Name: 用于研究钙离子通道激活的单细胞钙成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-13T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: 学习使用Fura-2/AM染料进行单细胞钙成像技术，实时定量监测细胞内钙离子浓度变化。该方法适用于研究TRPV1通道激活机制及温度痛觉感受，为神经科学和细胞生物学研究提供快速可靠的技术手段。

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感谢清华大学的 Bailong Xiao 分享单细胞 Ca2+ 成像系统和温度控制操作系统，并对本项目提供的支持与协助。本研究由国家自然科学基金（32000705）、中华中医药学会青年精英科学家资助项目（CACM-(2021–QNRC2–B11)）、中央高校基本科研业务费专项资金（2020–JYB–XJSJJ–026）、（2024-JYB-KYPT-06）资助。

实验方法经清华大学和北京中医药大学动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并遵循其指导方针。本方案介绍了针对多种细胞类型的单细胞 Ca2+ 成像方法，包括从多只新生小鼠（出生后三天内，性别随机的同窝仔鼠，C57BL/6 小鼠）皮肤中分离的原代角质形成细胞。本研究中使用的试剂和设备详情列于材料表中。
1. 细胞准备
注意： 原代细胞、内源性靶基因的细胞系，或转染了过表达质粒的细胞均适用于单细胞 Ca2+ 成像。本研究中所用质粒由清华大学肖百龙教授实验室提供。这些质粒通过将绿色荧光蛋白 GFP 的序列与人源 STIM1、DsRed 荧光蛋白与人源 Orai1、mRuby 荧光蛋白与兔源 TRPV1，以及红色荧光蛋白 mCherry 分别插入噬菌体质粒载体而构建10。
<ol>
	<li>在24孔板中准备直径为8 mm的无菌玻璃载玻片。向每孔加入500 μL多聚-D-赖氨酸（PDL）缓冲液（50 μg/mL，溶于DPBS中）。</li>
	<li>将载玻片置于37 °C孵育1 h以完成包被，然后用移液器弃去包被液。</li>
	<li>用DPBS洗涤载玻片一次，并将其置于一旁备用。</li>
	<li>根据各自特定的培养方法分别培养原代细胞和细胞系10。</li>
	<li>将细胞以约1.5 × 105个细胞/孔的密度接种至已准备好的24孔板中。待细胞贴附于盖玻片后，用于Ca2+成像实验。</li>
	<li>对于过表达质粒的细胞，使用Lipofectamine 2000（或Lipofectamine 3000）转染试剂以1:1的比例转染目标质粒（1 μg/孔）10,15，并在细胞培养箱中孵育约24 h。 
	注意：对于较大的表达蛋白，可能需要更长的孵育时间。</li>
</ol>
2. Fura-2/AM 工作液的配制
<ol>
	<li>向含有 50 μg Fura-2/AM 粉末的离心管中加入 50 μL 二甲基亚砜（DMSO），充分混匀，配制浓度为 1 μg/μL 的 Fura-2/AM 储存液。</li>
	<li>将 Fura-2/AM 储存液与 Pluronic F-127 混合至含 1.3 mM Ca2+ 的 Hank's 缓冲液中。 
	注意： 工作液中 Fura-2/AM 和 Pluronic F-127 的终浓度为 2.5 μg/mL。Hank's 缓冲液通过向 1× HBSS 缓冲液中添加 10 mM HEPES 配制而成。</li>
	<li>使用铝箔包裹以避免 Fura-2/AM 工作液暴露于光照下。</li>
</ol>
3. 单细胞 Ca2+ 成像的细胞预处理
<ol>
	<li>将带有细胞的玻片转移至一个新的24孔板中，孔内预先加入Hank's缓冲液用于洗涤。</li>
	<li>用移液器弃去缓冲液，每孔加入500 μL Fura-2/AM工作缓冲液。</li>
	<li>室温避光孵育30分钟，使探针充分加载。</li>
	<li>移除Fura-2/AM工作缓冲液，用Hank's缓冲液洗涤细胞三次，以去除多余的Fura-2/AM。此时细胞已准备就绪，可供使用。</li>
</ol>
4. 启动 Ca2+ 成像系统
注意：本研究中使用荧光显微镜进行 Ca2+ 成像。
<ol>
	<li>依次启动以下组件：DG4光源（氙灯）、相机、白光光源、显微镜载物台控制器、显微镜、计算机以及荧光成像软件。 
	注意：若需检测温度对离子通道激活的影响，还需开启以下组件：灌流系统、加热系统、温度控制器以及液体循环加热/冷却装置。</li>
</ol>
5. 细胞内 Ca2+ 反应实验步骤
<ol>
	<li>打开荧光成像软件（参见材料表）。
	<ol>
		<li>选择实验方案，然后依次选择文件，再选择加载实验方案。选中所需的实验方案后点击确定。</li>
		<li>在菜单列表中配置实验。</li>
		<li>选择新建实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将灌流 chamber 安装到显微镜上。 
	注意：每次使用粗调焦旋钮安装或拆卸 chamber 时，务必先将物镜完全降下，以防止物镜受损。</li>
	<li>取出经 Fura-2/AM 处理的细胞载玻片，并将其放入含有 Hank's 缓冲液的 chamber 中。</li>
	<li>启动灌流系统。</li>
	<li>选择20x DIC 物镜，并在白光下调节焦距。</li>
	<li>点击任务栏上的Cfg Exp。
	<ol>
		<li>选择用于成像的所需荧光染料。</li>
		<li>确定采集频率和屏幕显示设置（采集：勾选 340、380、GFP；采集间隔：1 s；保存间隔：1 s）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对焦
	<ol>
		<li>在实验控制面板上，点击对焦按钮。</li>
		<li>根据需要调整采集时间（通常为 100 ms）和增益，然后&#34;为该波长保存设置&#34;。 
		注意：对于紫外光，应使用增益而非曝光时间。</li>
		<li>选择用于对焦的合适波长（例如 380），然后点击开始对焦。</li>
		<li>将视野从双目镜切换至计算机屏幕。</li>
		<li>确保通过双目镜可观察到微弱的绿色荧光。</li>
		<li>先使用粗调焦使物镜接近焦平面，再使用细调焦对细胞进行对焦。 
		注意：当物镜过于接近载物台时，显微镜会发出蜂鸣声。若发生此情况，请降低物镜，重新对齐载物台上的样品板，然后再次对焦。尽量减少对焦时间，以降低激光对细胞的损伤。</li>
		<li>在对焦过程中检查细胞的荧光强度。</li>
		<li>通过调节曝光时间和增益来调整细胞的荧光强度。 
		注意：340 和 380 的曝光时间和增益必须保持一致。</li>
		<li>当获得清晰对焦后，按下显微镜上的按钮，将视野切换至计算机。</li>
		<li>根据需要重新对焦以获得最清晰的图像，然后点击停止对焦。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>寻找 GFP 阳性细胞的替代操作流程
	<ol>
		<li>首先使用 340/380 波长进行对焦，以获得良好的细胞图像。</li>
		<li>选择 FITC，然后点击开始对焦。</li>
		<li>使用载物台控制器寻找 GFP 阳性细胞。</li>
		<li>将视野切换至计算机，然后点击停止对焦。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>区域选择
	<ol>
		<li>点击菜单栏中的区域按钮。</li>
		<li>选择所需的照明类型（340/380/FITC/TRITC）。对于过表达目标质粒的细胞，分别选择 FITC 和 TRITC 滤光片以检测 GFP 和 mCherry/DsRed/mRuby；否则选择 Fura-2。 
		注意：应避免选择状态不佳或已死亡的细胞，例如明显呈圆形或荧光蛋白过度曝光的细胞。</li>
		<li>点击采集图像，然后点击确定。</li>
		<li>新窗口将弹出，使用椭圆工具点击细胞区域以选择细胞。</li>
		<li>在目标蛋白所携带的荧光（FITC 或 TRITC）下选择目标细胞；在 380 nm 条件下选择不表达目标蛋白的对照细胞。</li>
		<li>通过右键点击圆形区域并选择“删除区域”来撤销选定区域。</li>
		<li>将背景区域作为最后一个区域选中，并记录其 ID 编号。</li>
		<li>点击保存，然后点击完成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>背景扣除
	<ol>
		<li>点击菜单按钮参考。</li>
		<li>输入背景区域的编号。 
		注意：如果背景是最后选择的区域，输入一个非常大的数字将自动切换到最后一个选定的区域。</li>
		<li>勾选扣除参考复选框，然后点击确定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>记录数据
	<ol>
		<li>点击实验控制面板上的记录数据按钮。 
		注意：仅当需要回放实验时才保存图像；通常仅勾选数据框即可。</li>
		<li>确保出现提示框，询问首选的数据文件类型；建议选择 .xlsx 格式。</li>
		<li>将打开一个&#34;.xlsx" 类型的工作表。将其最小化可避免占用屏幕空间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据采集
	<ol>
		<li>在控制面板的时间间隔部分，将数据采集间隔设置为1 s。 
		注意：可根据实际需求进行调整。</li>
		<li>点击实验控制面板上的归零时钟和采集按钮以开始实验。图中将显示各选定细胞区域的基线。</li>
		<li>根据实验要求对细胞进行一系列处理。</li>
		<li>为观察细胞的温度响应，使用温度控制器将灌流系统中的缓冲液加热至适当温度。</li>
		<li>为观察药物对细胞的影响，通过灌流或手动添加含药物的缓冲液，并记录细胞变化。</li>
		<li>数据采集完成后，点击暂停。 
		注意：实验过程中可随时暂停数据采集，并重置时钟。</li>
		<li>保存并分析数据。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点击文件和关闭实验以结束实验，并在弹出的对话框中选择否以保存实验方案。</li>
	<li>通过点击菜单中的新建开始新实验，并重复上述流程。</li>
	<li>关闭系统
	<ol>
		<li>关闭软件，并将数据从计算机中转移。</li>
		<li>按启动步骤的逆序关闭设备。</li>
		<li>在登记表上记录使用时长，并清理实验台面。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据分析
	<ol>
		<li>用 Fura-2 340/380 荧光比值表示细胞内 Ca2+ 浓度，或将其转换为相应的 Ca2+ 浓度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Single Cell Calcium Imaging for Channel Activation Studies

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</ol>

作者声明无任何利益冲突。

单细胞Ca2+成像系统的应用十分广泛，可用于研究多种细胞类型中的Ca2+信号，包括角质形成细胞、干细胞16、肝细胞、心肌细胞17、足细胞18、免疫细胞以及过表达目标蛋白的细胞系10,19。该技术可测量细胞内Ca2+浓度的变化及绝对值，在研究Ca2+相关离子通道方面发挥着关键作用，是离子通道研究实验室中不可或缺的重要工具之一。
随着研究的深入，钙离子（Ca2+）信号相关离子通道的重要性在中医药研究领域日益受到重视。研究人员试图通过离子通道的视角来解析中医药的核心问题。例如，中药的寒热药性体现了“寒者热之，热者寒之”的治疗原则&#34;&#34;。许多介导Ca2+信号的温度敏感性离子通道与这一原则密切相关。此外，大量中药通过抗炎作用发挥治疗效应，而多种与Ca2+相关的离子通道在炎症调控过程中发挥着重要作用20。
研究中药重要组分对离子通道特性的影响，对于揭示这些药物在分子水平上的药理性质至关重要。目前，中药研究者主要关注相关离子通道表达的检测。然而，关于中药对钙离子（Ca2+）相关离子通道的实时监测仍相对有限，许多潜在机制尚不明确。
本研究团队长期致力于钙离子（Ca2+）相关离子通道的研究，例如 STIM1/Orai1、STIM1/Orai3、TRPA110 和 TRPV1，熟练掌握单细胞 Ca2+ 成像系统的应用及其详细操作方法。本研究展示了单细胞 Ca2+ 成像技术在不同研究目的下的具体应用，旨在帮助读者全面理解该技术的广泛用途及操作细节。与以往已发表的相关研究21相比，本研究从多个角度并结合其他系统，为单细胞 Ca2+ 成像技术的应用提供了新的视角和方法学指导。例如，可直接对内源性表达目标基因的原代细胞或细胞系加载 Fura-2 探针，利用单细胞 Ca2+ 成像系统，在多种刺激因素作用下实时监测细胞内 Ca2+ 信号的变化。此外，也可在细胞系中过表达携带荧光蛋白的质粒。首先，按照前述方法对细胞加载 Fura-2 探针；随后，根据 FITC 或 TRITC 信号筛选出目标蛋白成功表达的细胞，并针对这些细胞进行后续的 Fura-2 Ca2+ 信号实时监测。
单细胞Ca2+成像是一种可根据实验目的与其他多种实验装置整合的检测系统。例如，若需检测温度敏感性离子通道对温度变化的响应，可将该系统与温度控制系统及灌流装置相结合，通过调控细胞外缓冲液的温度，同步监测细胞内Ca2+信号的变化19。该方法可验证相关离子通道对温度的响应特性。此外，单细胞Ca2+成像还可与相应的药物递送装置或其他细胞刺激装置联用，开展相关实验研究。
事实上，单细胞 Ca2+ 成像系统不仅可以通过特定设置实时监测 340/380 比值，还可获取 FITC 或 TRITC 的数值。此外，单细胞钙成像技术不仅适用于检测细胞质中钙离子浓度的变化，也可用于检测内质网（ER）中的钙离子浓度变化，显示出其广泛的应用前景19。该系统获得的数据统一以 &#34;.xlsx" 格式保存，可快速进行分析以获得结果。变化曲线有助于快速理解细胞的活化状态与特征，从而建立便捷的 Ca2+ 信号监测系统。预计本研究报告将有效推动单细胞 Ca2+ 成像系统在中医药研究领域的广泛应用，并助力中医药的科学解码。
然而，单细胞钙成像技术的应用确实存在某些局限性，例如无法实现高通量筛选。例如，在某些实验中，当需要筛选特定通道的激动剂或拮抗剂时，钙成像必须逐一进行筛选，耗时较长。在此类情况下，该技术可能需要与其他技术（如FLIPR22）结合使用，先进行高通量筛选，再通过单细胞钙成像进一步验证结果。此外，单细胞钙成像所获得的图像来源于常规荧光显微镜，其分辨率低于共聚焦显微镜15。因此，将单细胞钙成像技术与其他技术有效结合，发挥各自优势，是解决该领域挑战的重要途径。

Ca2+ 在细胞信号转导中起着至关重要的作用，可调控多种细胞功能，如肌肉收缩1、神经传导2、分泌3和基因表达4，从而影响多种生理过程。异常的 Ca2+ 浓度可导致心律失常5、凝血障碍6和激素失衡7等疾病。因此，研究细胞内 Ca2+ 浓度变化的机制具有极其重要的意义。
多种离子通道参与调控Ca2+ 细胞内的浓度，包括高浓度 Ca2+选择性钙释放激活钙（CRAC）通道8 TRP家族的非选择性阳离子通道9这些离子通道可被温度等刺激激活10，中药中发现的化合物和活性成分11，在多种Ca2+-相关的生理过程。
有效监测细胞内Ca2+ 浓度变化对于研究Ca2+相关的离子通道，尤其是在中医药领域，钙信号调控在多种治疗策略中起着核心作用。目前，测量细胞内Ca2+ 可分为两类：电学测量和光学测量。电学测量方法采用膜片钳技术，检测由Ca引起的细胞膜电位变化2+ 流入12.
在光学测量中，荧光探针可特异性结合 Ca2+，使研究人员能够追踪细胞荧光强度的变化。常用的光学方法包括基于荧光蛋白和基于荧光染料的技术。在基于荧光蛋白的方法中，研究人员可在细胞中过表达对 Ca2+ 敏感的荧光蛋白（如 Cameleon13 和 GCaMP14），并通过荧光显微镜或流式细胞术监测荧光信号的变化，从而观察胞质 Ca2+ 浓度的动态变化。此外，研究人员还可将这些蛋白在小鼠中过表达，并利用双光子荧光显微镜对细胞内 Ca2+ 浓度进行实时的活体或组织水平监测，实现高分辨率和深层组织穿透10。
对于基于荧光染料的方法，常用的 Ca2+ 探针包括 Fluo-3/AM、Fluo-4/AM 和 Fura-2/AM10。研究人员将细胞孵育在含有这些荧光探针的溶液中，探针可穿过细胞膜，并被细胞内的酯酶切割，生成保留在细胞内的活性化合物（如 Fluo-3、Fluo-4 和 Fura-2）。这些探针在其游离配体形式下荧光极弱，但与细胞内 Ca2+ 结合后会发出强烈的荧光，从而反映细胞质中 Ca2+ 浓度的变化。与其他荧光蛋白和染料相比，Fura-2 通常在 340 nm 和 380 nm 波长下激发。当与细胞内游离 Ca2+ 结合时，Fura-2 发生吸收光谱偏移，使其激发波长峰值从 380 nm 移至 340 nm，而发射峰值（约 510 nm）保持不变。荧光强度与结合的 Ca2+ 浓度之间存在定量关系，因此可通过测量这两个激发波长下的荧光强度比值来计算细胞内 Ca2+ 浓度。比值测量法可减少光漂白、荧光探针泄漏、染料加载不均以及细胞厚度差异带来的影响，从而获得更可靠且可重复的结果（图 1）。
单细胞 Ca2+ 成像系统主要利用显微镜技术和 Ca2+ 荧光探针 Fura-2/AM 来检测细胞内 Ca2+ 浓度。该系统由荧光显微镜、Ca2+ 成像光源和荧光成像软件组成，可同时对多个细胞（每视野最多达 50 个细胞）的胞质内 Ca2+ 变化进行实时、定量监测。结果以 &#34;.xlsx" 格式保存，便于后续分析。该系统具有较快的分析速度（约 1 分钟即可完成一个视野内一组细胞的分析），并可生成直观的变化曲线，显著提高了检测效率。单细胞 Ca2+ 成像是研究 Ca2+ 相关通道的重要技术手段，在离子通道相关的生物医学研究中具有重要价值。该技术在单细胞钙成像领域的应用有望极大地推动中医药作用机制的研究进展。

<table><tbody><tr><td>相机</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>辣椒素</td><td>Sigma</td><td>211275</td><td></td></tr><tr><td>CL-100 温度控制器</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>环匹阿西酸（CPA）</td><td>Sigma</td><td>C1530</td><td></td></tr><tr><td>DG-4 光源</td><td>Sutter Instrument Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）&amp;nbsp;</td><td>Amresco</td><td>231</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermofisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>荧光成像软件（MetaFluor，付费软件）&amp;nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fura-2/AM</td><td>Invitrogen</td><td>F1201</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 缓冲液</td><td>Gibco</td><td>14175103</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Invitrogen</td><td>L3000008</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>&amp;nbsp;Beyotime</td><td>ST501</td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸</td><td>&amp;nbsp;Beyotime</td><td>ST508</td><td></td></tr><tr><td>SC-20 液体循环加热/冷却装置&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>白光光源</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

单细胞钙成像用于研究钙离子通道的激活

Single-Cell Calcium Imaging for Studying the Activation of Calcium Ion Channels

单细胞Ca2+ 成像对于Ca的研究至关重要2+ 由温度、电压、内源性化合物和化学物质等多种刺激激活的通道。该方法主要依赖显微成像技术及相关Ca2+ 指示剂Fura-2/AM（AM是乙酰氧基甲酯的缩写）。进入细胞后，Fura-2/AM被酯酶水解为Fura-2，后者可逆性地与胞质游离Ca²⁺结合2+最大激发波长从380 nm漂移至340 nm（当与Ca饱和时）2+) 结合后发出的荧光强度与结合的 Ca 浓度呈定量关系2+通过测量340/380比值，可检测Ca2+ 细胞质中的浓度可以被准确测定，从而消除因不同样本间荧光探针加载效率差异所导致的误差。该技术可实现对Ca²⁺的实时、定量和同步监测2+ 多个细胞中的变化。结果以“.XLSX”格式存储，便于后续分析，具有快速生成直观变化曲线的优点，显著提高了检测效率。从不同实验角度，本文列举了利用该技术检测Ca2+ 内源性或过表达通道蛋白细胞中的信号。同时，展示了不同细胞激活方法并进行了比较。旨在帮助读者更清晰地理解单细胞Ca²⁺检测的使用方法及其应用2+ 成像

温度响应检测 
原代角质形成细胞 
原代角质形成细胞从小鼠新生鼠中分离，并根据已建立的方案进行制备10。将这些细胞接种于含有玻璃盖玻片的24孔板中。在加载Fura-2探针后，在显微镜下调节焦距，激发波长为380 nm，以清晰观察细胞形态，如图2A所示。若在操作过程中探针加载失败，则细胞不可见。通过灌流系统持续更换腔室中的细胞外缓冲液，以维持细胞的最佳状态。温度控制系统与灌流系统相连，通过调控细胞外缓冲液的温度变化，实现对细胞热反应的检测。该过程包括逐步加热细胞外缓冲液，随后再逐步冷却。
单细胞 Ca2+ 成像系统被用于监测在不同实验条件下细胞内 Ca2+ 浓度的变化。如图2B所示，角质形成细胞在受热时表现出明显的热反应，同时在冷却阶段也呈现出显著的反应。值得注意的是，当敲除主要介导该反应的 STIM1 基因后，这种温度反应即消失（图2C）10。单细胞 Ca2+ 成像技术可实现对细胞内 Ca2+ 浓度在响应多种外界刺激时的实时变化进行观察，从而对细胞行为与信号转导进行细致分析。
过表达目标质粒的 HEK293T 细胞 
根据实验方法，将 HEK293T 细胞接种至含有玻璃盖玻片的 24 孔板中。随后使细胞过表达 STIM1/Orai1，并采用与原代细胞相同的方法检测其介导的热反应。对于过表达目标质粒的细胞，通过选择表达相应质粒的细胞来确认转染成功，该质粒携带的红色或绿色荧光蛋白可在 TRITC 或 FITC 波长下显示荧光。本实验使用了 STIM1-GFP/Orai1-DsRed 质粒，其中 GFP 在 FITC 通道下检测，发出绿色荧光；DsRed 在 TRITC 通道下检测，发出红色荧光。过表达空载体 mCherry（TRITC）的细胞作为阴性对照。如 图 3A 所示，在 FITC 通道下观察到的荧光细胞表明 STIM1 成功表达，从而可选择这些细胞并记录其在升温和降温过程中的热反应。未转染的细胞作为阴性对照。图 3B 显示，STIM1/Orai1 在降温过程中表现出显著的热反应，与 图 3C 所示的阴性对照形成对比。
药物反应检测 
单细胞 Ca2+ 成像技术也可用于检测细胞对化合物的反应。用于药物反应检测的细胞制备方法与上述热刺激反应检测相同。药物反应与热刺激反应的区别在于，热刺激通常需要通过灌流系统改变胞外缓冲液的温度来激活细胞，而化合物则可通过灌流方式施加，也可直接使用移液器加入。直接用移液器加样可有效节约化合物的使用量；然而，所得曲线的视觉效果可能不如灌流方式获得的结果理想。
以图4为例，图4A展示了STIM1/Orai1的储存操作性钙内流（SOCE）反应，其中通过灌流系统依次改变细胞外Ca2+浓度和环匹阿酸（CPA）含量，以诱导SOCE。在图4B中，使用移液器直接向过表达TRPV1质粒的细胞加入TRPV1激动剂辣椒素。辣椒素可激活TRPV1并诱导细胞外Ca2+内流。
<img alt="Fura-2 钙成像；荧光、酯水解、340/380 nm 处的强度、示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67412/67412fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1">
图1： Fura-2 AM 示意图Fura-2 是一种常用的 Ca2+ 细胞生物学中一种选择性结合 Ca 的荧光探针2+ 以1:1的比例结合并发出荧光。由于Fura-2作为一种酸性化合物具有高度极性，无法进入细胞。为了提高细胞通透性，其负电基团与乙酰氧基甲基（AM）结合，形成Fura-2/AM。该修饰增强了其酯类溶解性，并消除了负电荷。进入细胞后，Fura-2/AM被酯酶水解为Fura-2，后者可逆地与胞质游离Ca²⁺结合2+结合后，最大激发波长从 380 nm 红移至 340 nm（当与 Ca 饱和结合时）2+）。发射的荧光强度与结合的 Ca 浓度呈定量关系2+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67412/67412fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜，钙成像；Fura-2 比值图显示细胞随时间变化的ATP反应。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67412/67412fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2：原代角质形成细胞的温度反应检测。（A）新生小鼠角质形成细胞的Fura-2染色，在20倍物镜下观察。（B,C）利用单细胞Ca2+成像系统检测野生型角质形成细胞的温度反应（B）和STIM1基因敲除角质形成细胞的温度反应（C）。放大倍数：20x。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67412/67412fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="STIM1-GFP 荧光显微镜图像、Fura-2 比值图、钙信号分析、热刺激与ATP处理。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67412/67412fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图 3：在 HEK293T 细胞中过表达 STIM1-GFP/Orai1-Dsred 的温度响应检测。（A）在 FITC 通道下显示表达 STIM1-GFP 的阳性细胞的代表性图像。（B,C）通过单细胞 Ca2+ 成像系统检测表达相应质粒的 HEK293T 细胞的温度响应。放大倍数：20x。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67412/67412fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="钙信号图，Fura-2 比值变化，STIM1-GFP/Orai1-DsRed，TRPV1-mRuby，辣椒素效应" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67412/67412fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4： 使用单细胞 Ca 检测药物反应2+ 成像. (A) 过表达STIM1/Orai1的HEK293T细胞中的SOCE反应。将细胞外缓冲液从含Ca2+含钙2+-通过灌流系统去除钙。在无钙条件下2+，加入 CPA 以耗竭 Ca2+ 从内质网。随后将细胞外缓冲液更换为 Ca2+含缓冲液以诱导细胞外 Ca2+ 内流，代表由储存库调控的 Ca2+ 进入。单细胞 Ca2+ 成像技术被用于动态记录胞质Ca²⁺的变化2+ 由这些过程引起的浓度。B) 过表达TRPV1-mRuby的HEK293T细胞，其中mRuby是一种用于检测TRPV1蛋白转染情况的荧光蛋白。使用移液器加入辣椒素，同时进行Ca2+ 通过单细胞 Ca 流入记录2+ 成像 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67412/67412fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本文介绍了一种利用Fura-2/AM染料进行单细胞Ca2+成像，实时定量监测细胞内钙离子（Ca2+）浓度的方法。该技术可实现高效的染料加载，并通过荧光强度比值准确计算Ca2+水平，是一种简便、快速适用于科研应用的技术方法。

单细胞 Ca2+ 成像对于研究由温度、电压、内源性化合物等多种刺激激活的 Ca2+ 通道至关重要。

我们研究了与温度感知、年龄感知以及疼痛感知相关的离子通道。我们关注小分子在这些通道中的活性筛选及其作用机制的研究。我们已筛选出两种激活TRPV1的激动剂，并对其作用机制进行了深入细致的研究。该技术能够实现对多个细胞内钙离子变化的实时、定量和同步监测，使其成为一种简单快速的研究方法。我们旨在通过钙相关离子通道的现代化研究，探索传统中药对各种疾病的治疗机制。首先，准备直径为8毫米的无菌玻璃载玻片，并将其放入24孔板中。向每个孔中加入 500 微升多聚赖氨酸（Poly-D-lycine）缓冲液。将玻片在 37 摄氏度孵育一小时，以完成包被。然后使用移液器弃去每个孔中的包被液。用杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）洗涤载玻片一次，并将洗涤后的载玻片置于一旁备用。将细胞以每孔约1.5 × 10⁵个细胞的密度接种至预先准备好的24孔板中，然后将培养板放入培养箱中，直至细胞贴壁。接着，将Fura-2/AM储存液与Pluronic F-127混合于含有1.3 mmol/L钙离子的Hank's缓冲液中。用铝箔覆盖Fura-2/AM工作液，以避光保护。进行细胞预处理时，将带有细胞的玻片转移至含有Hank's缓冲液的新24孔板中。使用移液器弃去每孔中的缓冲液，然后向每孔加入500 µL的Fura-2/AM工作缓冲液。将培养板在室温避光条件下孵育30分钟，以使探针充分加载。随后从每孔中移除Fura-2/AM工作缓冲液，并用Hank's缓冲液洗涤细胞三次，以去除多余的Fura-2/AM。开始实验前，获取经预处理的细胞用于单细胞钙成像，并启动荧光显微镜的所有组件。从可用选项中打开荧光成像软件。选择所需的实验方案，然后点击“确定”。接着，从主菜单中选择“新建实验”，以启动一个新的实验设置。现在，将灌流室安装到显微镜载物台上，并小心地将经 Fura-2/AM 处理的细胞载玻片放入含有 Hank's 平衡盐溶液的灌流室中。在白光下调节焦距以获得最佳观察效果。在实验控制面板上选择“聚焦”。选择所需的聚焦波长（例如 380 纳米），然后单击“开始聚焦”以启动焦距调整。先使用粗调聚焦将物镜调整至接近位置，再通过精细聚焦进行精确调节。通过 FITC 或 TRITC 的波长观察目标蛋白的表达情况。然后单击停止对焦并关闭对焦面板。在任务栏中单击配置实验，于配置设置中选择所需的成像层面。接着在菜单栏中单击区域按钮以定义成像区域，并选择所需的成像照明类型。单击“采集图像”，然后按“确定”以捕获图像。在荧光下识别表达目标蛋白的所需细胞，同时考虑在380纳米波长下对照组的空白读数。若要撤销选定区域，可右键单击圆形区域并选择“删除区域”。打开参考菜单，勾选“减去参考”复选框，然后单击“确定”以应用背景扣除。在实验控制面板上，单击“记录数据”以记录实验数据。在控制面板的时间推移部分，将数据采集间隔设置为1秒。然后在实验控制面板上单击“Zero Clock”和“Acquire”以开始数据采集。现在根据需要对细胞施加处理。数据采集完成后，单击“Pause”以停止该过程。保存获取的数据并继续进行分析。要结束实验，请点击“文件”并选择“关闭实验”。最后，关闭软件并将计算机中所有已保存的数据转移。加载了Fura-2探针的原代角质形成细胞在380纳米波长下显示出清晰的细胞形态。角质形成细胞的热反应表现为加热过程中细胞内钙离子浓度升高，冷却过程中也观察到类似反应。在缺乏STIM1基因的角质形成细胞中，该热反应消失，表明该基因在热诱导钙信号传导中发挥重要作用。过表达STIM1/Orai1的HEK293T细胞在降温时表现出明显的热反应，证实了基因成功表达，绿色和红色荧光标记为此提供了证据。通过灌流依次改变细胞外钙离子浓度并加入环匹酰胺酸，可有效诱导过表达STIM1-Orai1细胞的钙库操纵性钙内流反应。直接通过移液加入TRPV1激动剂辣椒素，可触发表达TRPV1质粒的细胞发生细胞外钙离子内流。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

用于研究钙离子通道激活的单细胞钙成像

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