采用膜片钳技术记录新鲜分离基底动脉平滑肌细胞中的内向整流性K⁺电流

我的研究主要集中在心脑血管电生理学领域。本研究描述了一种分离原代血管平滑肌细胞并利用全细胞膜片钳技术检测其电生理特性的方法。新鲜细胞的分离存在一些局限性，例如温度对酶解过程的影响、不同血管所需的消化时间各异，以及细胞在其原始环境中功能的瞬时性。

此外，钳夹技术在操作过程中存在导致血管壁和膜破裂的挑战，需要熟练的操作技巧。本方案有助于研究人员从手动动脉中快速获取活性原代细胞，并迅速推广钳夹技术的应用。首先，将培养皿中加入经95%氧气和5%二氧化碳饱和的冷生理盐水溶液。

将分离的大鼠脑组织放入培养皿中。将脑组织腹面朝上置于培养皿内，并用针固定。在光学显微镜下定位基底动脉。

使用高压灭菌的镊子和剪刀，小心去除周围组织。接着，将一根长2厘米、直径为25微米的金属丝插入分离出的基底动脉中。用金属丝轻轻摩擦动脉内壁，以有效去除血管内皮。

为了分离平滑肌细胞，首先将1至3号试管中的溶液预热。将分离的基底动脉转移至2号试管中。在37摄氏度下孵育该混合物30分钟，同时持续向试管中通入95%氧气和5%二氧化碳的混合气体。

接下来，将2号试管中的基底动脉转移至3号试管并进行孵育。从1号试管中加入1毫升预热的细胞分离液至3号试管中。在维持酶处理3分钟的同时，持续通入95%氧气和5%二氧化碳。

将基底动脉组织进行吹打以释放细胞。随后将四毫升冷分离液移入3号试管，以终止酶解过程。以59 G离心力离心混合物6分钟。

用移液器弃去上清液，然后再次加入冷分离液。最后一次洗涤后，移除上清液。

保留一毫升细胞悬液。将细胞悬液在四摄氏度下储存六至八小时。取100微升细胞悬液转移至水浴中。

向浴槽中加入一毫升细胞外液，静置。首先，打开微电极极化仪，将玻璃管放入极化仪中。

在控制面板上选择程序一。点击“Enter”进入并访问程序一。现在通过点击控制面板上的“Ramp”执行升温测试，以测量玻璃管的热值。

插入一根新的玻璃管。然后选择程序一，点击回车以制备微移液管。为记录护理电流，首先启动数据采集软件。

选择文件，然后单击设置数据文件名以建立数据存储路径。在工具菜单中启用膜片钳测试功能。将来自大鼠基底动脉的分离平滑肌细胞样本置于显微镜相机视野中央。

将参考电极尖端浸入灌流液中。然后用细胞内液填充所制备的微电极约20%的体积。将装有溶液的微电极固定在记录电极夹持器上。

现在使用注射器施加正压。将移液管尖端移入灌流液中，并在信号放大器软件上调节移液管偏移，使电流基线调整为零皮安（0 pA）。轻柔地将移液管压向细胞膜。

观察封接电阻增加至至少1 GΩ。移除正压并施加负压。为形成高阻封接，当封接电阻达到至少1 GΩ时，将钳制电压设为-60 mV，并使用CP FAST和CP SLOW补偿电极电容。

施加短暂的负压以破裂细胞膜，形成全细胞构型。在信号放大器软件中选择全细胞模式，然后点击自动进行膜电容补偿。

加载kir程序并开始记录数据。分离得到具有纺锤形形态的新鲜平滑肌细胞。细胞状态良好，适用于膜片钳实验。

典型的内向整流电流在负电压下表现出内向整流特性，而在正电压下钾离子电流极小或几乎没有。100至300微摩尔/升浓度的氯化钡可有效抑制Kir通道活性，证实该电流为Kir电流。亚硝基铁氰化钠可增加Kir电流，表明Kir通道在SNP诱导的血管舒张中发挥作用。

电流-电压关系的比较显示，在氯化钡存在下电流密度降低，而加入SNP后电流密度增加。