噪比，并调整曝光时间以及光片宽度（s）。</li>
		<li>选择 x-y-z 扫描模式。设置 z-层扫描，z 步长为 2–8 µm，并在平铺扫描（16 位）的纵向 y 轴方向上选择 25%–60% 的重叠，覆盖样品的腹侧和背侧表面，以成像整个样品体积（深度可达 6–8 mm）。</li>
		<li>使用详细的扫描信息命名，包括扫描日期、样品名称、所用抗体、物镜、缩放倍数、z轴步数以及所用激光器。保存数据。</li>
		<li>通过放大功能切换至更高倍率（2x 或 4x），以成像特定的目标身体区域。</li>
		<li>按照上述步骤 2.4.4–2.4.7 进行成像并保存数据。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 图像处理与分析
注意：处理过程需要高性能计算工作站。由于成像数据量较大（每幅图像 5-100 GB），处理完成后应立即进行数据备份。
<ol>
	<li>共聚焦激光扫描显微镜和多光子显微镜图像的图像处理
	<ol>
		<li>将来自共聚焦激光扫描显微镜和多光子显微镜的Z轴堆叠拼接图像载入配备Las X、Imaris（图像分析软件）或Fiji软件的图像处理工作站，用于三维（3D）和二维（2D）可视化、分割与定量分析。</li>
		<li>为对细胞或结构的体积深度进行彩色编码，使用图像恢复软件（参见材料表）对原始图像进行去卷积处理，并在Las X或Fiji中利用时间彩色编码生成去卷积数据的最大强度投影。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>光片显微镜图像的图像处理
	<ol>
		<li>将Z轴堆叠拼接的TIFF图像序列载入Fiji软件。使用Fiji的拼接插件对图像进行拼接，并将拼接后的图像以TIFF格式保存。 
		注意：如有需要，可将拼接后的图像以LZW格式压缩，以便使用不同软件快速处理。</li>
		<li>将拼接后的图像载入三维可视化软件（参见材料表）进行图像分割。在x-y-z轴上手动追踪神经和血管结构。对于细小神经纤维的手动追踪，需在主动脉与神经节之间沿神经纤维全程，在每一z平面逐像素手动选择NF200+信号。</li>
		<li>将预处理后的图像载入图像分析软件（参见材料表），用于生成视频以及图像的二维和三维可视化。</li>
		<li>利用自发荧光在图像分析软件中对主动脉以及包括淋巴结和肌肉在内的结缔组织进行分割。在图像分析软件中为不同主动脉结构（如主动脉壁和斑块）应用不同的伪彩以实现可视化。</li>
		<li>在Fiji软件中使用对比度受限的自适应直方图均衡化（CLAHE）功能，增强处理后图像背景上的局部对比度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Optimized Tissue-Clearing Protocols for 3D Imaging of the Murine Aorta 

<ol><li>Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+changing+landscape+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The changing landscape of atherosclerosis.</a> Nature. 592 (7855), 524-533 (2021).</li>
<li>Mohanta, S., Yin, C., Weber, C., Hu, D., Habenicht, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aorta+atherosclerosis+lesion+analysis+in+hyperlipidemic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Aorta atherosclerosis lesion analysis in hyperlipidemic mice.</a> Bio Protoc. 6 (11), e1833(2016).</li>
<li>Yin, C., Mohanta, S. K., Srikakulapu, P., Weber, C., Habenicht, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artery+tertiary+lymphoid+organs%3A+Powerhouses+of+atherosclerosis+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Artery tertiary lymphoid organs: Powerhouses of atherosclerosis immunity.</a> Front Immunol. 7, 387(2016).</li>
<li>Mohanta, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artery+tertiary+lymphoid+organs+contribute+to+innate+and+adaptive+immune+responses+in+advanced+mouse+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Artery tertiary lymphoid organs contribute to innate and adaptive immune responses in advanced mouse atherosclerosis.</a> Circ Res. 114 (11), 1772-1787 (2014).</li>
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<li>Kirst, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+fine-scale+organization+and+plasticity+of+the+brain+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping the fine-scale organization and plasticity of the brain vasculature.</a> Cell. 180 (4), 780-795.e25 (2020).</li>
<li>Todorov, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machine+learning+analysis+of+whole+mouse+brain+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Machine learning analysis of whole mouse brain vasculature.</a> Nat Methods. 17 (4), 442-449 (2020).</li>
<li>Bhatia, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+proteomics+in+three-dimensional+intact+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatial proteomics in three-dimensional intact specimens.</a> Cell. 185 (26), 5040-5058.e19 (2022).</li>
<li>Mai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+tissue+labeling+and+clearing+of+intact+human+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Scalable tissue labeling and clearing of intact human organs.</a> Nat Protoc. 17 (10), 2188-2215 (2022).</li>
</ol>

SKM、CJY 和 AJRH 是 Easemedcontrol R &amp;D GmbH 和 Co. KG 的联合创始人。

动脉粥样硬化可被视为一种累及动脉壁全层的跨壁性炎症性疾病。此外，动脉周围还分布着血管周围脂肪组织和神经组织。在动脉粥样硬化进展过程中，这些组织均会发生显著的细胞和结构改变，因此需要能够对健康和病变动脉周围完整组织实现亚细胞光学通透性的研究方法。本文提供的方法有助于深入理解细胞间及细胞与组织间的相互作用，推动对心血管疾病发病机制的认识。组织透明化结合后续的三维显微成像技术，可实现对以往难以触及的大范围完整组织区域进行成像，从而获得动脉的精细三维重建图像。本文介绍了TDE和iDISCO组织透明化技术的操作流程，重点阐述了这些方法在实现近乎完全的组织透明性、利用共聚焦/多光子或光片显微镜进行高效成像的同时，保持组织结构完整性的有效性与简便性。
TDE 透明化技术利用水溶性试剂通过调节折射率（RI）实现组织透明，从而有效保留组织中的荧光信号。该方法适用于微米至毫米尺度、无组织收缩的小型血管组织，是一种高效的组织透明化方法。然而，对于毫米至厘米尺度的较大组织，该方法需要更长的处理时间。重要的是，用户可通过调整试剂浓度和孵育时间，灵活优化实验流程以满足特定需求。相比之下，iDISCO 技术采用一系列有机溶剂去除组织中的脂质和水分，从而在较大组织、完整器官、整只小鼠或较大的人类组织中实现更优的透明效果。该方法具有处理时间短、适用于大体积组织的独特优势。但其主要局限在于会导致透明化样本发生组织收缩、荧光信号淬灭以及脂质丢失，这对富含脂质的动脉粥样硬化组织尤为不利。此外，与共聚焦显微镜或双光子显微镜不同，光片显微镜无法在微米尺度下观察亚细胞结构细节，也无法清晰成像小直径的神经突起，例如单根轴突及其与其他血管细胞的连接。
血管神经支配在动脉粥样硬化的发生发展中起着重要作用6,7,18。研究外周神经在动脉树上的分布及其变化，有助于理解疾病进展过程。由于iDISCO具有高效的组织处理能力，常被用于大鼠和小鼠动脉粥样硬化模型中全血管网络的成像12,19,20,21，可提供高分辨率的三维图像。而TDE则适用于需要保留荧光标记的研究，例如观察特定的神经元标志物，从而精确揭示血管神经支配的细微结构及其变化6。这两种组织透明化技术各有所需，因为TDE透明化过程不引起组织收缩且可对脂质成像，而iDISCO由于脱水和去脂作用会导致组织收缩。此外，改良的iDISCO方案还可用于人类心血管组织的透明化处理22,23。两种透明化技术在研究动脉粥样硬化中动脉重塑方面具有互补优势。通过结合两种方法的优势，有望更全面、深入地理解动脉粥样硬化的病理机制。

组织学技术通过切片组织/器官，为生物样本提供基本的认识。然而，直到最近，要在三维（3D）条件下清晰界定复杂的解剖结构中细胞与细胞、组织与组织之间的相互作用仍然十分困难。这一未满足的需求在心血管系统于健康与疾病状态下的研究中尤为突出。由于光吸收和光散射的影响，完整组织的成像在过去一直具有挑战性，导致其本质上不透明。组织透明化技术通过最大限度减少这些限制，使完整的生物样本变得透明。近年来组织透明化技术的发展，使得对未经切片的透明化组织进行高分辨率三维成像成为可能，从而在微米分辨率下深入揭示整个器官的细胞与结构微细架构，并实现对解剖连接网络的精确界定。
动脉粥样硬化涉及动脉壁的三层结构，包括内层的内膜、中层的中膜以及外层的结缔组织层，后者称为外膜。数十年来，动脉内膜中的动脉粥样硬化斑块一直是研究的传统靶点1,2。然而，外膜层含有血管、淋巴管以及周围神经系统中的神经纤维。此外，外膜还与血管周围脂肪组织和神经组织成分相连，包括周围神经和血管周围神经节3,4。已知周围神经利用外膜作为通路，以到达远端靶组织乃至细胞5。我们近期的研究推动了对多个主要生物系统之间多层次相互作用的理解，这些系统包括免疫系统、神经系统和心血管系统。我们将这些相互作用命名为神经-免疫-心血管界面（neuroimmune-cardiovascular-interfaces）6,7。在动脉粥样硬化发生过程中，动脉壁各组分经历显著的结构重建与重塑。例如，在内膜中动脉粥样硬化斑块进展的邻近区域，会形成免疫细胞聚集物，同时在小鼠主动脉外膜中发生神经轴突新生6,8,9。随着动脉粥样硬化的进展，免疫细胞聚集物进一步发育为结构完整的动脉三级淋巴器官（ATLOs），其内具有明确的T细胞区、B细胞区和浆细胞区10。然而，由于膜通透性不足及固有的光散射问题，对完整组织进行高分辨率三维成像以清晰描绘这些变化一直存在挑战11。组织透明化技术已克服了传统组织学方法的主要局限11,12,13,14,15，通过均匀调节折射率（RI），增强抗体在完整组织或器官中的穿透能力，从而实现微米级分辨率并提高体素成像深度。样本的折射率可匹配至甘油（RI 1.46）或浸油（RI 1.52），从而显著减少光散射和球面像差，实现高分辨率成像。近年来，全器官或全身体组织透明化技术取得了进展，例如基于水相的2,2-硫代双乙醇（TDE）法和溶剂清除器官的免疫标记辅助三维成像法（iDISCO），结合体积成像技术（包括共聚焦、多光子和光片显微镜成像），使得通过构建连接图谱来重建血管结构的微解剖成为可能11,16。以三维方式可视化这些细胞与结构连接，可为解答迄今未解的生物学问题提供新的见解。

<table><tbody><tr><td>2,2&amp;rsquo;-硫代乙醇 (TDE)</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>166782</td><td>透明化试剂</td></tr><tr><td>Amira</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>三维可视化软件；用于对三维图像进行手动分割和追踪的图像处理软件</td></tr><tr><td>苯甲醇</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>W213713</td><td>透明化试剂</td></tr><tr><td>苯甲酸苄酯</td><td>Sigma</td><td>B6630</td><td>透明化试剂</td></tr><tr><td>CD16/32</td><td>eBioscience</td><td>14-0161-82</td><td>封闭溶液</td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜&amp;nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS-SP8 3X</td><td>用于对完整生物组织或切片进行多维、高分辨率成像的成像设备，可在亚细胞分辨率下实现高特异性成像。</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td>细胞核标记物</td></tr><tr><td>二氯甲烷 (DCM)</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>270997</td><td>透明化试剂</td></tr><tr><td>解剖盘-黑色蜡&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>S17432</td><td>主动脉解剖与固定&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica Microsystems&amp;nbsp;</td><td>Stemi 2000</td><td>小鼠器官解剖</td></tr><tr><td>乙醇&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>脱脂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸 (EDTA)</td><td>Roth&amp;nbsp;</td><td>8040.1</td><td>灌注缓冲液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fiji&amp;nbsp;</td><td>(ImageJ, NIH)</td><td></td><td>用于二维和三维图像的开源图像处理软件</td></tr><tr><td>山羊抗仓鼠IgG，Cy3</td><td>Dianova&amp;nbsp;</td><td>127-165-099</td><td>二抗</td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG，Alexa Fluor 680</td><td>Thermo Fisher Scientific / Invitrogen</td><td>A-21109</td><td>二抗&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>山羊抗大鼠IgG，Cy5</td><td>Dianova</td><td>712-175-150</td><td>二抗</td></tr><tr><td>仓鼠抗CD3e&amp;nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>145-2C11&amp;nbsp;</td><td>泛T细胞标记物</td></tr><tr><td>Huygens Professional</td><td>Scientific Volume Imaging, 荷兰</td><td>版本 19.10</td><td>图像恢复软件；主要用于二维和三维图像去卷积的图像处理软件</td></tr><tr><td>图像处理工作站</td><td>MIFCOM&amp;nbsp;</td><td>MIFCOM X5</td><td>配备所有图像处理软件（包括Leica Application Suite X、Fiji和Imaris）的图像处理工作站，用于共聚焦、多光子和光片显微镜所获取图像的后期处理</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>版本 8.4</td><td>图像分析软件；用于三维图像自动分割的图像处理软件</td></tr><tr><td>孵育与旋转仪&amp;nbsp;</td><td>Marshall Scientific&amp;nbsp;</td><td>Innova 4230</td><td>组织&lt;br/&gt;透明化过程中的孵育与旋转装置&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>iSpacer</td><td>Sunjin Lab</td><td>IS4020</td><td>作为样品载体的矩形孔板</td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Livisto</td><td></td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>Leica Application Suite X (LAS-X)&amp;nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td>版本 3.5</td><td>用于处理Leica显微镜所获取图像的图像处理软件</td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM LB</td><td>用于明场成像的成像设备</td></tr><tr><td>光片&amp;nbsp;显微镜</td><td>LaVision BioTech</td><td>Ultramicroscope II</td><td>一种成像技术，通过快速获取薄层光学切片图像，实现对大型生物样本或整只小鼠的快速、高分辨率成像，同时具有低光照损伤的特点。</td></tr><tr><td>多光子显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS-SP5II MP&amp;nbsp;</td><td>一种成像方式，可在长时间内对完整且存活的生物组织进行多维、高分辨率成像，达到亚细胞和分子水平，成像深度大且侵入性极小。</td></tr><tr><td>正常山羊血清&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td>封闭溶液</td></tr><tr><td>多聚甲醛 (PFA)&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>P-6148&amp;nbsp;</td><td>固定&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>P4417-100TAB&amp;nbsp;</td><td>洗涤缓冲液</td></tr><tr><td>猪皮明胶</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>G1890</td><td>孵育缓冲液</td></tr><tr><td>Quadrol</td><td>Sigma</td><td>122262</td><td>CUBIC透明化试剂</td></tr><tr><td>兔抗NF200</td><td>Sigma</td><td>N4142</td><td>泛神经元标记物</td></tr><tr><td>大鼠抗B220&amp;nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>RA3-6B2</td><td>泛B细胞标记物</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>90M003524V&amp;nbsp;</td><td>脱水&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sytox</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11380</td><td>细胞核标记物</td></tr><tr><td>四氢呋喃</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>401757</td><td>透明化试剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>吐温X-100</td><td>Roth&amp;nbsp;</td><td>3051.1</td><td>通透</td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>U5128</td><td>CUBIC透明化试剂</td></tr><tr><td>二甲苯&amp;nbsp;</td><td>Fisher Chemical&amp;nbsp;</td><td>x/0250/17&amp;nbsp;</td><td>麻醉剂&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

动脉粥样硬化中主动脉组织的三维成像

Three-Dimensional Imaging of Aortic Tissues in Atherosclerosis

近期研究加深了人们对动脉粥样硬化作为一种跨壁性慢性炎症性疾病的理解，该疾病累及动脉壁的全部三层结构，包括内膜斑块、中膜以及构成动脉外层结缔组织被膜的外膜。我们最近的研究表明，外膜被周围神经系统用作通向所有组织细胞的传导通路。我们还发现，周围神经系统（即感觉神经系统和交感神经系统）会发生显著的重塑过程，包括在动脉粥样硬化斑块邻近区域新生轴突网络。在此背景下，阐明神经网络的结构及其与病变动脉血管组分之间的相互作用，对于深入理解心血管疾病的发生机制具有重要意义。为实现这些目标，需要开发能够对完整健康的和病变的动脉及其周围的血管周围结构进行亚细胞水平成像的方法。组织透明化技术使得对原本难以触及的较大组织区域进行完整的深层组织成像成为可能，它通过整合标记、透明化、先进显微成像和图像处理工具，实现对完整动脉的三维成像。本文中，我们描述了两种不同但互补的被动组织透明化方法，即基于水相的2,2-硫代二乙醇（TDE）透明化法和基于溶剂的免疫标记辅助的溶剂透明化器官三维成像法（iDISCO），用于对分离的小鼠主动脉节段或原位全主动脉进行成像。

为了展示完整健康的和病变主动脉的显微解剖结构，并揭示动脉粥样硬化小鼠模型中免疫系统、神经系统与心血管系统之间的物理连接关系，我们采用了两种互补的组织透明化方法：分离主动脉的TDE透明化处理，以及整只小鼠的iDISCO透明化处理（图1）。在进行整体免疫染色后，采用一系列TDE工作液对enface主动脉进行透明化处理。折射率（RI）被匹配至1.4–1.5，具体数值取决于最终步骤中TDE溶液的浓度，以在不改变主动脉组织体积的前提下实现最佳透明效果（图1A）。与TDE透明化不同，iDISCO透明化流程在整体免疫染色前包含脱色和通透步骤，随后使用不同的有机溶剂进行脱脂和脱水，并将折射率匹配至1.56（图1B）。由于组织在该过程中发生收缩，iDISCO透明化可实现大尺寸组织甚至整只小鼠全身的可视化。
对经TDE透明化处理的完整en face主动脉进行共聚焦和多光子三维成像，可实现对多种结构的可视化观察，包括内膜斑块、外膜细胞分布以及外膜神经投射等；而对经iDISCO透明化处理的小鼠进行光片成像，则可实现动脉树、血管周围脂肪组织、肾淋巴结及其相关神经组分（包括神经和神经节）的可视化与三维重建（图1C）。例如，对经TDE透明化处理的动脉粥样硬化主动脉进行共聚焦成像，可在斑块中检测到多个CD3e标记的T细胞，并在ATLOs中观察到不同直径的NF200标记神经纤维广泛新生；而对老龄Apoe-/-小鼠经TDE透明化处理的整装病变腹主动脉进行多光子成像，则显示在ATLOs内B220阴性T细胞区域中，表达NF200的轴突发芽具有空间区域性（图2A）。相反，对经iDISCO透明化处理的整只小鼠腹部进行光片成像，可清晰呈现主动脉与邻近交感神经节之间的空间关系。通过对从神经节至主动脉表面的单根轴突进行三维图像分割与追踪，揭示出显著的神经重构现象，包括在靠近动脉粥样硬化斑块的主动脉外膜中新生的NF200标记轴突（图2B）。
<img alt="主动脉透明化方法示意图，TDE与iDISCO步骤，三维成像，抗体染色" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67400/67400fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1研究流程图 (A基于水的TDE透明化处理 en faced 主动脉。B基于溶剂的iDISCO法对整只小鼠进行透明化处理。C3D 体积成像及光学透明化处理的离体主动脉或完整小鼠样本的图像处理. 该图已根据 Sun 等人的许可进行修改。17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67400/67400fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="基于水的TDE和iDISCO透明化；共聚焦和多光子显微镜显示神经纤维。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67400/67400fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：TDE和iDISCO透明化组织的三维图像示例。（A）TDE透明化的en face主动脉三维成像。上图：共聚焦图像显示内膜斑块中的CD3e+ T细胞（红色，箭头）以及动脉粥样硬化主动脉外膜（ATLO）中的NF200+神经轴突（绿色）；下图：多光子图像显示78周龄雄性Apoe-/-小鼠ATLO中的NF200+神经轴突（绿色，箭头）、B220+ B细胞（红色，空心三角形）以及胶原来源的二次谐波信号（SHG，白色）。Sytox（蓝色）和DAPI（蓝色）标记细胞核。（B）iDISCO透明化的小鼠完整腹部的三维重建与分割图像。光片显微镜对NF200+神经及轴突（箭头，绿色）进行三维重建、分割和追踪，并展示其与完整腹主动脉交感神经节（箭头）的空间关系。空心三角形指示位于动脉粥样硬化斑块附近新形成的轴突。自发荧光（auto）用于成像主动脉和结缔组织，包括斑块（青色）和肾淋巴结（RLN，蓝色）。CG：腹腔神经节；SycG：交感神经链神经节。本图经Mohanta等6和Sun等17许可修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67400/67400fig02largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

本文介绍了优化的组织透明化方案，用于对小鼠主动脉进行三维（3D）成像。我们详细阐述了免疫染色、光学透明化和成像的前沿操作步骤，旨在明确在动脉粥样硬化中，外周神经系统与动脉粥样硬化斑块及外膜之间的解剖学邻近关系。

近期研究加深了对动脉粥样硬化作为一种跨壁性慢性炎症性疾病的理解，该疾病累及动脉壁的三层结构……

我们的研究重点是了解神经系统在动脉粥样硬化进展中的作用。具体而言，针对神经与病变部位的每一次相互作用，我们旨在阐明在动脉粥样硬化过程中神经如何发生变化，以及这种相互作用如何影响疾病的进展。目前，多项前沿技术正被用于推动动脉粥样硬化研究，以加深对疾病机制的理解。这些技术包括组织透明化与三维成像、先进的显微技术、人工智能、单细胞测序以及机器学习。在动脉粥样硬化进展过程中，动脉壁成分会发生显著的结构重塑。对完整组织进行三维、高分辨率成像以清晰描绘这些变化，是目前关键的实验挑战。本文所述的成像工具将有助于研究人员和心脏病学家更深入地理解疾病，并最终帮助治疗患者。此处描述的方案相较于传统技术具有多项优势，例如能够对完整组织进行深层组织成像，并可视化那些原本无法观察到的结构。这些方案将有助于更好地理解细胞间以及细胞与组织间的相互作用，从而加深对疾病进展机制的认识。在完整组织中以三维方式可视化细胞和结构变化，可为深入理解心血管研究中尚未解答的生物学问题提供新的见解。首先，将麻醉后的小鼠置于覆盖有手术纸巾的泡沫板上。使用胶带将小鼠的四肢固定，使其呈仰卧位。用75%乙醇对胸部进行消毒。使用1毫升一次性注射器从左心室采集血液。然后在胸部做正中切口，并在右心房做一小切口。用 10 毫升含 5 毫摩尔 EDTA 的 PBS 缓冲液灌注小鼠左心室 5 分钟，直至血液完全冲洗干净，随后用 20 毫升 PBS 缓冲液灌注 5 至 10 分钟。最后用 10 毫升 4% 多聚甲醛灌注 20 分钟。在解剖体视显微镜下，取出包括胃肠道和生殖器官在内的内脏器官。保持心脏、主动脉和肾脏完整。然后仔细移除胸腺及周围脂肪组织。暴露从升主动脉至髂动脉分叉处的整个主动脉。取出整个主动脉，放入盛有 PBS 的培养皿中。将主动脉分离成不同的节段，并沿纵轴切开，用于 2,2'-硫代二乙醇（TDE）透明处理。将主动脉断端朝下呈 Y 形固定在平坦的黑色石蜡板上，并在 4°C 条件下用 4% 多聚甲醛固定过夜。第二天，取下主动脉并将其转移至 PBS 中洗涤 5 分钟。随后将主动脉放入封闭液中，封闭和透化处理 2 小时。接着，将主动脉在封闭液中与一抗于 4°C 孵育 24 小时。用 PBS 清洗主动脉 5 分钟，重复 5 次，随后在 10% 正常驴血清中与二抗及 DAPI 孵育过夜，用于核染色。将染色后的主动脉转移至浓度递增的 TDE 溶液中。接下来，将双面粘性矩形成像间隔垫固定在洁净的载玻片上，转移透明化后的主动脉，确保其端面的主动脉外膜朝向盖玻片。用数滴 60% TDE 溶液封片，并小心地将盖玻片贴附于凹槽上，避免产生气泡。开启配备20倍油浸物镜的倒置共聚焦激光扫描显微镜。根据染色染料调节混合光电二极管探测器。调整显示设置，选择1024×1024像素的XY格式进行成像。在盖玻片上滴加浸油，将63倍物镜粗略移向样品，直至接触浸油和盖玻片。随后确定目标区域，从主动脉断端外膜侧开始，以2至4微米的步长采集深度达60微米的Z轴层扫图像，用于三维成像。根据样品信息和扫描参数命名文件，并保存数据。使用配备20倍物镜的直立式多光子显微镜，从管腔外侧以10至15微米的步长采集深度达700微米的Z轴图像序列。在用PBS和多聚甲醛麻醉并灌注小鼠后，解剖横膈膜水平以上的身体部分。将下半部分身体用4%多聚甲醛在4摄氏度下固定一至两天。接着，用 PBS 充分清洗样本 10 分钟，重复三次。将样本在 20% cubic 溶液中孵育 48 小时。用 PBS 清洗后，将样本在 PGST 溶液中孵育过夜，以实现通透和封闭。第二天，在 PGST 溶液中加入一抗，于 4°C 轻柔振荡孵育 10 至 12 天。用 PGST 溶液洗涤样本后，加入含 DAPI 的二抗 PGST 溶液，于 4°C 孵育 7 天。最后用 PGST 溶液彻底洗涤样本，每次 1 小时，重复 5 次。将染色后的样品转移至一系列浓度递增的四氢呋喃工作溶液中进行脱水，每个浓度孵育12小时。脱水后，将样品置于纯二氯甲烷溶液中孵育3小时以去除脂质。随后，将样品在折射率匹配的苯甲醇-苯甲酸苄酯溶液中孵育3至6小时。首先，将小鼠主动脉和下半身部分的Z轴层扫拼接图像载入图像处理工作站。为了对细胞或结构的体积深度进行颜色编码，请使用图像复原软件对原始图像进行去卷积处理。在Fiji软件中，利用时间颜色编码对去卷积后的数据生成最大强度投影。将Z轴堆栈平铺的TIFF图像序列加载到软件中。使用Fiji的拼接插件对图像进行拼接，并以TIFF格式保存。接着，将拼接后的图像导入三维可视化软件，进行图像分割。在主动脉与神经节之间的整个路径上，沿 X-Y-Z 轴手动追踪神经元结构。将预处理后的图像载入图像分析软件。利用自发荧光对主动脉和结缔组织进行分割。对不同的主动脉壁和斑块应用单独的伪彩色以进行可视化。最后，使用限制对比度自适应直方图均衡化函数，增强处理后图像背景上的局部对比度。经TDE清除的动脉粥样硬化主动脉显示斑块中存在CD3e染色的T细胞，以及动脉三级淋巴器官中NF200染色神经纤维的广泛新生。对载脂蛋白E基因敲除小鼠腹主动脉疾病部位进行多光子成像，发现动脉三级淋巴器官中缺乏B220阳性B细胞的区域存在表达NF200的轴突发芽现象。利用iDISCO透明化小鼠腹部的光片成像技术，可视化了主动脉与交感神经节之间的空间关系，并观察到新生的NF200染色轴突位于紧邻动脉粥样硬化斑块的外膜区域。

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学习使用组织透明化与多光子显微技术对小鼠主动脉进行三维成像，研究动脉粥样硬化进展中外周神经系统与斑块的相互作用，揭示细胞结构变化，为心血管疾病研究提供新方法。

动脉粥样硬化中主动脉组织的三维成像

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