使用光镊生成混合球体

光镊允许仅使用聚焦激光束以非侵入性方式对微米和纳米级的物体进行物理捕获和纵。该工具现已成功应用于各种生物结构，包括切割细胞。我们的实验室旨在研究单细胞水平的直接细胞间相互作用，并使用光镊等有前途的技术进一步处理这种横向排列和结构。

首先，目前的实验挑战是缺乏在整个过程中使用光镊构建混合球体的协议。其次是稳定杂交球体中的新改革并检索它们以进行后续的实验处理。在该协议中，我们逐步演示了使用光镊构建混合淋巴瘤球体。

该技术的主要优点是有机会实时研究淋巴瘤细胞与三维微环境之间的直接相互作用，这比传统细胞培养更具生物学相关性。重要的是，这里介绍的技术可以很容易地适应白血病细胞系和其他血液病理恶性肿瘤。我们计划使用我们的方法来研究癌症药物诱导的单细胞粘附的微小变化。

我们打算为此目的使用患者的肿瘤谱系。首先准备微模具。用去离子水冲洗微模 3D 培养皿，并将其置于紫外线羊肉下 30 分钟以进行消毒。

首先，通过使用微波炉将琼脂糖粉末溶解在 0.9% 氯化钠溶液中来制备 2% 琼脂糖溶液。避免在混合或移液琼脂糖时产生气泡。将琼脂糖冷却至约 70 摄氏度。

接下来，通过用 500 微升琼脂糖填充先前灭菌的微模具来制备水凝胶。通过移液去除可能被困在微模具小特征中的任何气泡。15 分钟后，当琼脂糖凝固时，小心地将凝胶从微模具中取出到无菌 6 孔板中。

在进行下一步之前，请在显微镜下检查，确认凝胶已正确制备。加入完全覆盖微模具的磷酸盐缓冲盐水，然后将板置于紫外线灯下 30 分钟进行灭菌。在使用基于琼脂糖的装置生产球状体之前，将其完全覆盖在 RPMI 培养基中以平衡凝胶并孵育至少 15 分钟。

在标准条件下，在 RPMI 完全培养基中培养 HS-5 间充质基质细胞系，确保每 48 小时更换一次培养基。当细胞达到 90% 的汇合度时，去除培养基。用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞，并使用胰蛋白酶将其从培养瓶底部分离。

通过添加 2 mL 培养基终止胰蛋白酶，然后将其转移到 15 mL 锥形管中。以 300 倍重力离心细胞 7 分钟。去除上清液，将细胞重悬于 1 mL 新鲜培养基中。

使用 tryp 和蓝色溶液在自动计数器中计数细胞。将它们稀释至每毫升 200， 000 个细胞。从基于琼脂糖的装置中去除培养基。

小心地将 190 微升细胞悬液接种到琼脂糖微模具的细胞接种室中。在 37 摄氏度下孵育细胞 30 分钟，直到细胞沉淀在凝胶底部。在凝胶外部缓慢添加 4 mL 额外的培养基，将其完全覆盖。

切记不要将培养基直接添加到凝胶上，而应添加到培养皿中，以免损坏新形成的球状体。在 37 摄氏度下孵育 72 小时，直到形成均匀的球状体。血液细胞系在专为悬浮培养而设计的培养瓶中的培养基中自由漂浮生长。

为了保持最佳的细胞特性，建议在酸计费程序使用光镊分配球体之前不早于 30 分钟开始制备样品。在标准培养条件下将细胞保存在 RPMI 1640 培养基中。每 2 到 3 天传一次，将培养物保持在每毫升 300 到 500， 000 个细胞之间。

对于光镊中的作，请选择对数期的单元格。收集细胞并将所有悬浮液转移到 15 毫升试管中。以 300 倍重力离心细胞 7 分钟。

去除上清液并如前所述计数细胞。稀释悬浮液以达到每毫升 10， 000 个细胞的最终细胞密度。将细胞保持在 37 摄氏度，直到光学作。

我们在这里介绍的协议是专门为定制的光镊开发的。但是，商业系统正变得越来越容易获得。无论您的实验室使用何种类型的设备，系统制备的基本步骤和处理细胞的一般原则都是相同的。

打开显微镜光源。佩戴激光安全防护眼镜。打开激光器并将功率设置为 100 兆瓦。

在继续之前，请等待 10 分钟，让激光束稳定下来。同时，启动计算机软件。系统准备就绪后，向底部物镜中心加入 30 微升水。

将玻璃底的 35 毫米显微镜培养皿放在显微镜载物台上。用支架稳定培养皿。使用测微显微镜螺钉升高物镜，直到水珠接触到显微复制皿的玻璃底部。

使用千分尺螺钉轻轻调整载物台，直到屏幕上有清晰聚焦的激光束。在软件窗口中，您将看到显微镜样品的图像。使用屏幕上可见的标记将光阱移动到所需位置。

加入 100 微升先前制备的淋巴瘤细胞悬液。让它们沉到盘子的底部。这大约需要 5 分钟。

利用显微镜载物台的移动，找到一个漂浮的淋巴瘤细胞。通过单击陷印咒，让光阱击中样品。尝试将单元格移动到所需位置。

用于作的单元格应该能够轻松地向任何给定方向移动。用移液器吸头从琼脂糖模具中取出单个基质球体，并将其放在未涂层的玻璃底培养皿上。加入 2 毫升培养基，在 37 摄氏度下孵育 10 分钟。

在此期间，球体会轻轻地粘在玻璃上，从而防止作过程中的移动。将包含球体的培养皿放在显微镜载物台上。将 1000 个淋巴瘤细胞添加到 100 μL 培养基中。

让它们沉到盘子的底部，大约需要 5 分钟。选择一个淋巴瘤细胞并使用激光束捕获它。移动光阱，使细胞与基质球体表面接触。

首先将淋巴瘤细胞附着在基质球体上 10 秒钟。接下来，使用光镊反复尝试三次分离淋巴瘤细胞，检查细胞是否永久附着。如果细胞接触断开，请再次使用光阱将淋巴瘤细胞与球状体表面连接，这次需要更长的时间，大约 20 秒。

对随后的淋巴瘤细胞重复此过程，直到基质球体的整个表面被淋巴瘤细胞覆盖。通过使用显微镜测微螺钉改变成像平面，可以改变光阱的位置，从而使被陷落的物体更深入地移动到样品中。为了更好地表示自发形成的球状体，用两到三层淋巴瘤细胞覆盖基质细胞的核心。

轻轻去除培养基，直接用 100 μL 磷酸盐缓冲液溶质洗涤球体。将杂交球状体与 100 微升含有 1 微摩尔钙离子和 2 微摩尔乙锭同型二聚体-1 的 PBS 在 37 摄氏度下孵育 20 分钟。使用荧光显微镜观察球体并捕获图像。

在这里，我们成功地使用光镊重建了一个由间充质基质细胞和淋巴瘤细胞组成的人类杂交球体。首先，在琼脂糖微孔装置中制备间充质基质细胞球状体，孵育 72 小时后得到相对均匀的球状体。球体的活力高于 98%接下来，使用光镊将间充质球体用作新构建的杂交球体的核心。

淋巴瘤细胞被光阱单独捕获并附着在基质球体的表面。重复该过程，直到基质球体的整个表面被淋巴瘤细胞覆盖。我们确定 RI-1 细胞在 11.67 秒内附着在基质球体上，偏差为 3.73 秒。

在此过程中，连接了 65 个细胞，大约需要 1 小时 12 分钟。新设计的球体的活死染色显示用于作的细胞具有很高的活力，为 93%本文提出了一种使用光镊形成淋巴瘤基质细胞球体的非侵入性方案。这种方法不仅可以从头构建混合球体，还可以精确控制附着细胞的数量和粘附形成的时间，为组织工程提供有价值的见解。

此外，这种光镊方法有助于研究高风险球体形成的早期阶段，这是使用标准体技术无法实现的。最重要的是，我们的方案可以很容易地应用于其他细胞类型，这将使这种基于光镊的方法越来越多地用于 3D 细胞培养领域。