Name: 糖组学引导的糖蛋白质组学有助于在复杂的肿瘤微环境中全面分析糖蛋白质组 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 学习糖组学引导的糖蛋白质组学方法，用于在复杂肿瘤微环境中全面分析糖蛋白质组。该技术结合质谱分析，帮助研究人员深入理解癌症糖生物学并发现潜在诊断标志物。

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THC 获得了由澳大利亚政府资助的国际研究培训项目奖学金的支持。NB 获得了由麦考瑞大学资助的国际麦考瑞大学研究卓越奖学金的支持。AC 获得了由澳大利亚政府资助的研究培训项目奖学金的支持。RK 获得了新南威尔士州癌症研究所（ECF181259）的支持。MTA 是澳大利亚研究理事会未来奖学金（FT210100455）的获得者。

Profiling of Colorectal Cancer Tissues Using Glycomics-Guided Glycoproteomics

作者声明无利益冲突。

方案中的关键步骤 
在本方案论文中，我们逐步阐述了糖组学指导的糖蛋白质组学方法，该方法可全面揭示复杂肿瘤微环境中糖蛋白质组的异质性与动态变化。
该方案中的一个关键步骤是确保蛋白质混合物完全消化，同时避免过度消化。蛋白质的非特异性切割会固有地增加肽段搜索空间，导致更长的搜索时间以及更高的糖肽错误鉴定率50。
在样品制备步骤中避免引入其他修饰（例如烷基化副反应）也至关重要，因为非预期的衍生化会使数据分析更加复杂（并减慢分析速度），从而再次导致更高的错误鉴定率15。来自福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织的蛋白质可能携带由组织制备（石蜡包埋）和蛋白质提取过程（脱蜡等）所诱导的异常肽段修饰44。然而，如本文及此前其他针对FFPE组织切片的糖蛋白质组学研究42,<sup class=...

蛋白质糖基化是一种广泛存在且复杂的共翻译和翻译后修饰类型，存在于生命系统发育树各个物种所产生的蛋白质中1,2,3。已知与蛋白质连接的糖类分子在人类健康相关的多种生物学过程中发挥重要作用，包括介导和调控细胞间的相互作用与通信事件4,5。异常的蛋白质糖基化被认为可导致恶性转化、肿瘤进展及扩散6,7,8。这表明糖类分子参与了肿瘤微环境（TME）中的关键致瘤过程，并为基于糖类的生物标志物发现和治疗应用提供了巨大且尚未充分开发的潜力。因此，糖生物学在癌症研究及生命科学领域正受到越来越多的关注9。
在过去十年中，糖组学分析和信息学领域的关键进展10,11,12,13,14,15,16,17推动了液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）驱动的糖组学和糖蛋白质组学的发展，使其成为对来自复杂糖蛋白混合物的游离糖链和完整糖肽进行全系统分析的有力工具，这些糖蛋白可直接从多种癌症患者样本（如肿瘤组织、细胞群体、体液）等生物样本来源中提取3,13,18,19,20。
糖组学提供有关聚糖库（即糖组）的结构和数量信息，这些聚糖由细胞、组织乃至整个生物体动态产生。另一方面，糖蛋白组学则提供关于蛋白质载体及其糖基化位点的定量信息，包括位点占据率（宏观异质性）、特定位点的聚糖组成及其在位点上的分布模式（微观异质性），但聚糖结构信息较为有限（通常仅限于聚糖组成）15,16,21。因此，糖组学与糖蛋白组学是研究糖蛋白组生化特征的互补性方法22。
针对不同的糖分析物（例如，N-、O-、C-连接的糖链/糖肽/糖蛋白，标记或未标记的样品）、样品性质（例如，细胞、组织、体液）、样品量（纳克/微克/毫克级蛋白含量）以及可用的分析仪器，各实验室已开发并应用了多种糖组学和糖蛋白组学的方法设计与分析策略23,24,25,26,27,28,29,30,31,32。尽管联合使用糖组学与糖蛋白组学已被公认具有诸多优势，但由于对分析技术专长和专用仪器的高要求，这两类方法在糖生物学和癌症研究中通常被作为独立的方法单独应用，而非联合使用&#160;。
认识到这一技术差距，十多年前，我们引入了糖组学辅助的糖蛋白质组学方法，该方法能够整合从复杂生物样本中获得的糖组学和糖蛋白质组学数据33。简而言之，这种糖组学辅助（或如本方案中所述的糖组学引导）糖蛋白质组学技术通过已建立的多孔石墨化碳（PGC）LC-MS/MS方法对N-和/或O-聚糖进行分析34,35，然后利用这些聚糖信息，通过定义聚糖搜索空间的边界，来分析来自同一样本（或样本集）的完整N-和/或O-糖肽数据36。PGC-LC-MS/MS是一种特别强大的糖组学方法，因其具有高灵敏度和结构分辨能力，可对糖组进行定量分析，即使在复杂混合物中也能提供有关聚糖拓扑结构（单糖序列和分支模式）以及糖苷键连接方式的信息35,37,38。糖蛋白质组学工作流程包括肽段生成、可选的肽段标记、多重化和预分级，以及在反相LC-MS/MS分析前的富集步骤；理想情况下，该分析应采用不同的碎裂方法，包括阶梯式碰撞能量/高能碰撞解离（sceHCD，用于N-糖肽）和电子转移/高能碰撞解离（EThcD，用于O-糖肽），以实现分析物的鉴定。对于N-糖蛋白质组分析，平行进行的去N-糖基化蛋白质组分析可通过定义蛋白质/肽段搜索空间，并提供有关被占据的N-糖基化位点及其位点占据率的更详细信息，从而指导完整N-糖肽数据的分析；同时，对非修饰肽段的平行分析可揭示研究条件下蛋白质水平的变化。
本文提供了一种详细且易于遵循的糖组学指导下的糖蛋白质组学方法的分步实验方案（实验流程概览见图1）。该方案涵盖了样品制备步骤以及基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的糖组学和糖蛋白质组学实验的具体操作细节，并展示了该方法应用于结直肠癌（CRC）患者肿瘤切除组织的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）切片的代表性结果，从而能够在全球癌症生物样本库中广泛存档的一种宝贵样本类型中深入解析肿瘤微环境（TME）的糖生物学特性。文中也简要讨论了糖组学与糖蛋白质组学数据的分析与整合方法。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67405/67405fig01v2.jpg" /> 
图1：&#160;糖组学引导的糖蛋白质组学方法概览。该图展示了糖组学（左侧）和糖蛋白质组学（右侧）工作流程中的详细实验步骤，以及所获得信息的概要（加粗显示），并说明了如何通过改进的数据分析与解释将两种方法整合。插图：自制固相萃取（SPE）微柱，用于（i）糖组学和（ii–iii）糖蛋白质组学工作流程。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67405/67405fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;化学试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙酸铵&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1542</td><td>可使用替代品</td></tr><tr><td>碳酸氢铵，纯度 &amp;ge;99.0%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6141</td><td>可使用替代品</td></tr><tr><td>无水乙腈（ACN），LC-MS级</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34851</td><td>可使用替代品</td></tr><tr><td>牛胎球蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3004</td><td>可使用替代品</td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0632</td><td>可使用替代品</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td>可使用替代品</td></tr><tr><td>甲酸，LC-MS级</td><td>Sigma Aldrich</td><td>00940</td><td>可使用替代品</td></tr><tr><td>冰乙酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6283</td><td>可使用替代品</td></tr><tr><td>碘乙酰胺（IAA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1149</td><td>可使用替代品</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1775</td><td>可使用替代品</td></tr><tr><td>肽-N-糖苷酶F（PNGase F）</td><td>Promega</td><td>V4831</td><td>源自中国台湾伊丽莎白金菌（Elizabethkingia miricola）的PNGase F（10 U/&amp;mu;L），在大肠杆菌（Escherichia coli）中重组表达&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>聚乙烯吡咯烷酮40（PVP）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PVP40</td><td>可使用替代品</td></tr><tr><td>氢氧化钾（KOH）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>484016</td><td>可使用替代品</td></tr><tr><td>测序级猪胰蛋白酶&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>V5113</td><td>可使用替代品</td></tr><tr><td>硼氢化钠（NaBH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>213462</td><td>可使用替代品</td></tr><tr><td>三乙基碳酸氢铵（TEAB），LC-MS级</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7408</td><td>可使用替代品</td></tr><tr><td>三氟乙酸（TFA），LC-MS级</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6508</td><td>可使用替代品</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;工具/材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C18圆盘</td><td>Empore</td><td>66883-U</td><td></td></tr><tr><td>C8圆盘</td><td>Empore</td><td>66882-U</td><td></td></tr><tr><td>平底聚丙烯96孔板&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>3364</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-PSQ聚偏二氟乙烯（PVDF）膜</td><td>Millipore</td><td>IPVH20200</td><td>孔径：0.45 &amp;mu;m&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5452000069</td><td>可使用替代品</td></tr><tr><td>微量离心机适配器&amp;nbsp;</td><td>The Nest Group, Inc., MA</td><td>SS18V</td><td>MiniSpin柱套环，随微柱一同提供</td></tr><tr><td>Oligo R3树脂</td><td>Thermo</td><td>1133903</td><td>粒径：30 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>Parafilm封口膜</td><td>Parafilm M</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL蛋白LoBind离心管</td><td>Eppendorf</td><td>0030108450</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL蛋白LoBind离心管</td><td>Eppendorf</td><td>0030108442</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL防漏离心管</td><td>Eppendorf</td><td>0030120086</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL防漏离心管</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>振荡器</td><td>Eppendorf</td><td>5382000066</td><td>可使用替代品</td></tr><tr><td>单孔打孔器</td><td>Swingline</td><td>74005</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac浓缩仪</td><td>Martin Christ</td><td>RVC 2-25 CDplus</td><td>可使用替代品</td></tr><tr><td>Supelclean ENVI-Carb SPE树脂</td><td>Supelco</td><td>57088</td><td>粒径：120-400目。树脂可手动从柱中取出，并可长期保存于含50%（v/v）甲醇的MilliQ水中</td></tr><tr><td>5 mL注射器</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z116866</td><td>可使用替代品</td></tr><tr><td>温控培养箱</td><td>Thermoline</td><td>E7.30</td><td>可使用替代品</td></tr><tr><td>超声波清洗仪</td><td>Unisonics</td><td>FXP</td><td>可使用替代品</td></tr><tr><td>ZIC-HILIC树脂</td><td>Merck</td><td>150455</td><td>粒径/孔径：5 &amp;mu;m/200 &amp;Aring;。树脂可手动从液相色谱柱中取出，并可长期保存于含50%（v/v）甲醇的MilliQ水中</td></tr><tr><td>ZipTip C18固相萃取（SPE）微柱&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td>也可使用自制C18-SPE微柱替代商品化产品</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;LC-MS/MS分析&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1260 Infinity毛细管HPLC系统&amp;nbsp;</td><td>Agilent</td><td></td><td>可使用替代品</td></tr><tr><td>预装ReproSil-Pur C18 AQ树脂的分析型液相色谱柱</td><td>Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Germany</td><td>r13.aq.s2570</td><td>粒径/孔径：3 &amp;mu;m/120 &amp;Aring;，长度/内径：25 cm/75 &amp;mu;m。商业化的C18纳米液相色谱柱也可获得/&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dionex UltiMate 3000 RSLCnano液相色谱系统&amp;nbsp;</td><td>Thermo</td><td></td><td>可使用替代品</td></tr><tr><td>HyperCarb KAPPA PGC毛细管液相色谱柱&amp;nbsp;</td><td>Thermo</td><td>已停产</td><td>粒径/孔径：3 &amp;mu;m/250 &amp;Aring;；柱长：30 mm；内径：0.180 mm。具有相似数据质量的更大规格HyperCarb PGC液相色谱柱可商业化获得（例如Thermo #35003-031030）。默克（Merck）的SupelTMCarb液相色谱柱，粒径/孔径为2.7 &amp;mu;m/200，具有不同柱长和内径，也可获得（例如Merck #59994-U）。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LCMS级乙腈</td><td>LiChrosolv</td><td>100029</td><td>可使用替代品</td></tr><tr><td>线性离子阱（LTQ）Velos Pro离子阱质谱仪（糖组学）&amp;nbsp;</td><td>Thermo</td><td></td><td>可使用替代品</td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid质谱仪（糖蛋白质组学）</td><td>Thermo</td><td></td><td>其他高分辨质谱系统，无论是否具备电子转移解离（ETD）功能（仅O-糖蛋白质组学需要）均可使用（例如Q-Exactive HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap，Thermo；TIMS-ToF-MS，Bruker；或其他厂商的类似高性能质谱仪）</td></tr><tr><td>0.9 mL全回收透明玻璃螺口小瓶</td><td>Thermo</td><td>THC11093563</td><td>可使用替代品</td></tr><tr><td>与上述小瓶匹配的全回收透明玻璃螺口盖</td><td>Thermo</td><td>THC09150869</td><td>可使用替代品</td></tr><tr><td>自制填充ReproSil-Pur C18 AQ树脂的捕集液相色谱柱&amp;nbsp;</td><td>Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Germany</td><td>r15.aq.s0202</td><td>粒径/孔径：5 &amp;mu;m/120 &amp;Aring;，长度/内径：2 cm/100 &amp;mu;m。商业化的C18捕集液相色谱柱也可获得。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Byonic</td><td>Protein Metrics Inc</td><td>v2.6.46或更高版本</td><td>商业化的糖肽和翻译后修饰搜索引擎，可接受大多数质谱仪厂商的LC-MS/MS原始数据</td></tr><tr><td>Byos</td><td>Protein Metrics Inc</td><td>v3.9-7或更高版本</td><td>商业软件，用于手动检查糖肽候选物及自动注释糖链MS/MS谱图</td></tr><tr><td>GlycoMod</td><td>Expasy</td><td></td><td>开放获取软件，辅助糖组学数据的注释（https://web.expasy.org/glycomod/）</td></tr><tr><td>GlycoWorkBench</td><td>EUROCarbDB</td><td>v2.1</td><td>开放获取软件，辅助糖组学数据注释及糖链结构图绘制</td></tr><tr><td>RawMeat</td><td>VAST Scientific</td><td>v2.1</td><td>开放获取软件，用于从原始质谱数据中提取糖链前体离子的m/z值</td></tr><tr><td>Skyline</td><td>Brendan X. MacLean</td><td>v21.2或更高版本</td><td>开放获取软件，用于糖链的相对定量分析</td></tr><tr><td>Xcalibur</td><td>Thermo</td><td>v2.2或更高版本</td><td>用于浏览原始LC-MS/MS数据</td></tr></tbody></table>

糖组学指导的糖蛋白质组学促进复杂肿瘤微环境中糖蛋白质组的全面分析

Glycomics-Guided Glycoproteomics Facilitates Comprehensive Profiling of the Glycoproteome in Complex Tumor Microenvironments

糖基化是一种常见且结构多样的蛋白质修饰，影响着多种肿瘤发生过程。基于质谱的糖组学和糖蛋白组学已成为分析游离糖链和完整糖肽的有力方法，分别有助于更深入地理解肿瘤微环境（TME）中异质性糖蛋白组的特征。本实验方案详细介绍了糖组学引导的糖蛋白组学方法，这是一种整合型组学技术：首先采用多孔石墨化碳液相色谱-串联质谱（porous graphitized carbon-LC-MS/MS）为基础的糖组学方法，解析待研究的肿瘤组织、细胞群体或体液样本中糖链的结构及其定量分布。该步骤可实现不同患者组别、疾病阶段或条件之间的糖组学比较分析，识别糖基化改变；更重要的是，通过构建已知糖链结构的数据库，可显著提升同一样本后续糖蛋白组学分析的效率，减少数据搜索时间并降低糖蛋白误鉴定率。本方案重点阐述了N-糖蛋白组分析中糖组学引导糖蛋白组学方法的样本制备步骤，并讨论了数据采集与分析的关键环节。该方法可提供TME中糖蛋白的定量信息，包括其糖基化位点、位点占有率以及位点特异性的糖链结构。文中以结直肠癌患者福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织为例展示了代表性结果，表明该方法具有高灵敏度，并与生物样本库中常见的组织切片兼容。因此，糖组学引导的糖蛋白组学方法为深入解析复杂TME中糖蛋白组的异质性与动态变化提供了全面视角，生成了深入理解癌症糖生物学所必需的可靠生化数据。

本节提供了对一名处于 II 期的结直肠癌（CRC）患者福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片应用糖组学指导的糖蛋白质组学方法的代表性结果。
为获得足够的起始蛋白量以满足本实验方案的要求，根据已发表的方案42，将来自同一FFPE组织块的两个切片（z堆栈）的蛋白提取物合并，并采用TMT标记方法以提高糖蛋白质组学实验的灵敏度（见下文可选步骤）。
首先，基于 PGC-LC-MS/MS 的 FFPE 结直肠癌组织 N-糖组学数据分析共鉴定出 76 种 N-糖链异构体，涵盖 59 种糖链组成（图 2）。与先前对结直肠癌组织 N-糖组谱的研究结果一致43，其中复杂型/杂合型 N-糖链含量最高（约 70%），其次是高甘露糖型（约 20%）和低甘露糖型 N-糖链（约 10%）。
<p class="jove_content biglegend" fo:keep-together.w...

本方案详细介绍了糖组学指导的糖蛋白质组学方法，这是一种整合组学技术，可全面揭示复杂肿瘤微环境中异质性糖蛋白组的特征，有助于深入理解癌症的糖生物学。

糖基化是一种常见且结构多样的蛋白质修饰，影响着多种肿瘤发生过程。基于质谱的……

我们研究先天免疫系统及免疫相关疾病中的复杂碳水化合物（即聚糖），目前主要关注脓毒症和癌症。我们的工作涉及分析方法和系统糖生物学，包括糖组学和糖蛋白质组学方法，以对人类糖蛋白进行详细表征。过去几十年中，糖蛋白质组学取得了巨大进展，其发展不再受限于高质量质谱数据的缺乏。相反，挑战在于如何从光谱数据中解读并生成生物学知识。糖组学指导的糖蛋白质组学方法使糖科学研究人员能够深入而准确地了解糖蛋白组及其与人类健康指标之间的紧密关联。糖蛋白质组学能够独特地提供针对糖蛋白组的位点特异性信息。但糖肽的比率仍然较高。为解决这些可重复性问题，我们的糖组学与糖蛋白质组学方法通过在同一份样品中进行糖组学普查，界定糖链搜索空间的约束条件，从而实现精确的糖蛋白质组分析。最终，该方法能够更快、更准确地进行糖肽搜索。我们这种由糖组学指导的糖蛋白质组学方法，可全面绘制来自多种不同人源样本的糖蛋白质组异质性与动态变化图谱。因此，该方法可帮助我们更好地理解疾病进展过程，并有助于发现针对多种人类疾病的新型诊断生物标志物和治疗靶点。糖组学指导的糖蛋白质组学方法使我们能够解析人类糖蛋白质组的复杂性，进而提出新的生物学问题，例如糖链结构如何影响蛋白质功能、细胞间通讯或免疫应答。该方法也引发了关于在特定疾病中糖基化模式如何以及为何发生变化的科学问题。这些见解可能有助于发现复杂疾病中的新诊断标志物和个性化治疗方案。为了将目标蛋白固定在PVDF膜上，使用单孔打孔器，根据需要点样的样本数量裁剪膜。用甲醇润湿裁剪好的膜，然后将其转移至平底96孔板中。当膜接近干燥时，每点加入 2.5 µL 蛋白质样品。在 20 至 25 °C 下将膜空气干燥至少 3 小时，或更佳情况下过夜，注意避免污染。向含有点样膜的每个孔中加入 100 µL 1% PDP-40 甲醇溶液。在20至25摄氏度的PDP-40溶液中震荡培养板。五分钟后，弃去PDP-40溶液。随后，用100微升超纯水洗涤每个含有封闭蛋白点的孔，并震荡培养板五分钟。向每个孔中加入 15 µL PNGase F 溶液。为防止脱水，在周围空孔中加入水。用透明封板膜仔细密封，并在 37 °C 下孵育至少 8 小时。孵育后，将酶标板超声处理5分钟，以帮助附着在孔壁上的蒸发液滴聚集到孔底。将释放出的N-糖链样品转移至各自的1.5毫升微量离心管中。用20微升超纯水对每个样品孔清洗两次，抽吸后将所有残留样品合并至新的离心管中。接下来，加入10 µL pH为5的100毫摩尔每升乙酸铵溶液，在20至25°C条件下孵育样品1小时。使用真空浓缩系统将N-糖链样品干燥。为制备自制的多孔石墨化碳（PGC-C18）固相萃取（SPE）微柱，使用注射器将C18圆片塞入10 µL移液器吸头中并进行转移。用移液器将10微升悬浮于50%甲醇中的PGC树脂浆液加入C18 SPE微柱中。将微柱放入配有微量离心适配器的2毫升离心管中。离心管子，制备出柱床高度约为0.5厘米的PGC-C18 SPE微柱。接下来，向微柱中加入 50 µL 含 0.1% 三氟乙酸（TFA）的乙腈溶液，并在 2000 ×g 下离心 60 秒，以促进流动相通过微柱。类似地，使用 0.1% 的水相 TFA 溶液对微柱进行洗涤和活化，重复三次。将 N-糖链样品加载至各微柱中，上样体积最多可达 40 µL。每次加入后离心微柱，重复操作直至全部样品加入完毕。用20 µL超纯水洗涤每个微柱。将微柱转移至新的1.5 mL微量离心管中。为了洗脱N-糖链，向每个微柱中加入40微升含0.1%三氟乙酸的50%乙腈溶液。离心收集各次离心的洗脱液。在真空浓缩系统中将脱盐后的N-糖链干燥。使用适当的软件浏览生成的LC-MS/MS原始数据。通过评估窄的液相色谱峰宽、N-糖链异构体的有效分离、高质谱准确度、分辨率和信噪比，以及高效的CID MS/MS碎裂效率，确认数据质量良好。根据单一同位素前体离子质量、CID MS/MS碎裂图谱，以及相对和绝对的PGC-LC保留时间，手动鉴定样品中的N-糖链。对于相对N-糖链定量，生成一个转换列表，其中包含所有已鉴定N-糖链异构体的单一同位素前体离子质荷比。从所有N-糖链前体离子的提取离子色谱图中确定曲线下面积值。为制备ZIC-HILIC-C8-SPE微柱，使用注射器将C8圆盘塞入并转移至10微升移液器吸头中。将悬浮于甲醇中的ZIC-HILIC树脂浆液加入C8-SPE微柱中。将微柱置于含有微型离心适配器的2毫升离心管中，确保微柱位于管中央。离心以制备高度约为1厘米的C8-SPE HPLC微柱。向微柱中加入50 µL甲醇，以2000 ×g离心60秒，使流动相流经柱体。同样，用50 µL超纯水洗涤微柱三次，每次之后再用50 µL含1%三氟乙酸（TFA）的80%乙腈溶液洗涤。将用于N-糖肽富集的干燥肽混合物重悬于50 µL含1% TFA的80%乙腈溶液中，并充分混匀。将ZIC-HILIC-C8-SPE微柱放入配有微型离心适配器的新1.5毫升离心管中。将重悬的肽混合物加入每个微柱，于2000 G离心60秒。收集穿流组分，并将每份穿流组分重新上样至同一ZIC-HILIC-C8-SPE微柱中。随后，依次加入50微升25毫摩尔的碳酸氢铵和50微升50%乙腈，洗脱N-糖肽。将微柱转移至新的1.5毫升低吸附微量离心管中。为逐步洗脱保留的N-糖肽，向微柱中加入50微升0.1%的水相三氟乙酸，并在2000 × g离心60秒。随后依次加入50微升0.1%的三氟乙酸水溶液、50微升25毫摩尔碳酸氢铵溶液以及50微升50%乙腈进行N-糖肽的洗脱。使用真空浓缩系统收集、合并并干燥富集的N-糖肽以及未修饰肽段的穿流组分。N-糖组学数据分析在结直肠癌组织中鉴定出76种N-聚糖异构体，其中70%为复杂型/杂合型聚糖，20%为高甘露糖型，10%为少甘露糖型。所有N-糖链结构均通过质谱证据确认，并利用提取离子色谱图中曲线下面积值进行定量。

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癌症研究

糖组学引导的糖蛋白质组学有助于在复杂的肿瘤微环境中全面分析糖蛋白质组 

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聚糖节点分析：糖组学的自下而上方法

本文描述了一种用于制备心血管组织样本以进行质谱分析的方法，该方法能够实现：（1）分析细胞外基质（ECM）蛋白质组成；（2）鉴定糖基化位点；（3）对糖链形式进行组成表征。该方法经少量修改后，亦可应用于其他组织中细胞外基质的研究。...

细胞外基质的糖蛋白质组学：一种利用质谱进行完整糖肽分析的方法

唾液酸聚糖微阵列检测可用于评估人血清中的抗Neu5Gc抗体，因此有望成为一种用于癌症及其他慢性炎症介导的人类疾病的高通量诊断检测方法。...

利用唾液酸糖微阵列检测技术分析人血清中抗Neu5Gc IgG

本方案介绍了如何利用在线资源探索、比较和解读人类蛋白质糖组。...

用于研究聚糖介导的蛋白质相互作用的生物信息学资源

本方案详细介绍了在福尔马林固定石蜡包埋组织切片中进行多重 mRNA...

双模态分子图谱：整合多重mRNA检测与蛋白质成像质谱流式技术

本方案利用激光显微切割技术，成功从胶质瘤样本中制备出足量高质量的新生血管组织，用于肿瘤血管生成的定量蛋白质组学分析，克服了传统研究主要集中于血管生成因子的局限性，提供了胶质瘤血管生成的大规模蛋白质组学图谱。...

从人脑胶质瘤组织制备新生血管组织用于肿瘤血管生成的定量蛋白质组学分析

学习糖组学引导的糖蛋白质组学方法，用于在复杂肿瘤微环境中全面分析糖蛋白质组。该技术结合质谱分析，帮助研究人员深入理解癌症糖生物学并发现潜在诊断标志物。

糖组学指导的糖蛋白质组学促进复杂肿瘤微环境中糖蛋白质组的全面分析

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