Name: 肺腺癌相关的原发性干燥综合征:探索潜在的常见致病机制和实验验证 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: 探索原发性干燥综合征与肺腺癌的共同致病机制，通过生物信息学分析识别差异表达基因，并构建蛋白质相互作用网络进行实验验证。该方法为理解两种疾病的关联提供了新见解。

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本研究由国家高水平医院临床科研基金（2023-NHLHCRF-BQ-01）和中日友好医院青年项目（No.2020-1-QN-8）资助。

实验动物饲养于中日友好医院的动物实验中心，饲养条件符合中国国家标准《实验动物 环境及设施要求》（GB14925-2010）规定的动物饲养环境。所有动物护理程序和实验均遵循ARRIVE指南，并基于3R原则（减少、替代、优化），遵守中国国家动物福利法规的相关规定。BALB/c小鼠购自SPF（北京）生物技术有限公司，NOD/Ltj小鼠购自华阜康（北京）生物技术有限公司。
1. 生物信息学分析
<ol>
	<li>数据集的制备
	<ol>
		<li>打开基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）（www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）15，并使用&#160;原发性干燥综合征 和 肺腺癌 作为关键词搜索基因表达谱。然后点击 GEO DataSets 数据库中的结果并选择 Homo sapiens 在 主要生物体选择并下载感兴趣的数据库集及其相应的平台信息。</li>
		<li>打开 Genecard 数据库（https://www.genecards.org/）16，并使用&#160;p原发性干燥综合征 和 肺腺癌 作为关键词获取pSS和LUAD的基因。下载疾病基因的电子表格。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>pSS与LUAD之间共有差异表达基因的鉴定
	<ol>
		<li>下载并打开 R 软件（https://cran.r-project.org/）&#8203;17. 在R软件中安装GEOquery R包、stringr R包、ggplot2 R包、reshape2 R包和limma R包。&#160;</li>
		<li>使用 R 软件在不同的 GEO 数据集（GSE84844、GSE51092、GSE32863 和 GSE75037）中识别并可视化差异表达基因（DEGs），随后比较和分析这些数据集中基因的表达情况。筛选标准为调整后 P 值小于 0.05 且 |log2 fold change| > 1 的基因。 &#60; 0.05 和倍数变化（流式细胞术) &#62; 1.2 或 &#60; 0.83 作为差异表达基因（DEGs）。</li>
		<li>从Genecard数据库中筛选与pSS和LUAD相关且表达水平大于或等于20的基因。</li>
		<li>合并来自 GEO 数据库和 Genecard 数据库的与 pSS 相关的差异表达基因（DEGs）以及与 LUAD 相关的差异表达基因（DEGs）。</li>
		<li>在 R 中安装并加载 VennDiagram 包，以获取并可视化与 pSS 和 LUAD 相关的差异表达基因（pSS-LUAD-DEGs）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析
	<ol>
		<li>进入 Metascape（https://metascape.org/）18. 点击&#160;选择文件 并上传 pSS-LUAD-DEGs 的 .xlsx 格式文件。选择 H. sapiens 在 输入为物种。同样，选择 H. sapiens 在 物种分析.</li>
		<li>点击 定制分析. 点击 富集 并选择 KEGG 通路. 点击 富集分析，然后单击 分析报告页面 当富集分析完成后。</li>
		<li>点击 全部内容打包为一个压缩文件 下载结果。访问 _ FINAL_GO.csv 下载文件 富集_GO 文件夹以查看结果。</li>
		<li>使用 ggplot2 包在 R 中执行 KEGG 可视化程序。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基因本体（GO）富集分析
	<ol>
		<li>在 R 中安装并加载 clusterProfiler 和 enrichplot 软件包。</li>
		<li>将pSS-LUAD-DEGs的文本格式列表导入R。</li>
		<li>运行 clusterProfiler 和 enrichplot 软件包进行 GO 富集分析及结果可视化。将分析中的统计学显著性定义为校正后 P 值小于 0.05 &#60; 0.05.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建与模块分析
	<ol>
		<li>进入相互作用基因检索数据库（STRING）（http://string-db.org/）19. 点击&#160;浏览 并上传 pSS-LUAD-DEGs 文件。选择 智人 在 生物体，然后点击 搜索.</li>
		<li>点击 继续结果可用后，点击 设置. 在……之下 基本设置 &#62; 最低必需相互作用评分，选择 高置信度（0.700）蜱虫 隐藏断开连接的节点 在 网络 在 高级设置，然后点击 更新.</li>
		<li>点击 输出 在标题栏中下载以 TSV 格式保存的 PPI 相互作用关系文本。</li>
		<li>下载并启动 Cytoscape 3.7.1 软件（https://cytoscape.org/）20. 点击&#160; 文件 &#62; 导入 &#62; 从文件导入网络 导入TSV格式文件以构建蛋白质相互作用网络。</li>
		<li>使用 网络分析仪 用于分析网络中的拓扑参数。通过左侧控制面板中的样式栏优化节点大小和颜色。</li>
		<li>在菜单栏中，选择 工具 &#62; 分析网络. 在 表格 面板，单击 学位 按度值降序排列各组分，选取度值最高的前20个基因为枢纽基因。</li>
		<li>在 R 中安装并加载 igraph 和 ggplot2 软件包，以根据度值可视化枢纽基因。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>枢纽基因的鉴定与验证
	<ol>
		<li>在 R 中安装并加载 pROC 软件包。</li>
		<li>将枢纽基因的文本格式列表导入 R。</li>
		<li>绘制枢纽基因的受试者工作特征（ROC）曲线，并计算ROC曲线下面积（AUC）值。 
		注意：请参阅 补充编码文件 1 用于筛选差异表达基因的 R 代码。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 实验验证
注意：有关本实验方案中所用材料、试剂和仪器的详细信息，请参见材料表。
<ol>
	<li>动物准备
	<ol>
		<li>将12只9周龄雌性BALB/c小鼠和12只9周龄雌性NOD/Ltj小鼠进行适应性饲养1周。</li>
		<li>使用随机数字表将12只九周龄雌性BALB/c小鼠均匀分配至空白对照组和PM2.5组。同样，将12只九周龄雌性NOD/Ltj小鼠均匀分为pSS组和pSS-PM2.5组。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细颗粒物2.5（PM2.5）悬浮液的制备 
	注意：PM2.5 可在小鼠模型中诱导炎症相关肺腺癌的发生与发展21BALB/c小鼠和NOD/Ltj小鼠通过PM2.5诱导产生炎症相关改变。根据Piao等描述的方法进行。22，PM2.5悬浮液的浓度配制为1 mg/mL。
	<ol>
		<li>称取PM2.5石英纤维膜，将其剪成2 cm × 2 cm的小片，浸入盛有适量去离子水的烧杯中。</li>
		<li>将烧杯密封后，置于水浴超声仪中，在37 °C下超声处理30分钟。重复此过程3次，直至颗粒完全溶解。</li>
		<li>将烧杯中的液体通过16层无菌医用纱布过滤，然后挤出纱布中残留的液体。</li>
		<li>将滤液置于平底容器中，在-20 °C冰箱中冷冻成冰块。随后使用冷冻干燥仪（−52 °C，0.1 mbar，48 h）对滤液冰块进行干燥，并收集所得粉末状颗粒。</li>
		<li>将粉末颗粒充分溶解于生理盐水中，配制浓度为1 mg/mL的PM2.5悬浮液。将PM2.5悬浮液倒入玻璃瓶中，置于高压灭菌器中，采用高温高压条件（121°C、15 psi，维持15分钟）进行灭菌。</li>
		<li>进行超声波震荡处理（200 W，震荡10秒，暂停10秒，重复3个循环）。处理后置于4 °C冰箱中保存，以备后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PM2.5小鼠模型的建立 
	注意：PM2.5组和pSS-PM2.5组每3天通过气管滴注给予PM2.5悬液一次，共持续28天，每次剂量为0.1 mL；空白对照组和pSS组每3天通过气管滴注给予生理盐水一次，共持续28天，每次剂量为0.1 mL。
	<ol>
		<li>向小鼠注射氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）混合溶液。通过夹趾无反应及全身肌肉完全松弛确认小鼠达到手术麻醉深度。在整个操作过程中持续监测反射、呼吸及整体反应，确保麻醉深度充分并维持至所有步骤完成。</li>
		<li>将小鼠置于小动物固定器上，腹部朝上，头部抬高，尾部降低呈45°角。用细线绕过小鼠上切牙并向上牵拉，将线固定在动物固定装置的螺钉上，确保充分暴露小鼠口腔腔隙。</li>
		<li>打开冷光源灯，将光线照射到小鼠颈部皮肤上。用镊子拉出小鼠舌头，充分暴露声门。观察小鼠口腔内反复开合的光点，该光点即为小鼠气道开口的位置。</li>
		<li>将18 G静脉留置针插入小鼠气管，抽出针芯，将棉线置于静脉留置针外端，观察棉线随小鼠胸廓运动而移动，以确认操作成功。</li>
		<li>先用1 mL注射器抽取0.2 mL空气，然后抽取0.1 mL PM2.5悬浮液，再抽取0.2 mL空气。通过18 G静脉留置针将混合物注入气管。</li>
		<li>拔出18 G静脉留置针。将动物固定器直立并顺时针和逆时针旋转各30次，使PM2.5悬浮液在小鼠肺内均匀分布。然后伸直小鼠颈部，将其侧卧放置，以防窒息。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样本采集 
	注意：在第29天采集样本th 实验当天用于后续分子生物学分析。
	<ol>
		<li>检查安乐死系统的连接，打开控制器电源。打开二氧化碳（CO₂）气瓶阀门。2气瓶阀门 
		注意：在将动物放入安乐死装置前，切勿预先填充试剂。</li>
		<li>将小鼠放入舱室并通入 CO2 每分钟通气量为腔室体积的30%–70%。将小鼠暴露于CO2 5分钟，确保其不动、无呼吸且瞳孔散大。关闭CO₂2 关闭气瓶阀门，继续观察5分钟以确认死亡。</li>
		<li>将安乐死的小鼠仰卧置于干净的解剖板上。暴露气管、心脏和肺。</li>
		<li>使用剪刀和镊子去除覆盖胸腹部及颈部区域的皮肤和肌肉。用剪刀和镊子沿胸腔两侧肋骨边缘进行剪切，以暴露含有心脏和肺的胸腔。随后剪断锁骨，以形成足够大的开口，便于充分检查左肺和右肺的各个肺叶。</li>
		<li>切除从胸骨和肋骨延伸至下颌的颈部肌肉。将剪刀插入肋骨前缘下方，沿两侧剪开，以去除覆盖气管的骨性部分。</li>
		<li>用镊子夹住靠近下颌的气管，将剪刀置于镊子上方，进行完全的横向切口。</li>
		<li>用镊子轻轻提起气管，用剪刀剪断腹侧的组织连接，直至将整个胸部组织从体内移除。</li>
		<li>将肺组织平放在工作台上，用生理盐水冲洗表面残留物，滤纸吸干后分装至冻存管中，于 -80 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>定量实时聚合酶链式反应（qPCR）
	<ol>
		<li>使用含有液氮的研钵将肺组织研磨成粉末。</li>
		<li>使用精密天平称取20 mg研磨组织，加入750 µL Buffer RL至离心管中，用涡旋振荡器充分混匀，室温（RT）静置3 min。随后在14,000 x g 室温下孵育5分钟，收集上清液。</li>
		<li>将基因组DNA（gDNA）过滤小柱放入2 mL收集管中。将上清液转移至gDNA过滤小柱中，于14,000 x g离心 g 室温下持续2分钟。</li>
		<li>弃去gDNA过滤小柱。向滤液中加入等体积的70%乙醇，用移液器上下吹打5次混匀。</li>
		<li>将RNA小柱放入2 mL收集管中。将750 µL混合液转移至RNA小柱中，于12,000 x g离心 g 室温下孵育1分钟。</li>
		<li>弃去滤液，将RNA小柱重新放回2 mL收集管中。向RNA小柱中加入500 µL RW1缓冲液，于12,000 x g 室温下孵育1分钟。</li>
		<li>弃去滤液，将RNA小柱重新放回2 mL收集管中。向RNA小柱中加入500 µL Buffer RW2。在12,000 x g 室温下孵育1分钟。重复此步骤一次。</li>
		<li>弃去滤液，将RNA小柱重新放回2 mL收集管中。在12,000 x g 室温下持续 2 分钟。</li>
		<li>将RNA小柱转移至1.5 mL离心管中，向柱膜中心加入100 µL无RNase的水，在室温下孵育2 min。随后在12,000 x g 室温孵育1分钟。弃去RNA小柱，将RNA溶液于-80 °C保存。</li>
		<li>取2 µL RNA溶液，按照仪器说明书使用NanoDrop分光光度计测定其浓度和质量。 
		注意：本研究选用RNA的260/280和260/230比值进行质量控制。</li>
		<li>在微量离心管中依次加入以下组分以配制 RNA 溶液：1 µg 总 RNA、4 µL MgCl₂2 （25 mM）、2 µL 反转录 10x 缓冲液、2 µL dNTP 混合物（10 mM）、0.5 µL 重组核糖核酸酶抑制剂、15 单位反转录酶、0.5 µg 寡聚(dT)15 引物，并用无核酸酶水定容至20 µL。轻轻混匀管内液体，使所有液体汇集于管底。 
		注意：必须配制混合溶液，以确保 cDNA 合成和 RNA 定量结果更加一致。</li>
		<li>将20 µL RNA溶液在42 °C孵育15分钟进行逆转录生成cDNA，随后在95 °C变性5分钟，冷却至4 °C，然后于-20 °C保存。</li>
		<li>将 6.4 µL 去离子水、10 µL SYBR Green 实时 PCR 预混液、2 µL 所得 cDNA 溶液、0.8 µL 正向引物（10 µM）和 0.8 µL 反向引物（10 µM）混合并充分混匀表1) 以配制反应体系。</li>
		<li>在PCR仪器上运行反应，以获取目的基因和参考基因的循环阈值（CT）值。
		<ol>
			<li>每个PCR循环开始时，先在95 °C下初始变性60 s。</li>
			<li>在PCR循环中，95 °C变性15秒，60 °C退火15秒，72 °C延伸45秒，并在延伸步骤中收集数据。共进行40个PCR循环。</li>
			<li>PCR循环结束后，使用PCR仪器自动进行熔解曲线分析。 
			注意：如果熔解曲线显示双峰或不规则峰形，则表明实验可能存在异常。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用2−ΔΔCt法确定每个目标基因的相对表达水平-ΔΔCT 方法，随后进行进一步的统计分析。使用以下公式列表进行第2部分-ΔΔCT 方法： 
		ΔCT（检测组）= CT（靶基因，检测组） - CT（参照基因，检测组） 
		ΔCT（校准样本）= CT（目标基因，校准样本） - CT（参照基因，校准样本） 
		ΔΔCT = ΔCT（检测样本） - ΔCT（校准样本） 
		2-ΔΔCT 基因表达的倍数变化</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>基因名称</td>
			<td>序列 (5′ 至 3′)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CCNA2 forward</td>
			<td>CCCAGAAGTAGCAGAGTTTGTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CCNA2 reverse</td>
			<td>TTGTCCCGTGACTGTGTAGAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse ASPM forward</td>
			<td>CTTATTCAGGCTATGTGGAGGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse ASPM reverse</td>
			<td>CCAGGCTTGAATCTTGCAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CCNB2 forward</td>
			<td>TTGAAATTTGAGTTGGGTCGAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CCNB2 reverse</td>
			<td>CTGTTCAACATCAACCTCCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse NUSAP1 forward</td>
			<td>CTCCCTCAAGTACAGTGACC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse NUSAP1 reverse</td>
			<td>TTTAACAACTTGGTTGCCCTC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CEP55 forward</td>
			<td>CCGCCAGAATATGCAGCATCAAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CEP55 reverse</td>
			<td>AGTGGGAATGGCTGCTCTGTGA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：定量实时PCR的引物序列。
<ol start="6">
	<li>酶联免疫吸附测定（ELISA） 
	注意：根据ELISA试剂盒的说明书，将ELISA试剂盒平衡至室温，配制洗涤缓冲液，并稀释标准品。预先将90 µL浓缩的生物素化抗体与8910 µL生物素化抗体稀释液混合，配制成生物素化抗体工作液（1:100）。同样，将90 µL浓缩的酶结合物与8910 µL酶结合物稀释液混合，预先配制成酶结合物工作液（1:100）。
	<ol>
		<li>使用含液氮的研钵将肺组织研磨成粉末。</li>
		<li>使用精密天平称取50 mg肺组织，加入1 mL PBS至研磨管中，在冰上充分研磨。</li>
		<li>将混合物在4 °C、3000 x g 条件下离心5 min，收集上清液作为待测样本。</li>
		<li>将不同浓度的样本/标准品各100 µL加入ELISA板的相应孔中，用自粘封板膜覆盖反应孔，在37 °C培养箱中孵育90 min。</li>
		<li>使用自动洗板机清洗ELISA板4次，每次注入350 µL洗涤缓冲液，注液与吸液之间间隔30 s。</li>
		<li>每孔加入100 µL生物素化抗体工作液，用自粘封板膜密封孔板，在37 °C培养箱中孵育60 min。随后，按照前述步骤清洗ELISA板4次。</li>
		<li>每孔加入100 µL酶结合物工作液，用自粘封板膜密封孔板，在37 °C培养箱中孵育30 min。随后，按照前述步骤清洗ELISA板4次。</li>
		<li>每孔加入100 µL显色剂，避光处理，在37 °C培养箱中孵育10–20 min。然后每孔加入100 µL终止液，充分混匀，并立即在450 nm处测定吸光度（OD450）值。 
		注意：使用八通道移液器加入生物素化抗体工作液、酶结合物工作液和终止液，可快速完成加样，避免潜在操作误差。</li>
		<li>使用CurveExpert软件（http:// curveexpert.webhop.net/）生成标准曲线，计算各样本孔中目标物质的浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质印迹（Western blotting）
	<ol>
		<li>按100:1:1的比例混合RIPA裂解缓冲液、苯甲基磺酰氟（PMSF）和磷酸酶抑制剂，配制放射免疫沉淀分析（RIPA）溶液，并置于冰上。</li>
		<li>使用含液氮的研钵将肺组织研磨成粉末。</li>
		<li>使用精密天平准确称取20 mg肺组织，加入250 µL RIPA混合溶液中。</li>
		<li>将混合物在冰上孵育20 min，然后在4 °C、12,000 x g 条件下离心15 min，收集上清液作为样本。</li>
		<li>按50:1的比例混合BCA试剂盒中的试剂A和试剂B，配制BCA工作液。
		<ol>
			<li>稀释标准品，配制浓度为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mg/mL的稀释标准品溶液。将各标准品溶液和样本各20 µL分别加入96孔板的不同孔中，在37 °C孵育30 min。</li>
			<li>使用酶标仪在490 nm处测定吸光度。根据标准品溶液的浓度和吸光度拟合标准曲线，并计算样本浓度23。使用RIPA混合溶液将样本浓度调整至相同水平。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在离心管中按4:1的比例将蛋白上清液与5倍上样缓冲液混合。在金属浴中煮沸5 min，然后在4 °C、12,000 x g 条件下离心15 min，收集上清液。</li>
		<li>采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行蛋白质分离，并通过电转移将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。在室温下用5%脱脂牛奶封闭PVDF膜1 h。</li>
		<li>将PVDF膜在4 °C下与一抗（1:1000稀释）孵育12 h，随后用TBST洗涤3次，每次10 min，再在室温下与二抗（1:5000稀释）孵育2 h。</li>
		<li>使用全自动化学发光免疫分析系统检测目标条带，并利用内置软件进行定量分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>统计学分析
	<ol>
		<li>使用适当的软件进行统计学分析。</li>
		<li>实验数据以均值±标准差表示。</li>
		<li>采用单因素方差分析（ANOVA）确定显著性差异。</li>
		<li>认为P &#60; 0.05具有统计学意义。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Key Molecular Targets Linking Primary Sjogren's Syndrome and Lung Adenocarcinoma

作者声明无利益冲突。

尽管原发性干燥综合征（pSS）主要以外分泌腺的浸润性病变为特征，但腺体外损害同样不容忽视24。肺脏是pSS的靶器官之一，肺部受累是pSS常见的腺体外表现，通常表现为支气管黏膜和肺间质的淋巴细胞浸润25。研究表明，至少20%的pSS患者会出现间质性肺疾病（ILD）26,27。ILD是肺癌的重要危险因素，这在一定程度上解释了pSS患者肺癌发病率升高的现象28。同时，pSS-ILD患者的肿瘤标志物显著升高，进一步强调了pSS与肺部恶性肿瘤之间的关联29,30。为了探讨pSS与肺腺癌（LUAD）之间关联的潜在机制，本研究首先基于pSS和LUAD共同相关的差异表达基因（DEGs）进行了生物信息学分析，随后建立了与这两种疾病相关的动物模型以进行实验验证。
在鉴定出 pSS-LUAD-DEGs 后，进行了 KEGG 通路富集分析，结果揭示 PI3K/Akt 信号通路在该关联中发挥关键作用。PI3K/Akt 信号通路在被 PI3K 激活后，催化生成 PIP3，招募 PDK1 和 AKT 蛋白至细胞膜。PDK1 对 AKT 进行磷酸化从而激活 AKT，启动一系列下游效应。相关研究表明，PI3K/Akt 信号通路参与肿瘤的发生、增殖、迁移、凋亡及血管生成等过程31,32,33,34,35,36。一系列临床研究已证实，PI3K/Akt 信号通路在肿瘤发生过程中被广泛激活36。同时，AKT 可通过磷酸化 IκB 激酶来调控 NFκB 信号通路，进而控制相关炎症因子的转录37,38。MAPK 信号通路39、细胞因子-细胞因子受体相互作用40、NOD 样受体信号通路41、Th17 细胞分化42 以及 JAK-STAT 信号通路43 在炎症相关过程中发挥重要的调控作用。然而，FoxO 信号通路44、坏死性凋亡45 和细胞衰老46 则通过调控细胞凋亡过程影响肿瘤发生。同时，GO 富集分析还显示，与炎症密切相关的生物过程，如细胞因子受体结合、细胞因子活性、肿瘤坏死因子受体超家族结合以及肿瘤坏死因子受体结合，也参与了该过程。
为了进一步确定 pSS 与 LUAD 之间的关键靶点，通过 PPI 网络分析从 pSS-LUAD-DEG 中获得核心基因，并利用 GSE31210 数据集进行验证。最终确定 IL6、CCNA2、JAK2、IL1B、ASPM、CCNB2、NUSAP1 和 CEP55 为 pSS-LUAD 的关键靶点。IL6 和 IL1B 是关键的炎症因子，在 pSS 的炎症过程中发挥重要作用47,48。同时，JAK2 是调控 JAK-STAT 信号通路的关键靶点，近年来已有多种 JAK 酶抑制剂被尝试用于 pSS 的临床治疗49。ASPM、CCNB2、NUSAP1 和 CEP55 参与调控 DNA 复制，因此在肿瘤的发生和发展中起关键作用50,51,52,53,54,55。研究表明，ASPM、CCNB2、NUSAP1 和 CEP55 均可促进 LUAD 的侵袭和发展51,52,55,56,57。上述研究发现，炎症在 pSS 和 LUAD 中均发挥重要作用。以淋巴细胞浸润为特征的 pSS 会在局部组织中引发慢性且持续的炎症反应58。肺癌的发生与转移与肺部的炎症微环境密切相关59。综上所述，我们推测炎症反应可能是 pSS 与 LUAD 关联的关键机制。以此为切入点，进一步开展了实验验证。
由于目前尚无适用于pSS和LUAD的共同模型，我们在查阅相关文献后，决定采用PM2.5刺激的pSS模型小鼠来模拟与这两种疾病均相关的模型。PM2.5是指直径小于或等于2.5 µm的细颗粒物，可在空气中悬浮并深入肺部，造成显著的健康损害60。研究表明，长期暴露于PM2.5可导致肺部形成慢性炎症微环境，最终引发LUAD21,61。NOD/Ltj小鼠会出现外分泌腺的淋巴细胞浸润，是研究pSS的理想模型62。因此，在进一步的实验验证中，我们采用PM2.5刺激NOD/Ltj小鼠，建立pSS与肺部炎症反应的复合模型。实验结果表明，在未接受PM2.5刺激的情况下，NOD/Ltj小鼠和BALB/c小鼠中促炎因子IL-6和IL-1β几乎不表达；而在PM2.5刺激后，IL-6和IL-1β的表达显著升高，表明肺部炎症微环境的实验模型已成功建立。此外，PM2.5刺激后，NOD/Ltj小鼠中IL-6和IL-1β的表达水平高于BALB/c小鼠，表明pSS对PM2.5诱导的炎症反应更为敏感。
JAK/STAT 通路是一条由细胞因子刺激的信号转导通路，参与细胞增殖、分化、凋亡以及免疫调节等生物学过程63。炎症性细胞因子（包括 IL-6 和 IL-1β）与细胞膜上的受体结合，导致 Janus 激酶（JAKs）发生磷酸化激活，进而由 JAKs 介导 STAT 的磷酸化64。磷酸化的 STAT 蛋白转入细胞核，调控 STAT 响应基因的表达。JAK2/STAT3 信号通路与肿瘤相关基因的调控密切相关，主要由 IL-6 激活，调节一系列促进细胞生长、迁移和肿瘤形成相关蛋白的表达。本研究发现，在 PM2.5 刺激后，NOD/Ltj 小鼠和 BALB/c 小鼠肺组织中 JAK2 和 STAT3 的蛋白水平未出现显著变化，但 JAK2 和 STAT3 的磷酸化水平显著升高，表明 JAK2/STAT3 通路异常激活。进一步比较显示，在相同 PM2.5 刺激条件下，NOD/Ltj 小鼠肺组织中 JAK2 和 STAT3 的磷酸化水平显著高于 BALB/c 小鼠，提示在 pSS 小鼠肺组织中，JAK2/STAT3 信号通路的激活更为显著。
通过生物信息学分析预测CCNA2、ASPM、CCNB2、NUSAP1和CEP55等肿瘤相关基因的表达水平。结果表明，在PM2.5刺激后，肺组织中CCNA2、CCNB2和CEP55的表达水平升高，且在NOD/Ltj小鼠中的表达水平高于BALB/c小鼠。提示CCNA2、CCNB2和CEP55可能与PM2.5刺激后的炎症反应密切相关，并参与肺腺癌（LUAD）发生的潜在机制与发展过程。
在未来的研究中，我们希望与胸外科合作，获取原发性干燥综合征（pSS）患者的肺部手术样本，包括伴有肺腺癌（LUAD）及非癌性肺部病变的样本，通过单细胞测序技术阐明从淋巴细胞浸润到肿瘤发生过程的演变机制。同时，炎症因子IL-6和IL-1β，以及在调控炎症过程中起关键作用的JAK/STAT信号通路，已被认为与pSS向LUAD进展的潜在致病机制相关。这表明，与炎症相关的药物，如托珠单抗（IL-6单克隆抗体）、卡那单抗（IL-1β单克隆抗体）和托法替尼（JAK抑制剂），可能成为预防pSS患者发生LUAD的潜在候选药物。

原发性干燥综合征（pSS）是一种自身免疫性疾病，其特征是外分泌腺的淋巴细胞浸润，导致干眼（xerophthalmia）和口干（xerostomia）等临床症状1,2。pSS通常还伴有腺体外受累表现，包括高球蛋白血症3、间质性肺病4、肾小管性酸中毒5、神经损伤6和血小板减少症7，这些是主要的不良预后因素。近年来，一系列研究表明，pSS通常伴随癌症发病率升高，包括血液系统恶性肿瘤和实体瘤8,9,10。肺癌是pSS相关癌症中最常见的类型之一，尤其是肺腺癌（LUAD）11。
综上所述，进一步研究表明，原发性干燥综合征（pSS）与肺腺癌（LUAD）之间可能存在某些共同的潜在发病机制。据我们所知，目前尚无专门研究阐明这两种疾病之间的共同机制。近年来，生物信息学分析为我们揭示跨物种间潜在共病机制提供了新的可能性12,13,14。为了进一步揭示其潜在机制，本研究采用生物信息学分析方法，对pSS与LUAD之间的共同靶点及信号通路进行分析，并随后构建动物模型以进行实验验证。阐明这些机制可能为临床上对pSS患者肺腺癌的预防提供证据支持。
本研究利用 GEO 和 Genecard 数据库检索与 pSS 和 LUAD 相关的基因。随后筛选出与 pSS 和 LUAD 相关的差异表达基因（pSS-LUAD-DEGs）。我们进行了 KEGG 和 GO 富集分析，以阐明 pSS-LUAD-DEGs 的重要生物学功能。通过构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络以识别核心靶点，并进一步通过 ROC 曲线分析评估枢纽基因的诊断准确性。采用 NOD/Ltj 小鼠作为 pSS 动物模型，以细颗粒物 2.5（PM2.5）刺激诱导炎症反应。通过 qPCR、ELISA 和蛋白质印迹实验对研究结果进行验证。总体而言，本研究结果表明，由肺部炎症微环境诱导的癌变可能是 pSS 患者中 LUAD 高发病率的关键原因。同时也提示，通过阻断相关机制可能预防 pSS 患者中 LUAD 的发生。

<table><tbody><tr><td>三色预染蛋白标记物</td><td>Epizyme</td><td>WJ103</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>抗体稀释缓冲液</td><td>Epizyme</td><td>PS119</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>BCA 蛋白定量试剂盒</td><td>Epizyme</td><td>ZJ101</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Cytoscape 3.7.1 软件</td><td>美国国立普通医学科学研究所（NIGMS），美国国立卫生研究院（NIH）</td><td>Version 3.7.1.</td><td>用于生物网络分析与可视化的开源软件</td></tr><tr><td>ECL 发光液</td><td>Epizyme</td><td>SQ203</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>电泳缓冲液</td><td>Epizyme</td><td>PS105S</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 10.0</td><td>GraphPad</td><td>Version 10.0</td><td>数据分析</td></tr><tr><td>HRP 标记山羊抗兔 IgG（H+L）（AS014）</td><td>abclonal</td><td>AS014</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>JAK2 抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3230T</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>小鼠 IL-1&amp;beta; ELISA 试剂盒</td><td>北京&amp;nbsp;4A&amp;nbsp;生物技术有限公司</td><td>CME0015</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>小鼠 IL-6 ELISA 试剂盒</td><td>北京&amp;nbsp;4A&amp;nbsp;生物技术有限公司</td><td>CME0006</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>磷酸酶抑制剂混合物（100&amp;times;）</td><td>Epizyme</td><td>GRF102</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>磷酸化-JAK2（Tyr1007/1008）抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3776S</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>磷酸化-STAT3（Tyr705）抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9145S</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物（100&amp;times;）</td><td>Epizyme</td><td>GRF101</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>无蛋白快速封闭缓冲液（5&amp;times;）</td><td>Epizyme</td><td>PS108</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>PVDF 膜</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>R 软件</td><td>R 统计计算基金会</td><td>不适用</td><td>用于数据分析、可视化和机器学习应用的统计分析软件与编程语言</td></tr><tr><td>放射免疫沉淀分析试剂</td><td>Epizyme</td><td>PC101</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>反转录系统</td><td>Promega</td><td>A3500</td><td>PCR</td></tr><tr><td>SDS-PAGE</td><td>Epizyme</td><td>LK303</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液（5&amp;times;）</td><td>Epizyme</td><td>LT103</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>STAT3 抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9139S</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>SYBR Green 实时荧光定量 PCR 预混液</td><td>TOYOBO</td><td>QPK-201</td><td>PCR</td></tr><tr><td>TBST（10&amp;times;）</td><td>Epizyme</td><td>PS103</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Western Blot 转膜缓冲液（10&amp;times;）</td><td>Epizyme</td><td>PS109</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>&amp;beta;-肌动蛋白抗体</td><td>abclonal</td><td>AC026</td><td>Western Blot</td></tr></tbody></table>

原发性干燥综合征合并肺腺癌：探讨潜在共同致病机制及实验验证

Primary Sjogren's Syndrome Associated with Lung Adenocarcinoma: Probing the Potential Common Pathogenic Mechanisms and Experimental Verification

本研究旨在通过生物信息学分析及实验验证，探讨原发性干燥综合征（pSS）与肺腺癌（LUAD）之间潜在的共同致病机制。从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）和Genecard数据库中获取与pSS和LUAD相关的基因，并筛选出pSS与LUAD共有的差异表达基因（DEGs），即pSS-LUAD-DEGs。通过京都基因与基因组百科全书（KEGG）和基因本体（GO）富集分析，阐明pSS-LUAD-DEGs所涉及的重要生物学功能。通过构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络识别核心靶点，并进一步通过受试者工作特征（ROC）曲线分析评估枢纽基因的诊断准确性。在本研究中，NOD/Ltj小鼠作为pSS动物模型，接受细颗粒物2.5（PM2.5）刺激以诱导炎症反应。采用实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）、酶联免疫吸附测定（ELISA）和蛋白质印迹法（western blotting）进行相关分子生物学实验验证。KEGG与GO富集分析结果表明，炎症在连接pSS与LUAD中发挥关键作用。IL6、CCNA2、JAK2、IL1B、ASPM、CCNB2、NUSAP1和CEP55被确定为pSS-LUAD的关键靶点。BALB/c小鼠和NOD/Ltj小鼠在连续21天接受PM2.5刺激后，肺组织中炎症因子IL-6和IL-1β的表达增强，激活JAK2/STAT3信号通路，并上调肿瘤相关基因CCNA2、CCNB2和CEP55的表达水平，其中NOD/Ltj小鼠的变化较BALB/c小鼠更为显著。该实验方案表明，肺部炎症微环境诱导的癌变可能是pSS患者肺腺癌高发的关键原因。此外，阻断相关机制可能有助于预防pSS患者中LUAD的发生。

从GSE84884（pSS）的23348个基因中鉴定出共计3290个差异表达基因（DEGs），其中包括2659个上调基因和631个下调基因（图1A）。对于GSE51092（pSS），从11409个基因中鉴定出共计3290个差异表达基因，其中包括667个上调基因和587个下调基因（图1B）。GeneCards数据库获得102个与卵巢pSS相关的差异表达基因，筛选标准的相关性评分≥20。将来自GEO和GeneCards的pSS相关差异表达基因进行合并并去重后，共获得453个差异表达基因（pSS-DEGs）。从GSE32863（LUAD）的25440个基因中鉴定出共计7154个差异表达基因，其中包括3934个上调基因和3220个下调基因（图1C）。在GSE75037（LUAD）中，从25440个基因中鉴定出共计11235个差异表达基因，其中包括6125个上调基因和5110个下调基因（图1D）。GeneCards数据库获得600个与卵巢LUAD相关的差异表达基因，筛选标准的相关性评分≥20。将来自GEO和GeneCards的LUAD相关差异表达基因进行合并并去重后，共获得7478个差异表达基因（LUAD-DEGs）。在pSS-DEGs与LUAD-DEGs之间筛选出233个共有差异表达基因（pSS-LUAD-DEGs），并使用维恩图进行可视化展示（补充表1和图1E）。
在去除与疾病相关的信号通路后，针对pSS-LUAD-DEGs进行的KEGG通路富集分析结果显示，最显著的前10条信号通路主要与代谢通路相关。具体包括PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、坏死性凋亡（Necroptosis）、肌动蛋白细胞骨架的调控、FoxO信号通路、NOD样受体信号通路、细胞衰老、Th17细胞分化以及JAK-STAT信号通路（图2A）。前10条KEGG信号通路及其对应的pSS-LUAD-DEGs的可视化结果如图2B所示。
pSS-LUAD-DEG 的 GO 富集分析揭示了以下前 10 个生物学过程（图 3），在细胞组分（CC）中富集的条目包括：对病毒的响应、先天免疫应答、对病毒的防御应答、对共生体的防御应答、病毒过程的调控、病毒生命周期的调控、病毒过程的负调控、病毒基因组复制的负调控、病毒基因组复制的调控、抗病毒先天免疫应答；在生物过程（BP）中富集的条目包括：膜的侧面、质膜的外侧、细胞外基质、外部包裹结构、含胶原的细胞外基质、胶原三聚体、膜筏、膜微区、质膜筏、小窝；在分子功能（MF）中富集的条目包括：细胞因子受体结合、细胞因子活性、信号受体调节活性、肿瘤坏死因子受体超家族结合、信号受体激活活性、肿瘤坏死因子受体结合、受体配体活性、蛋白质同源二聚化活性、跨膜受体蛋白激酶活性、蛋白激酶活性。
PPI 网络包含 99 个节点和 466 条边（图 4A）。在 PPI 网络中度值最高的前 20 个基因是 STAT3、STAT1、TP53、TNF、IL6、IFNG、EGFR、ISG15、CCNA2、IL10、JAK2、MX1、IL1B、IFIT1、AKT1、SMAD3、ASPM、CCNB2、NUSAP1 和 CEP55，这些基因为枢纽基因（图 4B）。
采用 ROC 曲线分析评估 20 个核心基因的诊断准确性（图5). GSE32863 数据集中 STAT3、STAT1、TP53、TNF、IL6、IFNG、EGFR、ISG15、CCNA2、IL10、JAK2、MX1、IL1B、IFIT1、AKT1、SMAD3、ASPM、CCNB2、NUSAP1 和 CEP55 的 ROC 曲线下面积（AUC）值分别为 0.543、0.840、0.724、0.892、0.965、0.529、0.721、0.763、0.933、0.784、0.836、0.648、0.936、0.689、0.662、0.548、0.960、0.939、0.934 和 0.953（图5A,D，以及GSE75037的0.620、0.811、0.676、0.878、0.955、0.546、0.642、0.765、0.945、0.759、0.804、0.625、0.938、0.753、0.641、0.540、0.958、0.945、0.908和0.941图 5B,E）。此外，对于验证集 GSE31210（图5C,F，AUC值分别为0.505、0.676、0.819、0.688、0.863、0.540、0.720、0.665、0.814、0.562、0.766、0.661、0.806、0.528、0.607、0.652、0.906、0.927、0.910和0.898。IL6、CCNA2、JAK2、IL1B、ASPM、CCNB2、NUSAP1和CEP55的AUC值为 &gt;0.7，表明这八项均具有诊断意义。
在BALB/c小鼠和NOD/Ltj小鼠的肺组织中，仅检测到少量促炎因子IL-6和IL-1β的表达。经PM2.5刺激后，IL-6和IL-1β的表达显著升高，其中NOD/Ltj小鼠的升高幅度明显高于BALB/c小鼠（图6）。
经PM2.5刺激后，BALB/c小鼠和NOD/Ltj小鼠肺组织中JAK2/STAT3的表达水平未发生显著变化。然而，p-JAK2和p-STAT3的水平显著升高。在PM2.5刺激后，NOD/Ltj小鼠中p-JAK2和p-STAT3的表达水平显著高于BALB/c小鼠（图7）。
经PM2.5刺激后，ASPM和NUSAP1在BALB/c小鼠和NOD/Ltj小鼠中的mRNA表达均无显著变化，但CCNA2、CCNB2和CEP55的mRNA表达升高（图8）。值得注意的是，经PM2.5刺激后，NOD/Ltj小鼠中CCNA2、CCNB2和CEP55的mRNA表达显著高于BALB/c小鼠。
<img alt="显示基因表达分析结果及重叠部分的火山图 A-D 和维恩图 E。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67421/67421fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：差异表达基因的火山图与维恩图。（A）GSE84844 的火山图。（B）GSE51092 的火山图。（C）GSE32863 的火山图。（D）GSE75037 的火山图。（E）pSS-DEGs 与 LUAD-DEGs 的维恩图。上调基因以红色表示；下调基因以绿色表示。缩写：pSS = 原发性干燥综合征；LUAD = 肺腺癌；DEGs = 差异表达基因。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67421/67421fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="基因通路分析；基因比例与通路的散点图及网络图；数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67421/67421fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：pSS-LUAD-DEGs 的 KEGG 通路富集分析。（A）pSS-LUAD-DEGs 的 TOP10 KEGG 富集图谱。（B）TOP10 KEGG 信号通路与 pSS-LUAD-DEGs 的关联性。缩写：KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes；pSS = 原发性干燥综合征；LUAD = 肺腺癌；DEGs = 差异表达基因。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67421/67421fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="基因本体分析的柱状图；按生物过程、细胞组分和功能分类的富集评分。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67421/67421fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：pSS-LUAD-DEG 的 GO 富集分析。缩写：GO = 基因本体（Gene Ontology）；pSS = 原发性干燥综合征（primary Sjögren's Syndrome）；LUAD = 肺腺癌（Lung adenocarcinoma）；DEGs = 差异表达基因（differentially expressed genes）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67421/67421fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="基因相互作用网络图和度中心性条形图，显示关键节点关系。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67421/67421fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图 4：pSS-LUAD-DEG 的蛋白质互作网络（PPI 网络）。（A）PPI 网络的可视化图谱。颜色越红表示节点的连接性越强。（B）PPI 网络中度值排名前 20 的基因。缩写：PPI = 蛋白质-蛋白质相互作用；pSS = 原发性干燥综合征；LUAD = 肺腺癌；DEGs = 差异表达基因。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67421/67421fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="ROC曲线比较不同生物标志物的灵敏度与1-特异度（AUC），展示其在分类任务中的性能，示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67421/67421fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5枢纽基因的ROC曲线分析 (A-F) GSE32863、GSE75037 和 GSE31210 中枢纽基因的 ROC 曲线分析。缩写：ROC = 受试者工作特征曲线。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67421/67421fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="IL-6 和 IL-1β 水平比较；柱状图；实验结果；炎症标志物分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67421/67421fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 6"> 
图6：PM2.5对小鼠肺组织中促炎因子的影响。（A）各组小鼠肺组织中IL-6的表达。（B）各组小鼠肺组织中IL-1β的表达。a. 空白对照组；b. pSS组；c. PM2.5组；d. pSS-PM2.5组。* 与空白对照组比较，p &lt; 0.05；# 与pSS组比较，p &lt; 0.05；Δ 与PM2.5组比较，p &lt; 0.05。缩写：PM2.5 = 细颗粒物2.5。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67421/67421fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3 和 β-actin 的 Western 印迹分析及图表结果；蛋白表达。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67421/67421fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 7"> 
图 7：PM2.5 对小鼠肺组织中 JAK2/STAT3 信号通路的影响。（A）各组小鼠肺组织中 p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3 和 β-actin 的表达情况。（B）各组小鼠肺组织中 p-JAK2/JAK2 的比值。（C）各组小鼠肺组织中 p-STAT3/STAT3 的比值。a. 空白对照组；b. pSS 组；c. PM2.5 组；d. pSS-PM2.5 组。* 与空白对照组比较，p &lt; 0.05；# 与 pSS 组比较，p &lt; 0.05；Δ 与 PM2.5 组比较，p &lt; 0.05。缩写：PM2.5 = 细颗粒物 2.5。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67421/67421fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="通过肌动蛋白测量CD163、CD206、Arg1、NLRP3、GSDES的柱状图；比较数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67421/67421fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图8"> 
图8：PM2.5对小鼠肺组织中LUAD相关基因的影响。（A）各组小鼠肺组织中CCNB2 mRNA的表达。（B）各组小鼠肺组织中CCNA2 mRNA的表达。（C）各组小鼠肺组织中ASPM mRNA的表达。（D）各组小鼠肺组织中NUSAP1 mRNA的表达。（E）各组小鼠肺组织中CEP55 mRNA的表达。a. 空白对照组；b. pSS组；c. PM2.5组；d. pSS-PM2.5组。* p &lt; 0.05，与空白对照组比较；# p &lt; 0.05，与pSS组比较；Δ p &lt; 0.05，与PM2.5组比较。缩写：PM2.5 = 细颗粒物2.5。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67421/67421fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充表 1：从 pSS-DEG 与 LUAD-DEG 中筛选出的共有差异表达基因（pSS-LUAD-DEG）列表。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67421/Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充代码文件 1：用于筛选差异表达基因的 R 代码。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67421/DEGs_R_code.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文描述了通过生物信息学分析和实验验证探究原发性干燥综合征与肺腺癌潜在共同致病机制的操作步骤及注意事项。

本研究旨在通过……探讨原发性干燥综合征（pSS）与肺腺癌（LUAD）之间潜在的共同致病机制

我的研究通过生物信息学分析和实验验证，探讨原发性干燥综合征与腺癌之间潜在的共同致病机制。旨在阐明这两种疾病相互关联的方式及其背后的影响因素。本研究致力于填补原发性干燥综合征与腺癌之间关联机制认识上的空白，揭示二者共享的致病机制。这一见解将为受累患者的未来诊断和治疗策略提供参考。在后续研究中，我们希望与胸外科合作，获取原发性干燥综合征（pSS）患者的肺部手术样本，以阐明从淋巴细胞浸润到肿瘤近端部位的进展过程。首先，打开基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO），以原发性干燥综合征和肺腺癌为关键词，搜索基因表达谱。点击 GEO DataSets 数据库中的结果，并在“Top Organisms”中选择 Homo sapiens。选择并下载感兴趣的数据库及其相应的平台信息。然后打开 GeneCard 数据库，以原发性干燥综合征和肺腺癌为关键词，检索与 pSS 和 LUAD 相关的基因。下载这些疾病相关基因的电子表格。使用 R 软件，识别并可视化差异表达基因（DEGs），筛选条件为调整后的 P 值小于 0.05，且倍数变化大于 1.2 或小于 0.83。对这些数据集之间的基因表达进行比较和分析。从 GeneCard 数据库中筛选与 pSS 和 LUAD 相关、表达水平大于或等于 20 的基因。整合来自GEO数据库和GeneCard数据库的与pSS及LUAD相关的差异表达基因（DEGs）。在R软件中安装Venn Diagram包后，获取并可视化与pSS和LUAD相关的差异表达基因。在Metascape网站上，点击“Select File”并上传pSS-LUAD-DEGs的xlsx格式文件。在“输入物种”和“分析物种”中均选择 Homo sapiens。点击自定义分析，然后点击富集分析并选择 KEGG 通路。取消勾选其他选项。点击“富集分析”，完成后点击“分析报告页面”。点击“全部打包为一个压缩文件”以下载结果。访问 _FINAL_GO。查看 Enrichment_GO 文件夹中的 csv 文件以查看结果。在 R 软件中使用 ggplot2 软件包执行 KEGG 可视化程序。对于基因本体（gene ontology，GO）富集分析，将 pSS-LUAD-DEGs 的文本格式列表导入 R，运行 Cluster Profiler 和 Enrich Plot 软件包进行 GO 富集分析及结果可视化。将分析中的统计学显著性设定为校正后 P 值小于 0.05。访问 STRING 数据库，点击“Browse”（浏览），上传 pSS-LUAD-DEGs 文件。在“Organisms”（物种）中选择 Homo sapiens，然后点击“Search”（搜索）。单击“继续”后，当结果可用时，点击“设置”。在“基本设置”中，于“最低所需交互得分”处选择“高置信度 0.7”。在“高级设置”中勾选“隐藏网络中未连接的节点”，然后点击“更新”。单击标题栏中的“导出”以下载蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）关系文本的TSV格式文件。在 Cytoscape 3.7.1 软件中，依次单击 文件、导入 和 从文件导入网络，以导入TSV格式文件并构建PPI网络。使用 NetworkAnalyzer 工具分析网络中的拓扑参数，并通过控制面板中的样式栏优化节点的大小和颜色。在菜单栏中，选择“工具”和“分析网络”。在表格面板中，单击“度”以按降序排列组件。对于枢纽基因的鉴定与验证，将枢纽基因的文本格式列表导入已加载 PROC 包的 R 软件中。绘制枢纽基因的受试者工作特征（ROC）曲线，并计算ROC曲线下面积（AUC）值。通过对数据进行分析，使用维恩图展示了pSS差异表达基因（DEGs）与LUAD差异表达基因之间的233个共有差异表达基因。针对pSS与LUAD共有差异表达基因，鉴定出前10条显著富集的KEGG通路，主要与代谢通路相关，包括PI3K-Akt、MAPK以及细胞因子-细胞因子受体相互作用通路。pSS LUAD差异表达基因的GO富集分析揭示了显著的生物学过程，包括病毒应答和先天免疫应答、细胞组分类别，以及细胞因子受体结合和活性等分子功能。PPI网络包含99个节点和466条边，鉴定出STAT3、STAT1和TP53为关键枢纽基因。PPI网络中度值最高的前20个基因被可视化展示，包括TNF、IL6和EGFR。首先，进行生物信息学分析，以确定原发性干燥综合征与肺腺癌共病时的炎症通路。在构建动物模型时，将麻醉后的小鼠置于小型动物固定器上，腹部朝上，头部抬高，尾部降低呈45度角。使用细线绕过小鼠上切牙并向上牵拉，将线固定在动物固定器的螺钉上，以充分暴露小鼠口腔腔隙。打开冷光源灯后，用镊子轻轻拉出小鼠的舌头，充分暴露声门。将18号静脉留置针插入小鼠气管，抽出针芯。在针的外端放置一根棉线，当棉线随小鼠胸部运动而摆动时，表明插入成功。使用1毫升注射器，先吸取0.2毫升空气，然后吸取0.1毫升PM 2.5悬液，最后再吸取0.2毫升空气。通过18号静脉留置针将混合物注入气管。拔出留置针后，将动物固定装置竖直固定，并顺时针和逆时针旋转各30次，以使肺内PM 2.5悬液均匀分布。伸直小鼠颈部，将其侧卧放置，以防窒息，并让其恢复。29天后，将已处死的小鼠置于清洁解剖板上，仰卧位固定。使用剪刀和镊子，去除覆盖在腹部、胸部和颈部区域的皮肤和肌肉组织。沿胸腔两侧肋骨边缘做切口，以暴露胸腔。切断锁骨，以形成足够宽的开口以便检查肺叶。切除从胸骨和肋骨延伸至下颌的颈部肌肉。将剪刀插入肋骨前缘下方，沿两侧进行切口，以去除覆盖气管的骨性部分。用镊子夹住靠近下颌的气管，将剪刀置于镊子上方，做完全的横向切口。然后用镊子轻轻向上提起气管，同时用剪刀剪断腹侧的组织连接，直至将整个胸腔组织从体内完全移除。将肺组织平放，用生理盐水冲洗表面。吸干后，将组织分装至冻存管中，于零下80摄氏度保存，以备后续生化实验使用。

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