单细胞钙成像用于研究钙离子通道的激活

我们研究了与温度感知、年龄感知以及疼痛感知相关的离子通道。我们关注小分子在这些通道中的活性筛选及其作用机制的研究。我们已筛选出两种激活TRPV1的激动剂，并对其作用机制进行了深入细致的研究。

该技术能够实现对多个细胞内钙离子变化的实时、定量和同步监测，使其成为一种简单快速的研究方法。我们旨在通过钙相关离子通道的现代化研究，探索传统中药对各种疾病的治疗机制。首先，准备直径为8毫米的无菌玻璃载玻片，并将其放入24孔板中。

向每个孔中加入 500 微升多聚赖氨酸（Poly-D-lycine）缓冲液。将玻片在 37 摄氏度孵育一小时，以完成包被。然后使用移液器弃去每个孔中的包被液。

用杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）洗涤载玻片一次，并将洗涤后的载玻片置于一旁备用。将细胞以每孔约1.5 × 10⁵个细胞的密度接种至预先准备好的24孔板中，然后将培养板放入培养箱中，直至细胞贴壁。接着，将Fura-2/AM储存液与Pluronic F-127混合于含有1.3 mmol/L钙离子的Hank's缓冲液中。

用铝箔覆盖Fura-2/AM工作液，以避光保护。进行细胞预处理时，将带有细胞的玻片转移至含有Hank's缓冲液的新24孔板中。使用移液器弃去每孔中的缓冲液，然后向每孔加入500 µL的Fura-2/AM工作缓冲液。

将培养板在室温避光条件下孵育30分钟，以使探针充分加载。随后从每孔中移除Fura-2/AM工作缓冲液，并用Hank's缓冲液洗涤细胞三次，以去除多余的Fura-2/AM。开始实验前，获取经预处理的细胞用于单细胞钙成像，并启动荧光显微镜的所有组件。

从可用选项中打开荧光成像软件。选择所需的实验方案，然后点击“确定”。接着，从主菜单中选择“新建实验”，以启动一个新的实验设置。

现在，将灌流室安装到显微镜载物台上，并小心地将经 Fura-2/AM 处理的细胞载玻片放入含有 Hank's 平衡盐溶液的灌流室中。在白光下调节焦距以获得最佳观察效果。在实验控制面板上选择“聚焦”。

选择所需的聚焦波长（例如 380 纳米），然后单击“开始聚焦”以启动焦距调整。先使用粗调聚焦将物镜调整至接近位置，再通过精细聚焦进行精确调节。通过 FITC 或 TRITC 的波长观察目标蛋白的表达情况。

然后单击停止对焦并关闭对焦面板。在任务栏中单击配置实验，于配置设置中选择所需的成像层面。接着在菜单栏中单击区域按钮以定义成像区域，并选择所需的成像照明类型。

单击“采集图像”，然后按“确定”以捕获图像。在荧光下识别表达目标蛋白的所需细胞，同时考虑在380纳米波长下对照组的空白读数。若要撤销选定区域，可右键单击圆形区域并选择“删除区域”。

打开参考菜单，勾选“减去参考”复选框，然后单击“确定”以应用背景扣除。在实验控制面板上，单击“记录数据”以记录实验数据。在控制面板的时间推移部分，将数据采集间隔设置为1秒。

然后在实验控制面板上单击“Zero Clock”和“Acquire”以开始数据采集。现在根据需要对细胞施加处理。数据采集完成后，单击“Pause”以停止该过程。

保存获取的数据并继续进行分析。要结束实验，请点击“文件”并选择“关闭实验”。最后，关闭软件并将计算机中所有已保存的数据转移。

加载了Fura-2探针的原代角质形成细胞在380纳米波长下显示出清晰的细胞形态。角质形成细胞的热反应表现为加热过程中细胞内钙离子浓度升高，冷却过程中也观察到类似反应。在缺乏STIM1基因的角质形成细胞中，该热反应消失，表明该基因在热诱导钙信号传导中发挥重要作用。

过表达STIM1/Orai1的HEK293T细胞在降温时表现出明显的热反应，证实了基因成功表达，绿色和红色荧光标记为此提供了证据。通过灌流依次改变细胞外钙离子浓度并加入环匹酰胺酸，可有效诱导过表达STIM1-Orai1细胞的钙库操纵性钙内流反应。直接通过移液加入TRPV1激动剂辣椒素，可触发表达TRPV1质粒的细胞发生细胞外钙离子内流。