Name: 从可见光到短波红外的生物吸收光谱的表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-10T13:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 学习可见光至短波红外生物吸收光谱的表征方法，用于孕产妇健康诊断。本研究通过双光束光谱仪测量氧合与脱氧血红蛋白样品，优化实验设置以获得高信噪比光谱，有助于减少皮肤色素沉着偏差并扩展生物吸收体数据库。

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本研究工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R00HD103954和R21EB035823的支持。本出版物中报告的研究工作还获得了美国国立卫生研究院（NIH）转化科学促进国家中心（NCATS）通过华盛顿大学临床与转化科学研究所资助项目UL1TR002345的支持。本内容仅由作者负责，不代表NIH的官方观点。作者谨此感谢O'Brien实验室成员、Michael Vahey及其实验室成员，以及Huanzhu Jiang提供的协助。

1. 样品制备
<ol>
	<li>水样的制备
	<ol>
		<li>制备样品时，将超纯水加入洁净容器中，并使用 0.22 µm 注射器滤膜过滤。确保注射器的滤出液直接进入洁净的玻璃或石英比色皿，用于样品的吸收光谱测量。</li>
		<li>制备参比样品时，将重水加入洁净容器中，并使用 0.22 µm 注射器滤膜过滤。确保注射器的滤出液进入与样品比色皿相同且洁净的玻璃或石英比色皿，作为参比。
		 
		注：过滤步骤可去除水中的微小颗粒，从而最小化样品的光散射，这些颗粒在可见光区域具有较强的散射贡献。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>黑色素样品的制备
	<ol>
		<li>通过将黑色素粉末加入装有 3.5 mL 二甲基亚砜（DMSO）的离心管中，配制浓度为 1.7 mg/mL 的黑色素溶液。测量应从预期吸收最低的波长开始，此时需要最高浓度的黑色素。黑色素测量初始浓度约为 1.7 mg/mL，用于短波红外（SWIR）区域；随后用 DMSO 稀释 10 倍（约 0.17 mg/mL），用于可见光/近红外（VIS/NIR）区域。</li>
		<li>将离心管超声处理 10 分钟，确保黑色素粉末完全溶解于 DMSO 中，然后将溶液转移至洁净的玻璃或石英比色皿，用于光谱测量。</li>
		<li>通过调整浓度和/或光程（例如，从短光程（1 或 2 mm）切换至 10 mm 光程比色皿），确保吸光度处于光谱仪的线性范围内，并获得高信噪比（SNR）的测量结果。黑色素的吸收范围宽，覆盖可见光至短波红外区域。在可见光区域，由于其摩尔消光系数较高，应使用最低浓度和/或最短光程的比色皿；在短波红外区域，应使用最高浓度和/或最长光程的比色皿，以获得质量良好的光谱测量结果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>玉米油样品的制备
	<ol>
		<li>将玉米油加入洁净的玻璃或石英比色皿中，用于光谱测量。</li>
		<li>以开放空气作为参比。参比测量不使用比色皿或溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用全血肝素化人血制备氧合血红蛋白样品 
	注：全血肝素化人血购自美国食品药品监督管理局（FDA）许可的采血中心。
	<ol>
		<li>为从红细胞（RBCs）中分离血红蛋白并尽可能去除血液中的水分，首先将 1,800 µL 全血肝素化人血用移液器加入微量离心管中，在 9.6 × g 条件下离心 10 分钟。 
		注：建议使用约 4–6 个微量离心管</li>
		<li>离心后，从微量离心机中取出离心管，小心移除并弃去上清液（约 850 µL），避免扰动沉淀（图 2）。上清液为红细胞沉淀上方的液体部分（主要为血浆和血小板）。在微量离心管底部观察红细胞沉淀。</li>
		<li>用与弃去上清液体积相等的重水重悬每个沉淀，再次在 9.6 × g 条件下离心 10 分钟。</li>
		<li>从离心机中取出离心管，弃去上清液，避免扰动沉淀。</li>
		<li>再次用与弃去上清液体积相等的重水重悬沉淀，重新在 9.6 × g 条件下离心 10 分钟。</li>
		<li>从离心机中取出离心管，用移液器小心移除上清液并弃去。</li>
		<li>裂解红细胞（RBCs）：用大量重水（4.5 mL）重悬红细胞沉淀，引起低渗破裂。若沉淀粘附于管壁，可用部分已量取的 4.5 mL 重水冲洗以松动沉淀。 
		注：每次离心后上清液体积会增加，范围约为 800 µL 至 1,600 µL。裂解所用重水体积可根据所需样品浓度调整，但必须足够大以引起低渗破裂。</li>
		<li>用针头和注射器将裂解后的血液溶液从离心管中取出，小心移除钝头注射器针头，并将其丢弃至生物危害锐器容器中。将注射器连接至 0.22 µm 注射器滤膜，推动注射器内容物通过滤膜，收集至 10 mm 光程、3.5 mL 容量的玻璃或石英比色皿中。 
		注：过滤步骤可去除溶液中的细胞器和细胞膜，从而最小化样品的光散射。若样品浓度过高导致注射器滤膜难以推动，可使用多个注射器滤膜。</li>
		<li>用气密性塞子密封比色皿，防止空气中的水蒸气污染样品。在塞子外部包裹 Parafilm 膜，进一步防止污染并确保气密性密封。 
		注：在 600 nm 至 1,600 nm 波长范围内测量时，将约 1,200–1,600 µL 沉淀溶解于 4.5 mL 重水中，可获得质量良好的测量结果。 
		注：在预期吸光度较高的波段（400 nm 至 600 nm），需用重水稀释样品，以获得未饱和的吸光度值，并确保吸光度处于检测器的线性范围内。此外，样品和参比应使用短光程比色皿（1 或 2 mm）。本文所示光谱中，400–500 nm 波段样品稀释 10 倍，500–600 nm 波段稀释 5 倍，并在 2 mm 光程比色皿中测量。 
		&#8203;较短的光程（1 或 2 mm）可减少强吸收波长下的光吸收，有助于确保部分光子透过样品到达检测器，并保持在线性检测范围内。</li>
		<li>取一个与含过滤血液溶液的样品比色皿具有相同光程和体积的洁净比色皿，加入重水，用于基线和参比测量。若在不同光谱范围使用不同光程的比色皿，需为每种光程的比色皿记录新的参比光谱。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用全血肝素化人血制备脱氧血红蛋白样品
	<ol>
		<li>按照步骤 1.4.1–1.4.8 操作。</li>
		<li>向比色皿中的血液溶液中加入连二亚硫酸钠，并轻轻搅拌。用气密性塞子密封比色皿，防止空气中的水蒸气污染样品。在塞子外部包裹 Parafilm 膜，进一步防止污染并确保气密性密封。小心地将比色皿左右倾斜，确保连二亚硫酸钠完全溶解；血液溶液颜色将由红色变为深紫红色。 
		注：为完全脱氧血红蛋白，每毫升血液溶液所需连二亚硫酸钠质量约为 0.007 g。根据 Briley-Sӕbø 和 Bjørnerud 的研究，每克全血至少需要 2.5 mg 连二亚硫酸钠才能完全脱氧18。然而，本研究发现该浓度不足。约 3.4 mg/g 全血的浓度可完全脱氧血液溶液，且不引入光散射。在 400 至 600 nm 波段测量时，需用重水稀释血液溶液。连二亚硫酸钠的质量应根据所用血液溶液体积计算，而非稀释后的体积。在 600 nm 至 1,600 nm 波段测量时，将约 1,200–1,600 µL 沉淀溶解于 4.5 mL 重水中，可获得高信噪比的测量结果。 
		较短光程的比色皿（1 或 2 mm）可减少强吸收波长下的光吸收，有助于确保部分光子透过样品到达检测器，并保持在线性检测范围内。</li>
		<li>另取一个与含过滤血液溶液的比色皿光程相同的比色皿，加入重水，用于基线和参比测量。若在不同光谱范围使用不同光程的比色皿，需为每种光程的比色皿记录新的参比光谱。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 获得高质量的吸收测量数据
<ol>
	<li>按照第1节所述制备样品和参比液，并将其置于玻璃或石英比色皿中用于可见光-近红外-短波红外（VIS NIR-SWIR）测量。打开光谱仪光源和检测器，让系统预热至少5-20分钟，具体时间取决于光谱仪系统和光源类型。 
	注意：本文所采集光谱的检测器冷却和光源输出稳定性在5分钟内已足够，但在进行吸光度测量前，应针对每套系统单独评估其稳定所需时间。 
	在此采集期间，确保样品和参比液随时可用。确认比色皿盖子已牢固封闭。尽量保持测量环境黑暗，以防止环境光干扰导致吸光度测量失真。</li>
	<li>由于可见光至短波红外范围内吸光度差异较大，需针对光谱的不同区域重复以下步骤：
	<ol>
		<li>若使用双光束配置（分别为样品和参比配备独立检测器），请确保系统已完成基线校正。通过将含有溶剂的相同参比样品分别置于两个检测器前，并使用与后续样品吸光度光谱采集完全相同的参数采集一次吸光度测量值，来获取基线。理论上检测器应显示零吸光度，但实际上通常并不完全理想。将所得的吸光度光谱从所有使用相同设置采集的样品吸光度光谱中扣除。 
		注意：每次更改数据采集的设置后，均应重新进行基线校正。</li>
		<li>将样品放入光谱仪中，选择与待测区域相对应的检测器（VIS-NIR区域使用硅基检测器或紫外-可见光电倍增管（PMT），SWIR区域使用InGaAs检测器），并在实时模式下查看吸光度，该模式下测量值会随着参数调整而持续更新。</li>
		<li>从光谱仪的默认参数开始，调节入射光功率和曝光时间，直至获得一条无饱和现象、质量良好的吸光度光谱。
		<ol>
			<li>如果调节参数仍无法获得质量良好的光谱，请尝试调整入射光功率、曝光时间、光程长度和样品浓度等参数。首先尝试调节功率和曝光时间。若调节这些参数仍无法获得高信噪比（SNR）的光谱，则改变样品和参比液的样品浓度或光程长度。 
			注意：本文所示光谱采集所使用的默认参数为：在400 nm处入射光功率为15 nW，在1,000 nm处为20 nW，曝光时间为30 ms，比色皿光程长度为10 mm，样品具体浓度分别为：纯水（100%）、黑色素1.7 mg/mL、纯玉米油（100%）、氧合血红蛋白（15.9 g/dL）和脱氧血红蛋白（15.9 g/dL）。</li>
			<li>为提高信噪比（SNR），可增加每个数据点所平均的数据读取次数。平均读取次数越高，单次测量所需时间越长。</li>
			<li>为提高光谱分辨率，可将测量步长（nm）减小至光谱仪的分辨率极限。这将延长每次测量所需时间。此外，将入射光功率带宽减小至最窄峰半高全宽（FWHM）的1/10th。19</li>
			<li>当测量参数针对样品优化完成后，记录每条所采集光谱的设置参数。</li>
			<li>为获取光谱，先使用优化后的参数仅对参比液进行一次测量。随后，将参比比色皿替换为样品比色皿，再进行一次测量。请确保分别保存参比和样品的测量数据。 
			注意：参比测量绝不能发生饱和。若出现饱和，应降低入射光功率和/或曝光时间，直至无饱和现象。参比与样品测量之间的所有系统参数必须保持一致；若其中一个参数需要更改，则另一个测量也必须重新进行以匹配。</li>
			<li>对于每一对参比和样品测量数据，通过将参比测量值视为Io、样品测量值视为I，按公式（Eq 1）计算吸光度A。</li>
			<li>若不同光谱区域因样品浓度或光程长度不同而需拼接，应对其中一个光谱区域应用乘法因子进行校正。例如，若第一个区域的浓度为第二个区域的1/10且光程长度相同，则将第一个光谱区域乘以10，以实现两个区域的正确比例对齐。 
			注意：乘法因子应等于各区域之间浓度和/或光程长度的差异倍数。</li>
			<li>在对光谱进行光程长度或浓度差异校正后，选择两个光谱区域中波长重叠的部分作为拼接点。</li>
			<li>将两条光谱截断至重叠波长处结束；选择其中一条光谱保留其过渡处的光谱值。将两条截断后的光谱连接，形成一条覆盖更宽波长范围的单一光谱。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Optimizing VIS-SWIR Spectroscopy for Biological Molecules

<ol><li>Cao, Q., Zhegalova, N. G., Wang, S. T., Akers, W. J., Berezin, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multispectral+imaging+in+the+extended+near-infrared+window+based+on+endogenous+chromophores%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Multispectral imaging in the extended near-infrared window based on endogenous chromophores.</a> J Biomed Opt. 18 (10), 101318(2013).</li>
<li>Yao, J., Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+of+photoacoustic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Photoacoustics%22%5BJournal%5D)">Sensitivity of photoacoustic microscopy.</a> Photoacoustics. 2 (2), 87-101 (2014).</li>
<li>Jacques, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+properties+of+biological+tissues%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Optical properties of biological tissues: a review.</a> Phys Med Biol. 58 (11), R37(2013).</li>
<li>Prahl, S. A. Optical absorption of hemoglobin. , 
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<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetration+depth+of+photons+in+biological+tissues+from+hyperspectral+imaging+in+shortwave+infrared+in+transmission+and+reflection+geometries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Penetration depth of photons in biological tissues from hyperspectral imaging in shortwave infrared in transmission and reflection geometries.</a> J Biomed Opt. 21 (12), 126006(2016).</li>
<li>Du, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperspectral+imaging+and+characterization+of+allergic+contact+dermatitis+in+the+short-wave+infrared%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Hyperspectral imaging and characterization of allergic contact dermatitis in the short-wave infrared.</a> J Biophotonics. 13 (9), e202000040(2020).</li>
<li>Roggan, A., Friebel, M., Dörschel, K., Hahn, A., Mueller, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+properties+of+circulating+human+blood+in+the+wavelength+range+400-2500+nm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Optical properties of circulating human blood in the wavelength range 400-2500 nm.</a> J Biomed Opt. 4 (1), 36-46 (1999).</li>
<li>Kuenstner, J. T., Norris, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrophotometry+of+human+hemoglobin+in+the+near+infrared+region+from+1000+to+2500+nm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Near+Infrared+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">Spectrophotometry of human hemoglobin in the near infrared region from 1000 to 2500 nm.</a> J Near Infrared Spectrosc. 2 (2), 59-65 (1994).</li>
<li>Smith, B. C. Spectral subtraction. , 
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<li>Fawzy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Racial+and+ethnic+discrepancy+in+pulse+oximetry+and+delayed+identification+of+treatment+eligibility+among+patients+with+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Racial and ethnic discrepancy in pulse oximetry and delayed identification of treatment eligibility among patients with COVID-19.</a> JAMA Intern Med. 182 (7), 730-738 (2022).</li>
<li>Sudat, S. E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Racial+disparities+in+pulse+oximeter+device+inaccuracy+and+estimated+clinical+impact+on+COVID-19+treatment+course%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Racial disparities in pulse oximeter device inaccuracy and estimated clinical impact on COVID-19 treatment course.</a> Am J Epidemiol. 192 (5), 703-713 (2023).</li>
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<li>Butler, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absorption+spectroscopy+of+biological+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Absorption spectroscopy of biological materials.</a> Methods Enzymol. 24, 3-25 (1972).</li>
<li>Tang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+extinction+cross+sections+and+molar+attenuation+coefficient+of+small+gold+nanoparticles+and+experimental+observation+of+their+UV-vis+spectral+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Spectrochim+Acta+A+Mol+Biomol+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">Calculation extinction cross sections and molar attenuation coefficient of small gold nanoparticles and experimental observation of their UV-vis spectral properties.</a> Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc. 191, 513-520 (2018).</li>
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</ol>

Christine O'Brien 和 Leonid Shmuylovich 对 Armor Medical Inc. 拥有财务所有权利益，如果该公司成功销售与本研究相关的产品，他们可能获得经济收益。

本文所述的实验方案可用于获取生物吸收体和对比剂的可见光-短波红外（VIS-SWIR）吸收光谱。本文展示了获取水、黑色素、玉米油、氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白在400 nm至1,600 nm波长范围内光谱的具体步骤。以下讨论涵盖了关键操作步骤、测量优化建议、该方法的局限性，以及该方案在生物医学领域中的应用。
尽管所有实验步骤都很重要，但要获得准确的光谱数据，必须遵循几个关键步骤。首先，样品必须无散射性；例如，在从血液中制备氧合和脱氧血红蛋白时，必须去除样品中的散射颗粒（此处使用了0.22 µm的注射器滤膜）。在制备脱氧血红蛋白时，所加入的连二亚硫酸钠的量不应超过规定的重量，因为在较高质量百分比下会使样品变浑浊，从而不满足比尔-朗伯定律的要求。
其次，对于血红蛋白等水溶性溶质，必须使用重水作为样品溶剂和参比。在短波红外（SWIR）区域，水的吸收较强，可能掩盖其他吸收物质。第三，测量必须在探测器的线性响应范围内进行，该范围定义为到达探测器的光子数量变化能够引起探测器信号呈线性变化的区域。如果吸收极弱，即使实际存在吸收，探测器也可能记录为零吸光度。这种情况通常发生在样品浓度过低、曝光时间过短和/或比色皿光程过短时，可通过提高样品浓度、增加比色皿光程或延长曝光时间来纠正。类似地，如果吸收过强，探测器可能无法接收到任何光子，导致出现一条被称为&#34;饱和&#34;的平直线，此时信号对吸光度的变化不再敏感。这种情况通常由样品浓度过高、曝光时间过短和/或光程过长引起，可通过降低样品浓度、延长曝光时间或缩短比色皿光程来解决。
第四，所使用的检测器必须具有线性响应。如果无法确定检测器对到达的光子数量是否呈现线性响应，可使用相同的采集参数测量样品的一系列不同稀释浓度，检查其吸光度值是否表现出吸光度与浓度之间的预期线性关系。或者，也可测量单一样品，并逐步增加曝光时间，以检测检测器信号强度是否呈线性增长。若用户在检测器的线性范围内操作，上述两种测试均应得到线性关系（参见上述第三个关键点）。
第五，为了在整个可见光-短波红外（VIS-SWIR）光谱范围内保持检测器处于线性响应范围，需要针对与起始光谱区域相比吸光度显著更高或更低的不同光谱区域，调整样品浓度、检测器曝光时间或比色皿光程。
第六，若使用不同样品浓度或不同光程对不同光谱区域进行测量，则必须基于已知的浓度或光程变化，通过线性缩放其中一个区域的光谱，将各区域光谱拼接在一起。缩放后，应在两个区域重叠的波长处进行拼接。如果测量范围涉及不同检测器的数据，则应包含覆盖目标检测器转换波长的重叠吸收光谱（在拼接紫外-可见光与短波红外区域时，通常使用800 nm）。每条光谱在检测器转换波长处被截断，并选择其中一条光谱保留其原始的检测器转换波长处的吸光度值。随后，将两条截断后的光谱连接起来，形成一条连续的扩展光谱。
获取高质量吸收光谱的其他建议包括：使用目标样品已发表的光谱（即使其未覆盖待测的完整光谱范围）来指导测量。了解 先验的 在吸光度最低的波长范围内，可先使用浓度最高的样品在此区域开始测量，然后据此进行调整和稀释。这有助于判断根据预期的吸光度变化幅度需要分段测量的区域数量。此外，若测得的光谱与已发表的光谱一致，可确认已获得预期的光谱；若不一致，则可重新审视样品制备方法以及可能导致光谱失真的各种因素。
吸收光谱可能需要进行后期处理。例如，可使用数字移动平均滤波器对吸收测量值进行平滑处理，并可通过数据集修复去除已知误差点，即删除错误的数据点，并在无误差的点之间进行插值。
该方法的局限性包括对具有光学散射特性的样品（如全血）测量不准确。为了准确测定血红蛋白，需先裂解血液样本，再用注射器滤膜过滤，以去除大多数其他可能引起光散射的残余细胞成分。同样，由于组织散射的存在，该方法也不适用于in vivo（活体）检测。尽管基于比尔-朗伯定律的吸光度测量可能较为繁琐且有时难以操作，但它仍是纯光学吸收测量的金标准方法。此外，某些溶剂使得获取特定溶质的纯净吸光谱变得尤为困难。例如，氧合与脱氧血红蛋白的天然溶剂是水，但水在短波红外区（SWIR）具有较强的吸收，会掩盖氧合血红蛋白的吸收信号。因此，我们通过反复离心、移除上清液，并用吸收较弱的重水（氘代水）重新悬浮，以尽量去除血液中的水。由肝素化人全血获得的氧合与脱氧血红蛋白光谱，在约1,300 nm至1,600 nm范围内，仍可能存在因水残留吸收导致的微弱干扰信号，如图3所示。尽管该方法可能并未完全将水的吸收与氧合/脱氧血红蛋白的信号完全分离，但我们观察到在400 nm至1,000 nm范围内的光谱与高引用率的已发表氧合和脱氧血红蛋白光谱高度一致，并将光谱范围向外延伸了数百纳米2,3。
本文所述方案将有助于研究人员扩展吸收光谱库，以纳入多种生物组分和对比剂的可见光-短波红外（VIS-SWIR）光谱。这些知识可用于改进对基础生物学和生理学的理解，通过在比现有大多数系统更长的波长下进行非侵入性生物医学成像与传感，实现更深层组织的探测。引入短波红外（SWIR）波长可拓宽可非侵入性监测的组织组分类型，并可能为新型监测与诊断技术的开发提供依据。此外，在近红外（NIR）和短波红外（SWIR）波段运行的设备有望减轻光学设备在可见光（VIS）和近红外（NIR）波段运行时所报道的皮肤色素偏倚问题，是开发公平性医疗设备的有前景策略。

大多数生物吸收物质已在可见光（VIS，约400–700 nm）和近红外（NIR，约700–1,000 nm）光谱范围内进行了光学表征，但在短波红外（SWIR，约1,000–3,000 nm）范围内尚未充分研究1,2,3,4（图1）。尽管SWIR具有更深的光穿透能力，这是由于组织散射较低、黑色素吸收减少，并且在水、脂质和蛋白质方面可提供额外的无标记生物对比度1,5,6，但目前仍缺乏覆盖可见光至短波红外范围的吸收光谱数据，这一知识空白阻碍了能够利用SWIR优势的生物医学光学设备的发展。尽管过去已有若干研究尝试对这些光谱进行表征，但仍缺乏高质量、不含显著溶剂干扰的纯组分可见光–短波红外吸收光谱1,7,8。例如，像血红蛋白等水溶性物质在SWIR范围内的表征通常以水作为溶剂，并从所得光谱中扣除纯水的吸收信号9。然而，由于水在该波段是主要的吸收物质，这种方法的准确性尚不明确。
在SWIR波段工作具有额外优势，可减少或可能消除在使用可见光波段时因黑色素强烈吸收而引起的偏差 体内 光学诊断。大量研究发现，脉搏血氧仪对黑人患者的氧合水平存在高估现象，因此黑人患者更有可能出现脉搏血氧仪未能检测出的危险性低氧水平。10这种皮肤色素沉着偏差已导致许多黑人低氧患者的医疗救治被延误或不足11,12 并促使光学与工程领域呼吁采取行动，以提高光学设备对所有肤色的检测准确性13从高黑色素吸收的可见光波段转向近红外（NIR）和短波红外（SWIR）波段，是一项令人振奋的技术创新，有望减少在至关重要的生物医学光学技术中存在的种族差异。
记录生物分子的真实吸收光谱对于理解在多种工程和生物医学应用中使用的组织样本的光学特性至关重要14。吸收光谱法通过测量分子对特定波长光的吸收来表征其特性。在溶液中获取吸收测量值的金标准方法是将准直的单色光穿过溶解的样品，并在光源相对的一侧使用探测器记录透射光。样品的吸收度（A）由公式（1）定义。
A = log10(I0/I)&#160; &#160; &#160;（1）
其中，Io 表示照射在样品上的入射光强度，I 表示穿过样品并到达探测器的透射光强度。Io 通常通过测量参照物获得，该参照物一般为待测溶质的溶剂，并使用与测量 I 相同的采集参数。吸收光谱法可提供定量的吸收特性，其原理遵循比尔-朗伯定律（公式 2），但该定律不适用于存在光学散射的样品。该公式表明，光学吸收由样品在波长 λ 处的摩尔吸光系数（ε，单位为 L·mol−1·cm−1）、其摩尔浓度（C，单位为 mol∙L-1）以及光程长度（L，单位为 cm）共同决定，其中光程长度定义为光在样品中传播的距离15：
A(λ) = ε(λ)*L*C&#160; &#160; &#160;（2）
重要的是，摩尔吸光系数对每种生物吸收物质都是独特的，表明样品在特定波长下吸收光的强弱程度16。
在进行从可见光（VIS）到短波红外（SWIR）范围的吸收光谱测量时，除了标准的可见-近红外（VIS-NIR）光谱外，还需对硬件、样品制备和光谱后处理进行相应调整：
硬件 
可见光-近红外（VIS-NIR）测量通常使用对紫外-可见光（UV-VIS）光子敏感的硅探测器或光电倍增管（PMT），而短波红外（SWIR）吸收测量则需要对SWIR光子敏感的光电探测器，例如铟镓砷（InGaAs）探测器17。可见光、近红外和短波红外系统通常还需要波长特异性的色散元件，例如光学光栅，以在这些光学波段实现光的色散。此外，SWIR吸收测量需使用玻璃或石英比色皿，因其在SWIR区域的透射率高于塑料比色皿，更适合用于可见光至短波红外光谱分析。应选择发射光谱覆盖可见光至短波红外范围且宽广且相对均匀的光源，例如本实验方案中使用的钨卤素灯。调节入射光功率、曝光时间或光电探测器受光照射的持续时间，有助于优化吸光度测量。
样品制备 
样品的浓度或比色皿的光程会线性改变如上文公式（Eq2），因此，可以通过调整其中任意一个参数来实现高信噪比（SNR，此处定义为峰强度幅值与频谱去趋势化区域标准差的比值，通常SNR &#62; 30 被认为是高质量）在光谱的不同区域进行相对高或低吸光度的测量。为了优化水溶液中的短波红外（SWIR）测量，可使用重水（D₂O）2O），也称为重水或氘代水，可代替水（H2O），因为它在短波红外（SWIR）区域具有显著更低的吸收峰1这使得在短波红外区（SWIR）内可对溶质进行表征，而不会受到水的强吸收干扰。
光谱后处理 
由于可见光-短波红外（VIS-SWIR）光谱需要使用两个探测器——一个用于可见光-近红外（通常为硅基探测器或对紫外-可见光敏感的光电倍增管），另一个用于短波红外（通常为InGaAs）——因此必须将两个探测器获取的光谱拼接起来，以获得完整的VIS-SWIR光谱，这是后处理的必要原因。当光谱跨越VIS-SWIR范围时，不同波长区域的吸光度可能存在显著差异，某些区域可能需要稀释样品或缩短光程，以避免信号饱和。必须对光谱进行线性缩放，以校正样品浓度或光程变化带来的影响，然后将各部分光谱拼接，形成包含两个波长区域的单一光谱。
以下方案将详细介绍五种典型生物吸收体从可见光到短波红外波段的制备及光谱测量方法：水（约占体重的60%）、黑色素（皮肤色素的主要吸收体）、玉米油（作为人脂质的模拟物，因其批次间变异小、化学组成与人和动物脂质相近，且散射极小）、氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白（血液中的主要吸收体）。

<table><tbody><tr><td>0.22 &amp;micro;直径为 m 的注射器滤器</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLGPM33RS</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;micro;L 移液管</td><td>Millipore Sigma</td><td>EP3124000121</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L 移液管</td><td>Millipore Sigma</td><td>EP3124000083</td><td></td></tr><tr><td>锥形管</td><td>Avantor VWR</td><td>21008-089</td><td></td></tr><tr><td>玉米油</td><td>快乐腹部</td><td>n/a</td><td>48 盎司</td></tr><tr><td>重水</td><td>剑桥同位素实验室</td><td>DLM-4-100</td><td></td></tr><tr><td>重水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7789-20-0</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879-1L</td><td></td></tr><tr><td>一次性1 mL注射器</td><td>BH Supplies</td><td>BH1LL</td><td></td></tr><tr><td>一次性针头</td><td>Atshuhut/Amazon</td><td>66941</td><td></td></tr><tr><td>-80℃冰箱 &amp;deg;C)</td><td>Fisher Scientific</td><td>IUE386FARK</td><td></td></tr><tr><td>玻璃烧杯</td><td>默克生命科学</td><td>CLS1000PACK</td><td></td></tr><tr><td>玻璃或石英比色皿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z802875-1EA</td><td>700 &amp;micro;L 体积</td></tr><tr><td>玻璃或石英比色皿</td><td>Thorlabs</td><td>CV10Q35EP</td><td>3500 mL 体积</td></tr><tr><td>肝素化人血</td><td>Lampire</td><td>7203710</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Costar</td><td>3213</td><td></td></tr><tr><td>微型离心机——accuSpin Micro 17</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-675</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ 水</td><td>Millipore Sigma</td><td>ZMQSP0D01</td><td></td></tr><tr><td>欧司朗 FCS 64640 150 W 24 V HLX 卤素灯泡</td><td>亚马逊</td><td>B0001221DG</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Millipore Sigma</td><td>HS234526B</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>Eppendorf</td><td>22492055</td><td></td></tr><tr><td>粉末状合成黑色素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8049-97-6</td><td></td></tr><tr><td>比例尺</td><td>赛多利斯</td><td>UX-11976-09</td><td></td></tr><tr><td>连二亚硫酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1065070500</td><td></td></tr><tr><td>超声波破碎仪</td><td>Fisher Scientific</td><td>CPX1800</td><td></td></tr><tr><td>刮勺&amp;nbsp;</td><td>Aozita</td><td>000 00 0 1 2 3</td><td></td></tr><tr><td>紫外/可见/短波红外分光光度计</td><td>在线仪器系统</td><td>Olis Cary 14</td><td></td></tr><tr><td>称量纸</td><td>亚马逊</td><td>&amp;nbsp;B07M5RMNPF</td><td></td></tr></tbody></table>

可见光至短波红外波段生物吸收光谱的表征

Characterization of Biological Absorption Spectra Spanning the Visible to the Short-Wave Infrared

对于基于光的无创生理监测，可通过吸收光谱法识别各个组织成分的最佳波长。然而，由于硬件在较长波长范围内的灵敏度不足，吸收光谱法通常仅应用于可见光（VIS）和近红外（NIR）范围（400 至 1,000 nm）的波长。短波红外（SWIR）范围内的硬件技术进步使研究人员得以探索约 1,000 nm 至 3,000 nm 波长范围，该范围内包含了脂质、蛋白质和水的特征吸收峰。这些分子在可见光-近红外范围内难以成像，而在短波红外范围内则可提供无需标记的生物对比信息。此外，作为皮肤色素沉着主要发色团的黑色素，在短波红外范围内的吸收较低。已发现，诸如临床标准脉搏血氧仪等体内&#160;光学设备在深色素皮肤人群中准确性降低，可能是因为黑色素在可见光范围内的吸收较强。因此，采用工作在短波红外范围的设备可减少与皮肤色素沉着相关的误差。从可见光到短波红外范围，对核心组织成分吸收特性的理解有助于光学仪器的设计。本文介绍了获取常见组织吸收体（包括氧合血红蛋白、脱氧血红蛋白、黑色素、水和脂质）的可见光-短波红外吸收光谱的实验方案与仪器方法。

数据可通过华盛顿大学圣路易斯分校数字研究资料存储库（DRMR）获取，doi: <a href="https://doi.org/10.7936/6RXS-108249">https://doi.org/10.7936/6RXS-108249</a>
水的光谱表征 
水是最常见的生物吸收物质之一，在近红外（NIR）和短波红外（SWIR）区域具有特征性强吸收峰。这些特征吸收峰非常显著，以至于在测量水的吸光度时，通常需要用氘代水进行稀释，以避免信号饱和。图3展示了水与氘代水之间吸光度的差异，显示水的吸光度比氘代水高出一个数量级以上。SWIR波段中水的强吸收特性也使得获取含有水的样品中其他生物吸收物质的吸收光谱变得困难，尤其是那些以水为溶剂或参比的体系。为解决这一问题，可使用氘代水替代普通水。氘代水在化学行为上与水相似，但在SWIR波段的吸收弱得多，因此是SWIR光谱测量中替代水的理想选择。
为测量水的吸收光谱，采用水作为样品，重水作为参比。为防止短波红外区（SWIR）信号饱和，在SWIR区域将样品用水稀释。所得水的吸收光谱显示在可见光区（VIS）吸收较低，并随波长增加而升高。在约750 nm、970 nm、1,200 nm和1,450 nm处可观察到特征吸收峰（图4）。所得水光谱的信噪比（SNR）为3536.6，并与Hale和Querry的水吸收光谱20进行了比较，在约500 nm至1,600 nm范围内显示出相似的吸收曲线。然而，在400至500 nm范围内，两条吸收曲线存在差异，Hale和Querry的数据在较短波长处显示出更高的吸光度值。该差异可能是由于水中残留的微小颗粒在较短波长下的散射较强所致3，这可能违背了基于比尔-朗伯定律的吸收测量中无散射假设的适用条件。
黑色素的光谱表征 
黑色素是皮肤的主要光学吸收物质，本研究采用粉末状黑色素作为样品，以DMSO为溶剂和参比进行光谱表征。所得光谱信噪比为172，并与Sarna等人21,22以及Crippa等人23报道的真黑色素数据进行了比较（图5）。真黑色素是决定皮肤颜色的主要色素，因此可提供黑色素对光学器件影响的最准确数据。采用本文所述方案采集的光谱与文献值具有高度相关性。
玉米油的光谱表征 
为研究脂质的吸收光谱，选择玉米油作为样品，因其与其他脂质相比具有较低的光学散射特性，并且其化学组成与动物脂肪具有已知的相似性1。测定玉米油吸收光谱时，以玉米油为样品，空气为参比。如图6所示，玉米油光谱在约930 nm、1,210 nm和1,410 nm处呈现出特征吸收峰。所得玉米油光谱信噪比（SNR）为10363.1，并与Cao等人的玉米油光谱数据1进行叠加比对，显示出高度相关性。
氧合与脱氧血红蛋白的光谱表征 
尽管对氧合与脱氧血红蛋白吸收特性的表征是生物医学光学领域最重要的成就之一，但其在可见光（VIS）至短波红外（SWIR）波段的吸收光谱仍缺乏充分理解。在SWIR波段测定氧合与脱氧血红蛋白吸收光谱最具挑战性的方面之一，是去除血液中的水，因为水的吸收远强于相对较弱的血红蛋白吸收。为了分离血红蛋白与水的吸光度，首先通过离心法从人全血中分离血红蛋白，弃去上清液，并用重水（D₂O）替代。重水也被用作参考物质以及血红蛋白再溶解的溶剂，以诱导低渗破裂。如图3所示，重水的光学吸收远低于普通水，使其成为SWIR波段吸收测量的理想溶剂和参考介质。所得氧合血红蛋白光谱覆盖可见光至短波红外波段，信噪比（SNR）达23118.7，与Prahl发表的氧合血红蛋白光谱高度吻合4 （图7）。在可见光波段，氧合血红蛋白光谱表现出较强的吸收，在约415 nm处有明显的吸收峰，并在约540至575 nm范围内出现双峰结构。在近红外（NIR）波段，氧合血红蛋白光谱呈现出一个较宽的特征吸收峰，覆盖约800 nm至1,100 nm波长范围。在短波红外（SWIR）波段，血红蛋白的吸收较弱；然而，在约1,400 nm至1,600 nm范围内，血红蛋白光谱显示出较高的吸收并伴有吸收峰，这可能是由于在离心过程中未能完全去除血红蛋白中残留的水分所致。
对于脱氧血红蛋白，向血红蛋白溶液中加入连二亚硫酸钠，以促使氧合血红蛋白释放结合的氧气，从而将样品转化为脱氧血红蛋白。所得光谱的信噪比为9813.9，与Prahl报道的脱氧血红蛋白光谱在400 nm至1,000 nm范围内进行了比较，显示出极强的相关性4 （图8）。所得脱氧血红蛋白光谱在约430 nm、560 nm和760 nm处显示出特征性吸收峰。此后，脱氧血红蛋白的吸收逐渐下降，但在约1,200 nm以及1,400 nm至1,600 nm范围内存在较小的吸收峰。1,400 nm至1,600 nm范围内的吸收可能是由于在离心过程中未能完全去除血红蛋白样品中的水分所致。
可见光至短波红外波段生物吸收体的比较 
本方案中所表征的所有生物吸收体在全可见光至短波红外（VIS-SWIR）范围内的光谱如图9所示，光谱已根据其在组织中的生物学浓度进行归一化处理2，突显了不同生物吸收体之间的显著光谱差异。例如，黑色素、氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白在可见光波段具有强烈且特征性的吸收峰，其吸收强度通常随波长增加而降低；而水和脂质则在近红外（NIR）和短波红外（SWIR）波段表现出特征吸收峰。在生物组织中，黑色素和血红蛋白含量的降低以及光学散射的减弱共同导致近红外和短波红外波段的光穿透深度增加。此外，近红外和短波红外波段对黑色素的吸收较弱，使得在受皮肤色素沉着影响最小的情况下，能够对氧合血红蛋白、脱氧血红蛋白、脂质和水进行光学检测。
<img alt="生物发色团的吸收光谱图；黑色素、Hb、HbO2、脂质、水；波长。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67403/67403fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：常见生物吸收体在紫外至短波红外范围内的已发表光谱。氧合与脱氧血红蛋白光谱的数据来自Prahl4。黑色素光谱的数据来自Sarna21 和 Crippa23。脂质光谱的数据来自van Veen24。水光谱的数据来自Hale和Querry20。缩写：SWIR = 短波红外。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67403/67403fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="离心管中的血液样本，实验室分析，生物医学研究，医学诊断。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67403/67403fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：离心后全血的上清液与红细胞沉淀的照片。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67403/67403fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="水的吸收光谱；对数与线性图；氘代水与Milli-Q水；光谱分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67403/67403fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：在相同的采集设置下，水与氘代水的吸收光谱比较，分别以对数（左）和线性（右）吸收尺度显示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67403/67403fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Milli-Q 水的吸收光谱图；O'Brien 与 Hale 数据比较，波长（nm）" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67403/67403fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：采用本文所述方法测得的水吸收光谱与 Hale 和 Querry20 数据的比较。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67403/67403fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="黑色素吸收光谱图；比较了在400-1600 nm范围内OBrien法与Sarna法及Crippa法真黑色素的结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67403/67403fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5：使用本文所述方法测得的黑色素吸收光谱与Sarna等人21,22以及Crippa等人23方法的比较。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67403/67403fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="玉米油吸收光谱图；波长与吸光度；光学分析比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67403/67403fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：采用本文所述方法与Cao等1报道方法测得的玉米油吸收光谱比较。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67403/67403fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="氧合血红蛋白吸收光谱；图表；波长与吸收率；光谱分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67403/67403fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图7"> 
图7：采用本文所述方法测得的氧合血红蛋白吸收光谱与Prahl4数据的比较。1,400 至 1,600 nm 范围内的光谱特征可能归因于样品中残留的水。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67403/67403fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="脱氧血红蛋白吸收光谱，图表，波长与吸收率，OBrien 与 Prahl 对比。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67403/67403fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 8"> 
图 8：采用本文所述方法测得的脱氧血红蛋白吸收光谱与 Prahl4 数据的对比。1,400 至 1,600 nm 范围内的光谱特征可能归因于样品中残留的水分。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67403/67403fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="生物材料的吸光度光谱图；光学性质的数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67403/67403fig9v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图9"> 
图9：常见生物吸收体的可见-短波红外（VIS-SWIR）光谱。缩写：VIS-SWIR = 可见-短波红外。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67403/67403fig9v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

与可见光（VIS）和近红外（NIR）波长范围相比，生物样品在短波红外（SWIR）波段具有独特的光学特性。然而，记录纯SWIR吸收光谱对于生物分子而言具有挑战性，且鲜有开展。本文介绍了一种用于表征生物吸收体在可见光至短波红外（VIS-SWIR）范围内吸收光谱的方法。

对于非侵入式光学生理监测，可利用吸收光谱法识别各组织成分的最佳波长。

我们的实验室开发基于光的工具，为孕产妇健康应用提供诊断信息。我们经常使用光谱学技术，因为它能够无创地提供大量与健康相关的信息，例如监测血氧饱和度和血红蛋白浓度，这两项均为妊娠期间需要监测的重要生理参数。颗粒态水中的某些溶剂具有强吸收特性，可能会掩盖目标溶质的信号。此外，跨越可见光至短波红外（VIS-SWIR）区域的光谱在不同波长范围内的吸收值常存在显著差异，因此我们必须针对不同区域调整实验参数，以获得高信噪比的光谱。由于获取 VIS-SWIR 生物光谱存在困难，已发表的生物吸收光谱数据十分有限，我们旨在简化这一过程。此外，深入理解各生物组分特有的光谱特征，将有助于选择最优波长，从而最大限度地减少黑色素强吸收所引起的皮肤色素干扰。我们希望本实验方案能够帮助研究人员扩展当前生物吸收体的可见-短波红外（VIS-SWIR）光谱库。这些结果还强调了黑色素在不同波长下对光学器件的影响，可用于设计皮肤色素干扰最小化的系统，例如在短波红外（SWIR）波段的应用。为制备含氧血红蛋白样品，取1.8毫升肝素抗凝全人血，用移液器转移至微量离心管中。将离心管在9.6g条件下离心10分钟，弃去约850微升上清液，注意不要扰动沉淀。用约850微升氘代水重悬沉淀，再次在9.6g条件下离心10分钟。最后一次离心后，为裂解红细胞，用4.5毫升氘代水重悬红细胞沉淀。如果沉淀物附着在管壁上，可用部分氘代水冲洗以使其松动。使用钝头针头和注射器，将裂解后的血液溶液从管中移出。然后将钝头针头从注射器上取下，并将其丢弃于生物危害锐器容器中。接下来，将一个0.22微米的注射器滤器连接到注射器上，并将溶液过滤至光程为10毫米、体积为3.5毫升的玻璃或石英比色皿中。用气密性塞子密封比色皿，以防止污染。再用Parafilm封口膜包裹塞子，确保完全密封。通过使用与样品相同光程、长度和体积的洁净比色皿，并装入重水，来制备用于基线和参考测量的对照样品。为制备脱氧血红蛋白样品，向比色皿中的血液溶液加入连二亚硫酸钠。用气密性塞子密封比色皿，并在塞子周围包裹Parafilm膜，以确保密封性。轻轻左右倾斜比色皿，直至连二亚硫酸钠完全溶解。观察血液溶液颜色由红色变为更深的紫红色。首先，打开光谱仪的光源和检测器，让系统预热 5 至 20 分钟。使用Kimwipe纸巾蘸乙醇清洗比色皿。对于双光束分光光度计，将装有重水的比色皿作为参比溶液分别放入样品室和参比室中。根据待测光谱区域选择合适的波长范围和检测器。使用默认参数获取参考测量值。然后，将样品室中的比色皿替换为含有氧合血红蛋白的比色皿。切换至实时模式，以便在调整测量参数时连续观察吸光度。从默认的光谱仪参数开始，调整每次测量的读取次数和带宽，以获得一条无饱和现象且质量良好的吸收光谱。如果调整入射光功率、带宽、曝光时间以及每次测量的读取次数仍无法获得高信噪比的光谱，则应改变样品浓度，或将参比比色皿置于样品室或参比室中，或调整样品和参比的光程长度，以获得高信噪比的光谱。一旦确定了适合样品的最优参数设置，应记录下每一条所获取光谱对应的仪器设置。使用优化后的设置，将参比溶液分别放入参比室和样品室，重新测量以获得优化的参比测量值。接着，将样品室中的参比比色皿替换为含氧合血红蛋白样品的比色皿，进行优化的样品测量。分别保存参比和样品的测量结果。使用以下公式，将参考测量值视为 I₀，样品测量值视为 I，计算吸光度 A。进行后处理时，打开 MATLAB 等数据分析软件，载入从光谱不同区域获取的吸光度测量数据。对某一光谱区域应用乘法因子，以拼接因样品浓度或光程长度不同而获得的各个光谱区域。氧合血红蛋白光谱与 Prahl 发表的光谱表现出高度一致性，在可见光区于 415 纳米处有明显的吸收峰，并在 540 至 575 纳米范围内呈现双峰结构，同时在近红外区 800 至 1,100 纳米之间具有宽吸收特征。在短波红外区域，氧合血红蛋白光谱显示出较低的吸收，可能是由于残留的水分含量所致。脱氧血红蛋白光谱与Prahl的光谱表现出强相关性，在430纳米、560纳米和760纳米处有明显的峰，在约1,200纳米以及1,400至1,600纳米之间有较小的峰。

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