Name: 使用光镊生成混合球体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: 了解如何使用光镊技术构建淋巴瘤混合球体，实现单细胞水平的精确操控与细胞间相互作用研究。该方法为三维细胞培养和组织工程提供了新的实验手段。

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作者衷心感谢 Nicholas Czarnik，他细致的编辑工作显著提高了本研究的清晰度。

1. 基于琼脂糖凝胶的微模具制备
注意：处理所有细胞培养物时，必须采用正确的无菌技术。本方案中使用的所有试剂均列于材料表中。如图1A所示，为单次实验制备三块含间充质干细胞（MSCs）的凝胶。
<img alt="用于间充质基质细胞球体形成的琼脂糖水凝胶制备；培养装置示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67422/67422fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：间充质基质细胞（MSC）球体的制备。（A）琼脂糖微模具制备步骤示意图。（B）间充质基质细胞（MSCs）的接种及间充质球体的培养。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67422/67422fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol>
	<li>首先准备琼脂糖微模具。用去离子水冲洗微模具3D培养皿（见材料表）3次，并置于紫外灯下照射30分钟以进行灭菌。</li>
	<li>首先配制2%琼脂糖溶液。称取1 g高品质纯 sterile 琼脂糖粉末（见材料表），放入 sterile 50 mL 锥形管中。向琼脂糖中加入50 mL sterile 0.9%氯化钠溶液（见材料表），充分混匀。拧紧锥形管盖，但保持略微松动。</li>
	<li>使用微波炉加热至琼脂糖完全溶解。每加热10秒暂停一次，小心旋转锥形管以确保琼脂糖充分溶解。在混合或移液过程中避免产生气泡。将琼脂糖冷却至约70 °C。 
	注意：确保无任何半透明未溶解粉末残留。 
	警告：熔融琼脂糖温度极高，可能导致严重皮肤烫伤。</li>
	<li>在超净工作台内采用无菌操作技术。通过将500 µL琼脂糖加入预先灭菌的微模具中来制备水凝胶。使用移液器吸除可能被困在微模具微小结构中的气泡。</li>
	<li>室温孵育15分钟后，待琼脂糖完全凝固，小心将凝胶从微模具中取出并转移至 sterile 6孔板中。操作时避免损伤凝胶结构。在进行下一步前，应在显微镜下检查微模具是否正确制备，确认边缘完整，并检查是否存在可能导致培养基泄漏的缝隙。</li>
	<li>加入足量的1×磷酸盐缓冲液（PBS），完全覆盖微模具后，将6孔板置于紫外灯下照射30分钟以进行灭菌。 
	注意：琼脂糖微模具可在含1×PBS覆盖的锥形管中于4 °C冰箱条件下保存，最长可存放2周后再使用。</li>
	<li>在使用微模具制备类球体之前，需用RPMI培养基完全覆盖凝胶（6孔板每孔4.0 mL）进行平衡，并至少孵育15分钟。</li>
</ol>
2. 间充质基质细胞（MSCs）球体的制备
<ol>
	<li>在标准条件下培养HS-5细胞系（见材料表），该细胞系为一种人源间充质基质细胞系，使用添加了10%热灭活胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（见材料表）的RPMI 1640培养基进行培养，每48小时更换一次培养基。</li>
	<li>当HS-5细胞融合度达到约90%时，按以下步骤进行传代：
	<ol>
		<li>使用移液管移除培养基。</li>
		<li>加入1× PBS洗涤细胞，轻轻晃动后吸除残留培养基。</li>
		<li>向细胞培养瓶中加入2 mL胰蛋白酶-EDTA溶液（见材料表），于37 °C孵育以促进细胞从瓶底脱落。</li>
		<li>加入2 mL完全培养基终止消化反应。</li>
		<li>使用5 mL移液管轻轻吹打细胞悬液，并转移至15 mL锥形离心管中。</li>
		<li>将细胞悬液在300 × g 条件下离心7分钟。弃去上清液，用1 mL新鲜培养基重悬细胞。</li>
		<li>取10 µL细胞沉淀转移至0.5 mL离心管中，加入10 µL 0.4%台盼蓝溶液（见材料表），使用自动细胞计数仪（见材料表）进行细胞计数。</li>
		<li>根据上述获得的细胞密度，将细胞稀释至2 × 105 个细胞/mL的培养基中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>移除琼脂糖微模具中的细胞培养基。</li>
	<li>小心地将上述步骤（2.2.8）中制备的190 µL细胞悬液接种至琼脂糖微模具的加样室中。每个孔中约含有150个细胞（38,000个细胞/凝胶）。</li>
	<li>将接种后的琼脂糖微模具置于培养箱中（5% CO2、37 °C、湿润环境）孵育30分钟，直至细胞沉降至凝胶底部。30分钟后，从培养箱中取出含有微模具的培养板，缓慢向凝胶外部加入额外培养基，完全覆盖凝胶（例如，6孔板每孔加4.0 mL）。 
	注意：请勿将培养基直接加在琼脂糖微模具的凝胶上，而应加入培养皿中，避免损伤新形成的类球体。</li>
	<li>将凝胶置于37 °C、5% CO2的湿润环境中继续孵育72小时，直至形成均一类球体。（图1B）。 
	注意：建议在接下来的3天内使用倒置显微镜观察类球体的形成过程。通常情况下，间充质基质细胞在24小时内开始形成类球体，但该过程可能因细胞代次和密度不同而有所加快或延迟。在琼脂糖微模具上孵育72小时后，间充质基质细胞可形成相对均一的类球体；然而需注意，即使在相同培养条件下，类球体的大小和形态仍可能存在差异。当培养基颜色由紫红色变为黄色时，需及时更换培养基。</li>
</ol>
3. 淋巴瘤细胞的培养及光镊捕获前准备
注意：血液学细胞系（包括淋巴瘤细胞）在专为悬浮培养设计的培养瓶中的培养基内自由悬浮生长，不会贴附于培养板或培养容器表面。为保持细胞的最佳特性，建议在使用光镊组装杂合球体实验开始前不超过30分钟时启动样品制备。需要强调的是，本节所述方案适用于Ri-1人淋巴瘤细胞系，但类似方案也可用于其他血液系统肿瘤细胞系。
<ol>
	<li>将Ri-1淋巴瘤细胞系（见材料表）在添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基中培养。</li>
	<li>将淋巴瘤细胞置于37 °C、含5% CO2的湿润空气中，在培养箱中按标准培养条件培养。每2-3天传代一次，使细胞密度维持在3-5 × 105 个细胞/mL的对数生长期。</li>
	<li>收集细胞，将悬液转移至15 mL聚苯乙烯管中。在室温下以300 × g 离心7分钟，获得细胞沉淀。弃去上清液，加入10 mL新鲜培养基，轻轻吹打至形成均匀悬液。</li>
	<li>吸取10 µL细胞悬液至新的离心管中，加入10 µL台盼蓝染液。充分吹打混匀后，取10 µL加入计数板，测定细胞密度和活率（通常高于95%）。</li>
	<li>将细胞悬液稀释至终浓度为1 × 104 个细胞/mL。在进行光学操作前，将淋巴瘤细胞保持在37 °C环境中。</li>
</ol>
4. 光镊系统的搭建
注意：以下方案是专门为定制的光镊系统36（图2A）开发的。然而，该检测方法也可用于其他市售的捕获系统。无论使用何种设备，系统准备的基本步骤（例如启动激光器和计算机软件、安装样品、测试细胞在光阱中移动的可能性）均保持不变。所有实验均在室温下进行，即25 °C。
<img alt="光镊显微镜示意图：用于杂合类球体构建的激光系统；包含免疫组化结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67422/67422fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：光镊生成杂合类球体工作原理的示意图。（A）定制设计的光镊系统。（B）将单个淋巴瘤细胞附着到间充质干细胞（MSC）类球体表面的过程。单个淋巴瘤细胞被光镊捕获并贴附至基质类球体表面，直至形成稳定连接。该过程持续进行，直至基质类球体的整个表面均被淋巴瘤细胞覆盖。（C）使用抗CD20单克隆小鼠抗体对杂合类球体切片进行免疫组织化学染色的代表性图像。免疫染色采用自动染色仪（见材料表）上的抗人CD20单克隆小鼠抗体，按照制造商说明书操作完成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67422/67422fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol>
	<li>打开显微镜光源。</li>
	<li>佩戴激光安全防护眼镜。</li>
	<li>开启激光器，并调节激光功率，使光镊系统的捕获刚度达到约 50 pN/µm。在继续操作前，等待 10 分钟，使激光光束稳定。 
	注意：在自行搭建的系统中，当使用 3 µm 聚苯乙烯微球进行测量时，在物镜入口处的激光功率为 100 mW 时可达到上述捕获刚度。此前已证实该条件对淋巴瘤细胞的侵入性最小32,33，同时仍能有效操控活细胞。</li>
	<li>在此期间，启动计算机软件。软件窗口中将显示显微镜样品的图像。使用屏幕上可见的标记，将光镊移动至所需方向。</li>
	<li>系统准备就绪后，向底部物镜中心加入 30 µL 去离子水。 
	注意：自行搭建的系统采用水浸物镜；但浸没介质可能因用户设备配置不同而有所差异。</li>
	<li>将带有玻璃底的 35 mm 细胞培养皿（见材料表）放置于显微镜载物台上，并用固定夹具稳定培养皿。</li>
	<li>使用显微镜的微米级调节螺钉抬升物镜，直至水滴接触培养皿的玻璃底部。</li>
	<li>使用微米调节螺钉，轻轻调整显微镜载物台，直到在屏幕上看到激光束清晰聚焦为一个明亮的光点。软件窗口中将显示显微镜样品图像。使用屏幕上可见的标记，将光镊沿任意所需方向移动。</li>
	<li>向玻璃底培养皿中心加入 100 µL 预先制备的淋巴瘤细胞悬液（见步骤 3.5）。让细胞沉降至培养皿底部，约需 5 分钟。</li>
	<li>通过移动显微镜载物台，寻找一个悬浮的淋巴瘤细胞。在屏幕上点击光镊光标，使光镊作用于细胞样本。尝试将细胞移动至目标位置。用于操控的细胞应能够在指定方向上轻松移动。 
	注意：根据我们的观察，加入玻璃培养皿的淋巴瘤细胞中，约有 5% 至 10% 在孵育后会永久附着于底部。该比例随操作时间延长而增加，60 分钟后可能达到 30%。然而，尽管存在此类损失，初始加入的细胞数量仍足以完成系统的有效校准，并实现淋巴瘤细胞在类球体表面的充分覆盖。</li>
</ol>
5. 使用光镊生成杂合球体
<ol>
	<li>用移液器吸头（100–1000 µL）小心地从琼脂糖模具的孔中取出一个基质球状体，并将其置于35 mm的玻璃底培养皿中。</li>
	<li>加入2 mL RPMI培养基，在37 °C标准条件下孵育10分钟。在此期间，球状体会轻柔地粘附于玻璃表面，从而防止操作过程中发生移动。</li>
	<li>将含有球状体的培养皿放置在显微镜载物台上，并使用固定夹具将培养皿稳定在显微镜载物台上。</li>
	<li>小心加入100 µL淋巴瘤细胞悬液，终浓度为1 × 104 个细胞/mL（见步骤3.5），静置约5分钟，使细胞自然沉降至培养皿底部。</li>
	<li>通过移动显微镜载物台，寻找一个悬浮的淋巴瘤细胞。在屏幕上点击光镊光标，使光镊作用于选定的细胞。当细胞被捕获并可移动时，移动载物台将该细胞输送至基质球状体表面并接触。</li>
	<li>首先使淋巴瘤细胞与基质球状体表面接触并保持10秒。随后，使用光镊对淋巴瘤细胞进行三次重复的脱离尝试，以检测细胞是否已稳定粘附。</li>
	<li>如果细胞接触被破坏，则再次使用光镊将淋巴瘤细胞粘附至球状体表面；但此次延长粘附时间，约为20秒。 
	注意：必须针对每种细胞系分别确定单细胞捕获所需的具体时间间隔。在初步操作中发现，Ri-1细胞系的淋巴瘤细胞对基质球状体具有较强的黏附性，通常在10–20秒内即可牢固粘附于表面。因此，针对单个Ri-1细胞捕获的特定接触时间设定为10、20和30秒。由于该操作耗时较长，建议选用与光镊结合形成球状体时黏附时间不超过30秒的细胞系。</li>
	<li>重复上述操作，依次处理后续的淋巴瘤细胞，直至基质球状体表面完全被淋巴瘤细胞覆盖。</li>
	<li>为了使淋巴瘤细胞更均匀地覆盖基质球状体的可用表面，需在显微样品体积内调整光镊的位置。通过使用显微镜的微米级调焦旋钮改变成像平面，可实现光镊位置的调节，从而更深入地控制被捕获物体在样品中的移动。</li>
	<li>为更好地模拟自发形成的球状体结构，应在基质细胞核心外覆盖2–3层淋巴瘤细胞。</li>
	<li>将含有球状体的玻璃底培养皿转移至培养箱，在标准条件下孵育1小时。 
	注意：杂合球状体可在20 µL RPMI培养基的悬滴中进行长期培养。</li>
</ol>
6. 类球体活性的测定
<ol>
	<li>使用活/死细胞染色试剂盒（参见材料表）评估细胞球体的活力。轻轻移除培养基，并直接用 100 µL 的 1× PBS 洗涤球体。</li>
	<li>将球体在含有 1 µM 钙黄绿素-AM 和 2 µM 碘化丙啶同型二聚体-1 的 100 µL 1× PBS 溶液中于 37 °C 孵育 20 分钟。</li>
	<li>使用荧光显微镜（参见材料表）观察球体并采集图像（参见材料表）。 
	注意：染色后无需洗涤球体。由于染料在与细胞相互作用前几乎无荧光，该检测方法的背景荧光水平本身较低。</li>
	<li>使用 ImageJ 程序（参见材料表），通过计算绿色染色区域（活细胞）与红色（死细胞）和绿色染色总区域的比值来确定球体的活力。</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本研究利用光镊技术实时构建了间充质基质细胞为核心、淋巴瘤细胞为外壳的杂合类球体。包括捕获系统在内的新型激光技术如今已有商业化产品，并日益普及。然而迄今为止，大多数光镊装置仍为实验室自行搭建，因此在仪器校准、操作流程和实验几何构型方面，不同实验室之间可能存在差异38,39本方案介绍了搭建商用及定制化光镊系统所需的基本信息，以实现实时构建杂合类球体。尽管光镊系统具备先进研究实验室在专业人员操作下开展实验所需的灵活性，但鉴于该方法展现出的巨大潜力——即能够 &#34;触碰&#34; 以非侵入方式观察活细胞，我们希望该技术能在癌症研究领域得到广泛应用。特别是光镊技术能够揭示杂合类球体形成的早期阶段，而这是传统整体三维技术无法实现的40根据本方案在实时条件下构建的杂合类球体反映了淋巴瘤细胞与基质细胞在水凝胶培养中发生的自聚集现象，正如我们先前所述。18附着细胞的数量以及细胞间接触的位置均可被精确调控，且这种图案化的三维结构无需任何外部稳...

三维（3D）细胞模型因其在多种功能和结构特性上更接近肿瘤组织，正在加速癌症研究。这些特性包括细胞外基质的产生、细胞间的相互作用、营养物质和氧气梯度的维持，以及对治疗的类似响应1,2,3,4最近，为了更好地反映 体内 条件，已开发出涉及多种细胞类型的高级异质性3D模型5,6,7.
B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）是一类起源于B淋巴细胞的异质性恶性肿瘤，而B淋巴细胞是免疫系统的重要组成部分8。B-NHL具有多样的临床表现和组织学特征，涵盖一系列疾病谱，从病程迁延的惰性类型到快速进展的侵袭性亚型均有涉及9,10。B-NHL及其他血液系统恶性肿瘤的发病机制常与肿瘤微环境的影响相关11,12。例如，淋巴瘤细胞常扩散至骨髓，可能导致危及生命的并发症13。间充质基质细胞（MSCs）作为骨髓微环境的关键组分，已被证实可通过直接的细胞间相互作用显著影响肿瘤的生长与进展14，主要依赖于细胞间的直接接触15,16,17；因此，迫切需要建立能够研究此类相互作用的模型。我们先前的研究表明，当MSCs与淋巴瘤细胞在琼脂糖水凝胶上共培养时，会自组装形成多细胞球体，其中基质细胞位于核心，外围则被淋巴瘤细胞均匀包绕18。本文中，我们介绍一种利用光镊技术构建淋巴瘤-基质细胞杂合三维模型的实验方案。
三十多年前，Ashkin 首次报道了利用聚焦激光束非侵入性地捕获病毒和细菌的现象19。如今，光镊（OT）在生物医学领域的影响日益增强，涵盖细胞生物学研究20,21,22,23。光镊不仅可用于研究单个细胞的物理力学特性24,25,26，还可用于研究单细胞水平上的直接细胞-细胞相互作用，以及进一步的二维和三维细胞排列与结构构建27,28,29。光捕获技术基于电磁辐射（光子）在与物质相互作用时动量发生变化所产生的几皮牛顿量级的光力30。因此，通过使用一个或多个激光束，操作者可以选择性地操控微米和纳米尺度物体的位置、运动和动力学行为20。在实际应用中，光捕获技术能够选择性且非破坏性地捕获活细胞，并将其放置在另一个细胞或分子表面接触，从而触发黏附过程的启动31。利用上述功能，我们首先尝试将单个淋巴瘤细胞通过光学手段放置到一层基质细胞单层上，以研究其黏附特性。随后，我们进一步评估了光镊在实时模式下物理重建多细胞球体的能力33。为实现这一目标，逐个捕获单个淋巴瘤细胞，并将其附着到预先制备的三维基质细胞球体上。光捕获技术的另一应用是测量细胞-细胞间最小黏附时间，并评估抗癌治疗所引起的黏附变化的细微差异34,35。尽管三维模型在癌症研究中被广泛应用，但对球体形成早期阶段的研究仍然具有挑战性，这主要是由于目前缺乏能够在高精度操作的同时实现最小侵入性干预的方法。相反，光镊在三维细胞排列与结构构建方面的潜力尚未被充分挖掘。因此，本文逐步描述了一种结合标准三维技术与光镊操作的联合工作流程，用于构建三维淋巴瘤结构。重要的是，该方案可轻松适配于其他在血液病理学恶性肿瘤中具有重要意义的细胞类型。

<table><tbody><tr><td>&amp;micro;-型培养皿，35 mm，高玻璃底</td><td>IBIDI</td><td>81158</td><td></td></tr><tr><td>12-256 型微模具 3D 培养皿&amp;nbsp;</td><td>Microtissues Inc., RI, USA</td><td>12-256TR</td><td></td></tr><tr><td>3 &amp;micro;m 聚苯乙烯微球</td><td>Polysciences</td><td>17134-15</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD20 抗体（克隆 L26）</td><td>Dako</td><td>IS604</td><td></td></tr><tr><td>全自动细胞计数仪，EVE</td><td>NanoEntek</td><td>EVE/ EVE-MC</td><td></td></tr><tr><td>自动染色机 Link 48</td><td>Dako</td><td>D09634</td><td></td></tr><tr><td>相机&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>U-TV0.63XC</td><td></td></tr><tr><td>CelCulture CO2 培养箱</td><td>Esco Technologies, Inc.</td><td>CCL</td><td></td></tr><tr><td>细胞计数板，EVE</td><td>NanoEntek</td><td>NE-EVS</td><td></td></tr><tr><td>细胞系 HS-5</td><td>ATCC</td><td>CRL-3611</td><td></td></tr><tr><td>细胞系 Ri-1&amp;nbsp;</td><td>DSMZ&amp;nbsp;</td><td>ACC 585</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>BX43</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 程序</td><td>美国国立卫生研究院，MD，USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>活/死细胞染色试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液，pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>0.9% 氯化钠溶液，无菌</td><td>ITW ReITW Reagents, S.R.L.agents, S.R.L.</td><td>A1671</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液，0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express 酶（1X），无酚红</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红</td><td>Gibco</td><td>25300096</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 琼脂糖</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;光镊系统&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>二向色镜</td><td>Thorlabs</td><td>DMSP805R</td><td></td></tr><tr><td>数字相机</td><td>Mikrotron GmbH</td><td>MC1362</td><td></td></tr><tr><td>振镜式 XY 扫描系统</td><td>Thorlabs</td><td>GVS002</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>透镜 1</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-050-B-ML</td><td></td></tr><tr><td>透镜 2</td><td>Thorlabs</td><td>AC508-200-B-ML</td><td></td></tr><tr><td>Nd:YAG 1064 nm 激光器</td><td>Laser Quantum</td><td>Ventus</td><td></td></tr></tbody></table>

使用光镊技术生成杂合类球体

Using Optical Tweezers for the Generation of Hybrid Spheroids

二维（2D）细胞培养仍然是临床前癌症研究中最常用的模型之一。然而，三维（3D） 体外 模型似乎用于评估 体内 更准确地模拟环境，包括更贴近实际的结构形态、微环境以及对药物的反应。
光镊技术&#160;使用一个或多个聚焦激光束，以非侵入方式操控纳米和微米尺度结构的位置、运动、相互作用及动态行为。光镊（OT）在细胞生物学中已有广泛应用，但其在癌症研究中的潜力仍被低估。本文推荐一种利用光镊进行淋巴瘤-基质细胞球体形成的非侵入性实验方案。该方法不仅可构建杂合细胞球体 从头合成 但还能控制附着细胞的数量以及黏附形成的时间，为组织工程提供了重要的信息来源。此外，光镊技术（OT）能够研究杂合类球体形成的早期阶段，这是常规的群体性技术所无法实现的。尤为重要的是，该模型可用于研究抗癌药物诱导的黏附微小变化。本方案可轻松应用于其他细胞类型。

我们之前的研究结果表明，间充质基质细胞与淋巴瘤细胞共培养时，会形成均一的基质核心，癌细胞可均匀地附着于其上18。在本研究中，我们利用自行构建的光镊成功构建了由间充质基质细胞和淋巴瘤细胞组成的人源杂合类球体。图2B展示了光学显微镜下典型的类球体图像，这是光镊系统的重要组成部分。而图2C则显示了使用抗CD20抗体对杂合类球体进行的免疫组织化学染色结果37。CD20是B细胞常见的标志物，在大多数B细胞上均有表达。在构建杂合类球体所用的淋巴瘤细胞中，所有细胞均表达CD20抗原并呈棕褐色染色，而基质细胞则为CD20阴性。
构建杂合类球体的第一步是使用上述详细方案制备间充质基质细胞类球体。将HS-5细胞系的间充质基质细胞接种于琼脂糖微模具中，在37 °C标准条件下培养72小时后，形成形状较为均一的球形类球体，如图3A和<strong class="...

本文提出了一种利用光镊制造杂合类球体的实验方案。该方法能够精确控制类球体形成过程的早期阶段，这是其他方法所无法实现的。

二维（2D）细胞培养仍是临床前癌症研究中最常用的模型之一。然而，三维（3D）体外……

光镊技术利用聚焦激光束以非侵入方式对微米和纳米尺度的物体进行物理捕获和操控。该工具目前已成功应用于多种生物结构，包括细胞切割。本实验室旨在研究单细胞水平上的直接细胞间相互作用，并进一步利用光镊等前沿技术对这种侧向排列和结构进行处理。首先，当前的实验挑战在于缺乏利用光镊技术完成整个过程的杂合类球体构建方案。其次是杂合类球体中新结构的稳定化，以及将其回收用于后续实验处理的问题。在本方案中，我们将逐步演示如何利用光镊技术构建杂合性淋巴瘤类球体。该技术的主要优势在于能够实时研究淋巴瘤细胞与三维微环境之间的直接相互作用，相较于传统细胞培养，其生物学相关性更高。重要的是，本文所展示的技术可轻松适用于白血病细胞系及其他血液系统恶性疾病。我们计划利用该方法研究抗癌药物诱导的单个细胞黏附发生的微小变化。我们将利用患者的肿瘤谱系来实现这一目的。首先准备微型模具。用去离子水冲洗微型模具三维培养皿，并将其置于紫外灯下照射30分钟以进行消毒。首先，将琼脂糖粉末溶于0.9%氯化钠溶液中，使用微波炉制备2%琼脂糖溶液。在混合或移液过程中避免产生气泡。将琼脂糖冷却至约70摄氏度。接下来，通过将500微升琼脂糖加入预先灭菌的微模具中来制备水凝胶。使用移液器去除可能被困在微模具微小结构中的气泡。15分钟后，当琼脂糖完全凝固后，小心地将凝胶从微模具中取出，并转移至无菌的六孔板中。在进行下一步之前，需在显微镜下检查，确认凝胶已正确制备。将磷酸盐缓冲液完全覆盖微模具后，再将培养板置于紫外灯下照射30分钟以进行消毒。在使用基于琼脂糖的装置生成球状体之前，需用RPMI培养基完全覆盖凝胶以平衡凝胶状态，并孵育至少15分钟。在标准条件下，将HS-5间充质基质细胞系接种于RPMI完全培养基中进行培养，每48小时更换一次培养基。当细胞融合度达到90%时，移除培养基，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞，并使用胰蛋白酶将细胞从培养瓶底部消化下来。加入两毫升培养基以终止胰蛋白酶作用，然后将细胞转移至15毫升锥形管中。以300 × g离心7分钟。弃去上清液，并将细胞重悬于一毫升新鲜培养基中。使用台盼蓝溶液在自动细胞计数器中计数细胞，将细胞稀释至每毫升200,000个细胞。移除基于琼脂糖装置中的培养基。将190微升细胞悬液小心地接种到琼脂糖微模具的细胞接种室中。在37摄氏度下孵育30分钟，直至细胞沉降至凝胶底部。缓慢向凝胶外周加入4毫升额外培养基，完全覆盖凝胶。注意不要将培养基直接加在凝胶上，而应加入培养皿中，避免损伤新形成的球状体。在37摄氏度下培养72小时，直至形成均一的球状体。血液学细胞系在专为悬浮培养设计的培养瓶中的培养液中自由漂浮生长。为了保持细胞的最佳特性，建议在使用光镊进行酸性处理分配类球体前不超过30分钟开始准备样品。将细胞置于RPMI 1640培养基中，在标准培养条件下维持培养。每两到三天传代一次，使细胞密度维持在

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Research

科研

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Cancer Research

癌症研究

使用光镊生成混合球体

类球体是一种三维细胞培养模型，与二维细胞培养单层模型相比，能够更准确地模拟细胞的生存环境。在本示例实验方案中，我们将看到科研人员利用结直肠癌细胞系生成类球体，并通过活细胞成像技术追踪类球体的生长过程。...

从细胞系生成球状体：一种三维（3D）细胞培养方法

来源： Huang, Y. et. al., 利用光学相干断层扫描对三维肿瘤类器官进行纵向形态学与生理学监测。J. Vis. Exp.

利用光学相干断层扫描技术对肿瘤类球体进行形态学与生理学监测

本文介绍了一种通过细胞聚集快速形成三维细胞球体的灵活实验方案。该方法可轻松适用于多种细胞类型，适用于细胞迁移、侵袭或失巢凋亡检测，以及细胞-基质相互作用的成像与定量分析等多种应用。...

一种高效且灵活的细胞聚集法用于三维球状体的制备

光学相干断层扫描（OCT）是一种三维成像技术，可用于监测和表征多细胞肿瘤球体的生长动力学。本研究展示了基于体素计数法对肿瘤球体进行精确的体积定量分析，并利用内源性光学衰减对比实现无需标记的球体内坏死组织检测。...

利用光学相干断层扫描对三维肿瘤球体进行长期形态学与生理学监测

我们介绍一种由电机驱动的离心式微流控装置，可用于培养细胞球体。利用该装置，可在高重力条件下轻松共培养单一或多种细胞类型的球体。...

基于CD的实验室平台用于生成多细胞三维球体

本方案描述了利用标准荧光显微镜对球状体的氧合状态和细胞死亡进行多参数分析，从而实现用于生物打印的高通量球状体制备。该方法可用于控制球状体的活力并实现标准化，这对于构建三维组织、肿瘤微环境以及成功进行（微）组织生物制造具有重要意义。...

低成本氧气显微镜辅助的多细胞球体生物制造

本方案详细介绍了生成三种不同类型球状体的方法，这些球状体适用于大规模高内涵筛选与分析。此外，还提供了示例，展示如何在球状体水平和单个细胞水平对其进行分析。...

一种用于高内涵筛选与分析应用的类球体大规模生产的稳健方法

本方案描述了一种利用3D打印的印章式装置，以低成本大规模制备组织球体的技术。...

组织类球体的生成 通过 一种3D打印的印章状装置

肿瘤类球体正越来越多地被用于评估肿瘤细胞与微环境之间的相互作用以及治疗反应。本方案描述了一种利用快速光学透明化技术对三维肿瘤类球体进行半高通量成像的稳健且简便的方法。...

用于肿瘤类球体半高通量分析的快速光学透明化

本研究介绍了一种经济高效且简便的3D细胞结构制备方法，该方法采用基于印章的系统在琼脂糖模具中制备微孔。该系统可促进均一的类球体/类器官形成，从而增强细胞间相互作用。该方法降低了实验变异性，适用于药物筛选和组织工程等应用。...

利用新型印章装置从二维细胞培养生成三维球状体/类器官

了解如何使用光镊技术构建淋巴瘤混合球体，实现单细胞水平的精确操控与细胞间相互作用研究。该方法为三维细胞培养和组织工程提供了新的实验手段。

使用光镊技术生成杂合类球体

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