Name: 基于定量 PCR 的测定法测量纤毛发生细胞模型中的 Sonic Hedgehog 信号传导 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 学习使用定量PCR测定法在纤毛发生细胞模型中评估Sonic Hedgehog信号传导。该方法通过RPE-1细胞检测初级纤毛功能障碍相关的遗传和表观遗传改变，具有高灵敏度和可重复性。

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本工作由印度政府生物技术部（DBT）授予SM的拉马林加斯瓦米研究员项目以及印度政府科学与工程研究委员会（SERB）向SM提供的研究资助（CRG/2020/004042）支持。PH的奖学金由印度政府大学拨款委员会（UGC）资助。作者诚挚感谢印度总统大学健康科学研究所RNABio实验室的Chandrama Mukherjee博士和Avik Mukherjee先生，分别提供了qPCR仪器的使用机会以及仪器操作培训。

1. 细胞培养
<ol>
	<li>将接近汇合的RPE1细胞T-25培养瓶以1:5的比例传代至新的含有5 mL添加10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素混合液（终浓度为100 U/mL青霉素G和100 µg/mL链霉素）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）的T-25细胞培养瓶中。该培养基称为完全培养基。将细胞在37 °C、5% CO2条件下培养。 
	注意：RPE1细胞是未转化细胞，常用于在细胞培养中研究中心粒体（PC）组装与去组装过程的分子调控机制。约80%的RPE1细胞在血清饥饿后可形成中心粒体，当重新加入血清后，中心粒体会再次解体16。</li>
	<li>将12 mm圆形玻璃盖玻片置于50 mL 1 N HCl中，在加盖的玻璃烧杯内于60 °C水浴或培养箱中孵育过夜，期间不进行振荡。</li>
	<li>次日，使用25 mL移液管将酸溶液吸出，并妥善弃置于化学危险品容器中。随后用100 mL蒸馏水清洗盖玻片3次，每次孵育15分钟并间歇振荡，之后吸出液体。</li>
	<li>依次用70%乙醇和95%乙醇重复洗涤步骤。在生物安全柜中将盖玻片逐一&#160;放置于实验室吸水纸上干燥。干燥后，用紫外光照射60分钟进行灭菌。</li>
</ol>
2. 细胞培养、血清饥饿处理及SAG处理
<ol>
	<li>使用预热的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液通过酶活性使T-25培养瓶中的细胞脱落，然后用预热的完全培养基重悬细胞。使用血细胞计数板对细胞悬液进行计数，以确定细胞密度。</li>
	<li>准备两个35 mm细胞培养皿，每个培养皿中放入两个无菌的12 mm盖玻片。将2 × 105个处于异步生长状态的RPE1细胞传代至含盖玻片的每个35 mm培养皿中，并在2 mL完全培养基中培养24小时。</li>
	<li>24小时后，移除RPE1细胞的培养基，用1 mL预热的DPBS缓冲液洗涤细胞一次。向每个培养皿中加入2 mL预热的DMEM培养基（含1%青霉素-链霉素但不含FBS的无血清培养基），并在37 °C、5% CO2条件下继续孵育24小时。</li>
	<li>24小时后，将培养基更换为含有SAG（终浓度为250 nM）或以DMSO作为对照溶剂的无血清培养基，再继续孵育24小时。细胞培养流程的示意图见图1A。</li>
</ol>
3. 细胞收集
<ol>
	<li>将盖玻片转移至24孔板中，每孔放置一张盖玻片。向每孔加入0.5 mL预冷的甲醇，并在-20 °C孵育10分钟，以固定盖玻片上的细胞。孵育后立即用洗涤缓冲液（含0.5 mM MgCl2和0.05% Triton-X 100的1×PBS）洗涤盖玻片3次，每次0.5 mL。</li>
	<li>弃去培养基，直接向每孔加入0.5 mL Trizol试剂，使其均匀分布，静置5分钟。用移液器吹打数次以形成均一溶液，并将裂解液收集至1.5 mL无核酸酶的微量离心管中。</li>
</ol>
4. 总RNA和cDNA的制备
<ol>
	<li>向每个含有裂解细胞的离心管中加入 0.1 mL 氯仿，混匀后在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 15 分钟。将含有 RNA 的水相转移至新的微量离心管中，室温孵育 2–3 分钟。</li>
	<li>向水相中加入 0.25 mL 异丙醇，混匀后室温孵育 10 分钟。在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 10 分钟。RNA 沉淀形成白色凝胶状沉淀。使用微量移液器小心吸除上清液。</li>
	<li>用 0.5 mL 新鲜稀释的 75% 乙醇重悬 RNA 沉淀。短暂涡旋振荡混匀样品，然后在 4 °C 下以 7500 × g 离心 5 分钟。使用微量移液器小心吸除上清液。</li>
	<li>将 RNA 沉淀在室温下空气干燥 10 分钟&#160;，然后溶于 25 µL 无核酸酶的水中。使用微量分光光度计在 260 nm 处测定吸光度，以确定总 RNA 的浓度。</li>
	<li>从两个样品中各取 1–3 µg 总 RNA，按照 cDNA 合成试剂盒的说明书操作制备 cDNA。将制备好的 cDNA 储存于 -20 °C。</li>
</ol>
5. 定量 PCR
<ol>
	<li>使用每个样本的1:5稀释cDNA，针对GLI1、PTCH1、HHIP、SMO和β-ACTIN（作为看家基因；表2）基因的引物&#160;组合，在含有合适DNA聚合酶、dNTPs和缓冲液的qPCR预混液中，于适合的多孔荧光敏感PCR板中设置qPCR反应（每个样本设三个复孔，表1）。</li>
	<li>用合适的封膜覆盖PCR板，将其放入合适的qPCR仪器中，并运行包含40个扩增循环及最终熔解曲线分析步骤的标准qPCR程序。包含熔解曲线分析的标准化40循环qPCR程序如图1B所示。</li>
	<li>qPCR程序完成后，检查每个扩增产物的熔解曲线是否在目标温度处呈现单一峰。 
	注：在扩增循环结束后，熔解曲线分析通过以每步0.5°C递增、每步持续5秒的方式，将各孔温度从65°C升至95°C，测定扩增产物的熔解温度。</li>
	<li>将扩增数据导出至电子表格，通过相对于每个样本中β-ACTIN基因的表达量进行归一化，计算各转录本的相对表达量（采用2−ΔΔCT&#160;法）。绘制图表，并使用非配对t检验计算各转录本相对表达变化的统计学显著性。</li>
</ol>
6. 使用荧光显微镜进行免疫染色与图像采集
<ol>
	<li>将固定在盖玻片上的细胞置于 200 µL 封闭缓冲液（含 2% BSA 和 0.1% TritonX-100 的 1× PBS）中，30 分钟。</li>
	<li>将细胞与一抗混合物（通常为针对 PC 轴丝的乙酰化 α-tubulin 的抗小鼠抗体，以及分别针对纤毛膜和中心粒的抗兔抗体）在封闭缓冲液中稀释后，在 4 °C 湿润环境中孵育过夜（最终稀释比例见材料表）。
	<ol>
		<li>通过在空的 1 mL 移液器吸头盒下半部分放置一张湿润的纸巾来制作一个湿润环境。在支架表面铺一条透明薄膜，并在膜上滴加一滴抗体溶液（每张盖玻片对应一滴，每滴 20–25 µL），将盖玻片细胞面朝下覆盖在液滴上，使细胞浸入溶液中，然后盖上吸头盒盖子。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>次日，将盖玻片翻转并放回 24 孔板中。用洗涤缓冲液清洗盖玻片，随后在 150 µL 二抗混合液中室温孵育 1 小时，二抗使用预标准化稀释比例（此处为绿色荧光染料标记的抗小鼠抗体和红色荧光染料标记的抗兔抗体，均用封闭缓冲液稀释），同时加入细胞核 DNA 染色试剂。孵育后用洗涤缓冲液清洗 3 次。</li>
	<li>在玻璃载玻片上滴加一滴含抗荧光淬灭剂的封片液（约 3–5 µL）。将盖玻片细胞面朝下置于封片液上，用干净的擦拭纸轻轻按压去除多余液体。沿盖玻片边缘涂抹透明指甲油以密封固定。</li>
	<li>将载玻片置于配备电动载物台和可进行数字成像的相机的显微镜上（见材料表）。使用 60× Plan Apo 油镜（数值孔径 1.4），在室温下获取血清饥饿处理的 RPE1 细胞图像，以观察由上述抗体标记的初级纤毛（PC）。</li>
	<li>使用数字显微成像软件，在相同 Z 轴位置和不同荧光染料的相同曝光时间下，分别采集不同样品盖玻片上的图像。统计至少 500 个细胞中含初级纤毛（PC）的细胞数量，以确定在血清饥饿 48 小时条件下细胞纤毛化的百分比。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

检测初级纤毛（PC）的功能是理解纤毛形成动态及其相关疾病或功能障碍的关键步骤。除了通过免疫荧光染色检测纤毛标志物或荧光蛋白标记的纤毛结构组分来评估纤毛形成外，PC功能通常通过检测经典SHH信号通路的激活来确定，具体方法是利用荧光显微镜观察Smo在组织和细胞中的纤毛转位27,31。本文所述的基于RT-qPCR的检测方法通过测量SAG刺激下PC介导的SHH信号通路变化，来评估纤毛功能是否正常。显然，这是本实验方案中最关键的步骤。已有类似方法用于检测细胞培养中SHH信号通路的转录水平，结果表明该通路在不同细胞类型中存在差异，并可在NIH3T3小鼠成纤维细胞和人RPE1细胞系中稳定检测；当这些细胞在无血清培养基中饥饿培养48小时后，含有初级纤毛的细胞比例最高27。本方法的目标是定量测定由PC介导的SHH通路激活，因此选用RPE1细胞。预计该检测方法在饥饿培养的NIH3T3小鼠细胞中也能良好适用。尽管这两种细胞均广泛用于纤毛生物学研究，但RPE1细胞在评估与多种纤毛病相关的人类基因突...

纤毛是一种基于微管且由膜包被的细胞表面突起结构，其在基体上组装形成1。在脊椎动物中，存在两种类型的纤毛，即运动性纤毛和非运动性纤毛。运动性纤毛位于特化组织中，赋予细胞运动能力。非运动性的初级纤毛（PC）存在于大多数脊椎动物细胞中，具有感觉功能，并将来自细胞外环境的关键信号传递至细胞内部2。纤毛一旦组装完成，其伸长过程依赖于纤毛内运输（IFT）系统，该系统是一种双向运输机制，由驱动蛋白（kinesins，负责顺向运输）和动力蛋白-II（dynein-II，负责逆向运输）驱动，携带货物进行运输3,4。运动性纤毛或初级纤毛在结构或功能上的缺陷可能导致多种累及多个系统的遗传性疾病，这类疾病统称为纤毛病（ciliopathies）5,6。
初级纤毛（PC）是多种发育信号通路的核心枢纽，例如Wingless（Wnt）信号、G蛋白偶联受体（GPCR）信号、受体酪氨酸激酶（RTKs）信号、转化生长因子β（TGFβ）信号以及血小板源性生长因子（PDGF）信号7,8。在哺乳动物中，Sonic Hedgehog（SHH）信号通路尤为关键，该信号几乎完全由含有初级纤毛（PC）的细胞通过PC进行转导9,10,11。PC结构或功能异常会导致相关信号通路减弱，进而引发多种疾病，如先天性心脏病、多囊肾病、颅面畸形、视网膜营养不良，以及一些罕见病，包括巴德-比德尔综合征（Bardet-Biedl Syndrome, BBS）、乔伯特综合征（Joubert Syndrome, JBTS）、阿尔斯特伦综合征（Alström Syndrome）和窒息性胸廓发育不良（Jeune Asphyxiating Thoracic Dysplasia, JATD）12,13,14,15。这些疾病大多为上皮或内皮组织的多基因遗传病，给早期诊断和治疗带来巨大挑战。通过细胞培养模型研究这些突变如何导致PC介导的信号通路减弱，不仅有助于揭示该信号通路的分子复杂性，还可能促进多种纤毛病变的诊断，并为治疗干预提供线索。基于此理念，本研究建立了一种基于定量PCR（qPCR）的检测方法，用于评估人端粒酶逆转录酶（hTERT）永生化的视网膜色素上皮细胞（hTERT-RPE1，以下简称RPE1）中PC介导的SHH信号通路的变化。RPE1细胞为接近二倍体、非转化的人类细胞，广泛用作纤毛形成的细胞模型，因为在血清饥饿（即将细胞置于无血清培养基中）24–48小时后，约有75%–80%的RPE1细胞可组装出初级纤毛，而在异步生长的RPE1细胞培养物中，仅有15%–18%的细胞具有纤毛16。
Hedgehog 信号通路（HH）在脊椎动物的胚胎发育过程中具有保守性17。在哺乳动物中，存在三种不同类型的 Hedgehog 信号通路：Sonic（SHH）、Indian（IHH）和 Desert（DHH），其中 SHH 和 IHH 在组织水平上具有功能重叠11。SHH 信号通路在胚胎发育过程中发挥关键作用，调控肢体的模式形成、神经系统中的细胞类型特化，并维持成体组织的稳态10,11,18。尽管 SHH 信号通路较为复杂，但越来越多的证据表明，经典的 SHH 信号通路依赖于 PC7,11,19，该过程由 Gli 转录因子家族（Gli1、Gli2 和 Gli3）的协同作用所介导。有研究提出，HH 信号通路与 PC 共同进化，其关键信号组分集中在纤毛顶端的狭小空间内，从而能够对低配体浓度产生有效响应11。
在没有SHH配体的情况下，定位于初级纤毛（PC）膜上的Patched1（Ptch1）通过一种尚不完全清楚的机制抑制Smoothened（Smo）的活性，该机制可能涉及脂质转运，从而保持信号通路处于抑制状态7,20。组成性活跃的纤毛G蛋白偶联受体GPR161是该系统的负调控因子，它通过维持纤毛内环磷酸腺苷（cAMP）的高水平来增强蛋白激酶A（PKA）的活性21，并促进PKA在纤毛内的定位7，从而确保通路持续被抑制。蛋白激酶A（PKA）与酪蛋白激酶1（CK1）以及糖原合酶激酶3β（GSK3β）共同作用，在初级纤毛内对Gli蛋白Gli2和Gli3的多个位点进行磷酸化。Gli2和Gli3均可作为靶基因转录的激活因子或抑制因子。PKA介导的磷酸化会抑制Gli2的激活功能，而磷酸化的Gli3则被蛋白酶切割，生成抑制性形式Gli3R22。总体而言，在这些条件下，SHH靶基因的表达受到抑制。
当存在SHH配体时，Ptch1会与其结合，GPR161离开纤毛，而Smo在G蛋白偶联受体（GPCR）激酶2（GPRK2）和CK1的磷酸化作用下，与β-arrestin及微管马达蛋白KIF3A一起被转运至纤毛23。这些事件协同促进Gli2/3、融合抑制因子（Supressor of Fused, SUFU）和Kif7在纤毛尖端的定位，从而减少Gli2/3的剪切，增强Gli2/3的激活功能24,25。一旦被激活，Gli2/3可诱导仅具有激活功能的Gli1表达，从而放大SHH信号通路的响应22。SHH与Ptch1的结合由与CAM相关/癌基因下调蛋白（CDO）、CDO同源蛋白（BOC）、生长停滞特异性蛋白1（GAS1）以及低密度脂蛋白受体相关蛋白2（LRP2）共同促进。相反，Hedgehog相互作用蛋白（HHIP）可通过直接与SHH结合将其隔离，并竞争性地阻止Ptch1与SHH相互作用26。重要的是，GLI1、HHIP和PTCH1在SHH通路激活后被转录，其中后两者参与SHH通路的负向调控。
既往研究表明，可通过检测SHH靶基因的转录水平来评估SHH通路活性，但其在不同细胞类型中可能存在显著差异27,28。SHH通路反应的这种差异可能归因于由原纤毛（PC）介导的SHH信号与由细胞膜介导的SHH信号（可能在缺乏PC的情况下）之间的不同组合。SAG是一种Smo激动剂，在本方法中用于模拟在主要具有纤毛的血清饥饿RPE1细胞中SHH信号的激活。通过qPCR检测对照组和SAG处理组细胞中SHH靶基因（如HHIP、GLI1和PTCH1）以及非靶基因SMO的转录水平，并进行比较以确定SHH通路的激活情况。成功建立这种基于细胞培养的高灵敏度检测方法用于测量PC介导的SHH信号，表明其在与原纤毛功能相关的生物医学研究中具有广阔的应用前景。

<table><tbody><tr><td>DMSO，无菌过滤</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>驴抗小鼠IgG（H+L）Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A21202</td><td></td></tr><tr><td>驴抗兔IgG（H+L）Alexa Fluor 568</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A10042</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>41965039</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Himedia</td><td>RM1112</td><td></td></tr><tr><td>配备60倍物镜的荧光显微镜</td><td>Carl Zeiss&amp;nbsp;</td><td></td><td>Axio observer colibri 5</td></tr><tr><td>hTERT-RPE1细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA合成试剂盒</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>小鼠单克隆抗乙酰化微管蛋白抗体</td><td>Milipore Sigma-Aldrich</td><td>T7451</td><td>最终稀释比例1:1000</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素，100倍浓缩液</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>定量PCR仪，CFX 96</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>兔多克隆Arl13B抗体</td><td>ProteinTech</td><td>17711-1-AP</td><td>最终稀释比例1:250</td></tr><tr><td>兔多克隆Cep135抗体</td><td>ProteinTech</td><td>24428-1-AP</td><td>最终稀释比例1:500</td></tr><tr><td>SlowFade Gold抗荧光淬灭封片剂</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S36940</td><td></td></tr><tr><td>平滑受体激动剂（SAG）&amp;nbsp;</td><td>Abmole</td><td>M4865</td><td>储存液：溶于DMSO，5 mM</td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1725271</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol试剂</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>12605028</td><td></td></tr></tbody></table>

基于定量 pcr 的细胞模型中音猬因子信号通路活性检测方法

Quantitative PCR-based Assay to Measure Sonic Hedgehog Signaling in Cellular Model of Ciliogenesis

纤毛病是指由于运动性或非运动性（初级）纤毛结构或功能异常而引起的一组多系统、多基因的人类疾病与障碍。初级纤毛（PC）存在于大多数人类上皮和内皮组织中，作为生理信号转导的中心，包括音猬因子（Sonic Hedgehog, SHH）信号通路。在多种研究情境下需要检测初级纤毛的功能，可通过测量几乎完全由初级纤毛介导的经典SHH信号通路来实现。本文建立了一种基于定量PCR（qPCR）的技术，用于检测处于静息状态且大多含有初级纤毛的hTERT-RPE1（或RPE1）细胞中SHH通路相关基因的转录水平。RPE1细胞的静息状态通过48小时的无血清培养诱导，而SHH通路的激活则通过特异性激动剂促进。该基于细胞培养的检测方法操作简便且灵敏度高。在具纤毛的RPE1细胞中成功实施该检测，表明其作为初级纤毛功能评估工具具有巨大潜力 体外 用于检测单个或多个基因发生遗传或表观遗传改变后，初级纤毛（PC）功能是否正常的实验方法，这些基因改变可能与多种纤毛病相关。

激活PC介导的SHH信号转导通路是理解PC7正常功能的一种方法。在此，通过RT-qPCR检测法测定在主要具有纤毛的RPE1细胞中，经SAG激活SHH通路后其靶基因的相对表达水平。SHH通路的直接转录输出基因GLI1和PTCH1常被用于评估该通路的活性11。本方案还包括受SHH通路调控的HHIP转录本。由于SMO并非SHH通路的直接靶基因，其转录水平在SHH通路激活后不应发生变化，因此被用作对照。β-ACTIN用于数据归一化，因其在血清饥饿处理的RPE1细胞中经SAG刺激后表达水平无变化（数据未显示）。
本实验中，RPE1细胞在无血清培养基中孵育48小时以诱导纤毛生成。在最后24小时，细胞分别用SAG或对照溶剂DMSO处理（图1A）。qPCR按照图1B所示程序进行。如图1C所示，与DMSO处理组相比，SAG处理组...

本研究展示了一种基于定量PCR的检测方法，利用SHH激动剂在纤毛发生细胞模型中检测初级纤毛介导的Sonic Hedgehog（SHH）信号通路的激活。

基于定量 PCR 的细胞模型中音猬因子信号通路活性检测方法

纤毛病是指由于纤毛结构或功能异常所引起的一组多系统、多基因的人类疾病和障碍。

我们开发了一种基于细胞培养的高灵敏度定量检测方法，可用于评估主要通过初级纤毛转导的音猬因子（Sonic Hedgehog）信号通路。该方法可用于研究与初级纤毛功能障碍相关的遗传和表观遗传改变。尽管初级纤毛在音猬因子信号传导中具有核心作用，但现有方法通常缺乏在遗传改变条件下评估初级纤毛功能所需的灵敏度。本方案通过提供一种基于细胞培养的检测方法，模拟纤毛细胞中音猬因子（Sonic Hedgehog）的激活及其靶基因的表达，填补了这一空白。与其他方法（例如音猬因子通路激活后平滑受体蛋白在初级纤毛中的定位）相比，本检测方法具有定量性、操作简便且灵敏度高，因其基于细胞培养体系。首先，从37 °C、5% CO₂的培养箱中取出含有接近汇合状态的RPE-1细胞的T25细胞培养瓶，细胞在其中使用5 mL完全培养基进行培养。弃去细胞培养瓶中的培养基，使用预热的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液通过酶活性使细胞脱落。用预热的完全培养基重悬细胞。使用血细胞计数板对细胞进行计数，以确定细胞悬液的细胞密度。将两个无菌的12毫米盖玻片放入两个35毫米的细胞培养皿中。在每个含有盖玻片的培养皿中接种2 × 10⁵个异步生长的RPE-1细胞。每个培养皿中加入2毫升完全培养基，培养细胞24小时。孵育后，移除正在生长的RPE-1细胞中的培养基，并用一毫升预热的DPBS缓冲液洗涤细胞一次。每皿加入两毫升含1%青霉素-链霉素但不含FBS的预热DMEM培养基。将细胞在37°C和5%二氧化碳条件下孵育24小时。第二天，将培养基更换为含有平滑肌激动剂的无血清培养基，终浓度为 250 纳摩尔。将细胞在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下继续孵育 24 小时。孵育结束后，将盖玻片转移至 24 孔板中，每孔放置一张盖玻片。向每个孔中加入 0.5 毫升预冷的甲醇以固定细胞。将培养板置于 -20 °C 下孵育 10 分钟。立即用 0.5 毫升洗涤缓冲液洗涤盖玻片三次。弃去培养皿中的培养基。向每个培养皿中直接加入 0.5 毫升 TRIzol 试剂，充分分布均匀，室温静置 5 分钟。上下吹打数次以形成均一混合物，并将其收集到1.5毫升无核酸酶的微量离心管中。向每根含有经平滑素激动剂和DMSO处理的TRIzol混合细胞的试管中加入0.1毫升氯仿。室温孵育2至3分钟后，在4°C、12,000g条件下离心。将含有RNA的水相转移至新的微量离心管中。向水相中加入 0.25 毫升异丙醇，将离心管孵育 10 分钟。在 4°C 条件下以 12,000g 离心 10 分钟。观察白色凝胶状 RNA 沉淀的形成。使用微量移液器小心弃去上清液。然后，将RNA沉淀重悬于0.5毫升新鲜稀释的75%乙醇中。短暂涡旋振荡管子以确保充分混匀。在4°C条件下，以7,500g离心样品5分钟。使用微量移液器小心弃去上清液。将RNA沉淀室温晾干10分钟。将沉淀重悬于25微升无核酸酶的水中。使用微量分光光度计在260纳米处测定总RNA浓度。根据cDNA合成试剂盒的制造商说明书，使用每个样品中1至3微克的总RNA合成cDNA。使用每个样本的1:5稀释cDNA，针对GLI1、PTCH1、HHIP、SMO和beta-actin基因的引物组，在多孔荧光敏感PCR板中加入qPCR预混液，每个样本设置三个复孔。用合适的封膜覆盖PCR板，将板放入qPCR仪中。运行标准化的qPCR程序，进行40个扩增循环，随后进行熔解曲线分析。运行结束后，检查每个扩增产物的熔解曲线，确认在目标温度处出现单一峰。将扩增数据导出至电子表格中。通过与β-actin表达量归一化，计算每种转录本的相对表达量，将相对表达数据绘制成图表，并使用非配对t检验计算表达变化的统计学显著性。大多数血清饥饿处理的细胞形成了初级纤毛，纤毛化率超过85%。在此条件下，与DMSO处理的细胞相比，平滑激动剂处理的细胞中GLI1、PTCH1和HHIP的表达水平显著升高，而SMO转录本水平无显著变化。

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科研

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Biology

生物学

基于定量 PCR 的测定法测量纤毛发生细胞模型中的 Sonic Hedgehog 信号传导

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改良的小鼠胚胎干细胞检测法用于量化心脏诱导效率

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毛发再生过程中上皮-间质信号传导的快速遗传学分析

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纤毛病小鼠突变体耳蜗中平面细胞极性表型的评估

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简约的力量：海胆胚胎作为 体内 用于研究复杂细胞间信号网络相互作用的发育模型

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基于细胞的荧光素酶报告基因检测平台中γ-分泌酶介导的淀粉样前体蛋白和Notch切割的定量测量

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一种用于研究调控体节发生信号振荡功能的微流控方法

我们提供了生成和表征基于人诱导性多能干细胞（hIPSC）的2D和3D新皮质发育模型的详细方案，以及用于定性和定量分析初级纤毛（PC）发生与功能的互补方法。...

基于人诱导性多能干细胞的二维和三维模型解析初级纤毛在新皮质发育中的作用

此处，我们展示一种可重复的 体外...

一种高效且经济的电穿孔方法用于研究颗粒细胞前体中依赖初级纤毛的信号通路

果蝇喙伸展反应（PER）实验

学习使用定量PCR测定法在纤毛发生细胞模型中评估Sonic Hedgehog信号传导。该方法通过RPE-1细胞检测初级纤毛功能障碍相关的遗传和表观遗传改变，具有高灵敏度和可重复性。

基于定量 PCR 的细胞模型中音猬因子信号通路活性检测方法

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