Name: 肝细胞癌全身和局部免疫反应的质谱流式细胞术分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 了解质谱流式细胞术分析肝细胞癌全身与局部免疫反应的方法。该技术可在单细胞水平同时检测14种以上标志物，识别14种不同免疫细胞类型，揭示肿瘤免疫逃逸机制，为个性化治疗提供潜在靶点。

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本工作得到中国国家重点研发计划（项目编号 2019YFA0803000，授予 J.S.）、浙江省杰出青年科学基金（项目编号 R22H1610037，授予 J.S.）、国家自然科学基金（项目编号 82173078，授予 J.S.）以及浙江省自然科学基金（项目编号 2022C03037，授予 J.S.）的资助。

血液和肝细胞癌样本采集、外周血单个核细胞（PBMCs）分离、单细胞解离及染色的步骤如下所述。实验所用试剂和材料均列于材料表中。所有实验均经浙江大学医学院附属第一医院伦理委员会批准，确保肿瘤样本的采集不影响病理诊断。所有受试者均签署了书面知情同意书。
1. 外周血单个核细胞的分离
<ol>
	<li>从肝细胞癌（HCC）患者的静脉中抽取血样，并使用含有抗凝剂的采血管以防止血液凝固。血样来自4名年龄在50-60岁之间的患者（2名男性和2名女性），平均年龄为55岁。对每位患者采集10-20 mL外周血，以确保有足够的体积用于后续外周血单个核细胞（PBMCs）的分离，同时尽量减少患者的不适。</li>
	<li>吸取特定体积的血液（例如6 mL），并加入等体积的外周血淋巴细胞分离液（Ficol-paque 或 Lymphoprep）至15 mL离心管中。 
	注意：总体积最好不超过12 mL，以留出足够空间进行充分混匀并防止溢出；15 mL离心管的最大推荐体积为14 mL。</li>
	<li>将离心管倾斜约45°，沿管壁缓慢加入血液，使血液轻柔地覆盖在淋巴细胞分离液上方，避免两层液体混合。 
	注意：可使用移液管沿管壁缓慢加样。</li>
	<li>将离心管放入离心机，设置加速度为8，减速度为3，在450 × g、4 °C条件下离心30分钟。离心后，试管中自上而下形成四层：血浆层、PBMCs层（白色膜层）、Ficol-Paque层以及红细胞与粒细胞层。</li>
	<li>用移液器小心吸取PBMCs层至新的无菌离心管中。加入三倍体积的磷酸盐缓冲液（PBS），在4°C、500 × g条件下离心5分钟。离心后，管底可见细胞沉淀。</li>
	<li>用移液器弃去上清液，加入1 mL含2%胎牛血清的磷酸盐缓冲液（2% FBS-PBS）重悬细胞，然后加入3 mL红细胞（RBC）裂解液。在4°C、500 × g条件下离心5分钟。</li>
	<li>确认管底无红细胞残留，表明红细胞已完全裂解。将细胞重悬于2% FBS-PBS中，可直接用于后续实验，或加入细胞冻存液后于-80°C保存2-3个月。 
	注意：一般建议每1 × 106&#160;个细胞使用0.5 mL的2% FBS-PBS进行重悬。细胞数量可通过血细胞计数板或自动细胞计数仪在台盼蓝染色后测定，以区分活细胞与死细胞。该比例有助于确保后续操作中细胞回收率和存活率的最佳状态。</li>
</ol>
2. 肿瘤组织细胞的分离
注意：肿瘤组织细胞的分离方法改编自 Song 等人22。
<ol>
	<li>在病理医生的指导下，切除肝细胞癌（HCC）后，使用无菌手术刀切取部分肿瘤组织。组织块大小应约为 1 cm3。用预冷的 1× PBS 冲洗掉表面染料。将组织浸入含有约 5 mL 添加 10% 胎牛血清（FBS）的 RPMI 1640 培养基的 15 mL 离心管中。将离心管置于冰上，并运送回实验室进行后续处理。</li>
	<li>用预冷的含 2% FBS 的 PBS 充分冲洗血液残留，并使用镊子手动去除脂肪结缔组织，以确保组织彻底清洁。将组织转移至含有消化液的组织培养处理培养皿中。用镊子固定肿瘤组织，并用手术刀将其切成小于 1 mm3&#160;的碎块。将组织消化液转移至 50 mL 离心管中，并继续添加消化液，直至总体积约为 15 mL。</li>
	<li>将含有组织消化混合物的离心管置于摇床中，倾斜或平放并固定，于 150 rpm、37 °C 条件下消化 1 小时。用 70 µm 滤网过滤消化液。
	<ol>
		<li>在此过程中，使用 1 mL 注射器活塞研磨组织碎片。用含 2% FBS 的 RPMI 1640 溶液冲洗滤网。收集滤液并转移至 15 mL 离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 4&#160;°C 条件下，以 500 × g 离心 5 分钟。离心后弃去上清液。小心地将沉淀重悬于约 10 mL 的 36% Percoll 溶液中。随后再次在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>用移液器轻轻吸取 1 mL 红细胞裂解缓冲液重悬细胞悬液。将悬液转移至新的 15 mL 离心管中，并加入红细胞裂解缓冲液使总体积达到 10 mL。室温静置 10 分钟。 
	注：使用新的离心管可防止管壁上的杂质重新进入细胞悬液，从而降低细胞得率下降的风险。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟，然后将细胞重悬于适当体积的含 2% FBS 的 PBS 中。一般建议，每 1 × 106&#160;个细胞使用 0.5 mL 含 2% FBS 的 PBS 进行重悬。 
	注：细胞计数通过台盼蓝染色后使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行，以区分活细胞与死细胞。重悬体积取决于后续实验所需的细胞数量。该比例有助于在后续操作中确保最佳的细胞回收率和存活率。</li>
</ol>
3. 顺铂染色
<ol>
	<li>分别取步骤 1.7 中获得的外周血单个核细胞（PBMCs）和步骤 2.6 中分离的肿瘤细胞各 3 × 106 个。细胞复苏后，用不含 Ca2+&#160;和 Mg2+ 的 1 mL PBS 重悬，加入顺铂（cisplatin）至终浓度为 0.5 µM，充分混匀，并在室温下孵育 2 分钟。 
	注意：顺铂染色用于根据细胞膜完整性区分死细胞与活细胞。膜完整性受损的死细胞会摄取顺铂并呈现阳性信号，而活细胞则不被染色23。细胞数量必须至少为 1 × 106 个。</li>
	<li>将离心管在室温下以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，然后向每个含有步骤 3.1 制备的细胞悬液的离心管中加入 1 mL 细胞染色缓冲液以终止反应。再次在室温下以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，并确保离心后细胞沉淀未沿管壁呈线性分布。</li>
</ol>
4. Fc 受体阻断
<ol>
	<li>为每个样本预先配制 50 µL 封闭液：将 48 µL 细胞染色缓冲液与 2 µL Fc 封闭溶液混合（细胞染色缓冲液 : Fc 封闭溶液 = 9 : 1）。</li>
	<li>将第 3.2 步中的细胞重悬于上述混合液中，在室温下孵育 10 分钟。</li>
</ol>
5. 膜蛋白抗体的孵育
<ol>
	<li>对于从步骤 4.2 获得的每种细胞样品，通过加入每种抗体 1.1 µL 的单位来配制膜蛋白抗体混合液，然后加入细胞染色缓冲液，使最终体积达到 55 µL。此时总体积约为 100 µL。 
	注意：该混合液包含针对关键膜蛋白的抗体，例如 CD163、CCR3、CD141、CD117 和 CD4524,25。这些抗体因其在识别膜蛋白标志物方面的特异性而被选用，并购自商业来源（详见材料表，包括克隆号、生产商和货号）。</li>
	<li>向每个管中的样品加入 50 µL 已配制的抗体混合液，使总体积达到 100 µL。轻轻混匀样品，并在室温下孵育 15 分钟。</li>
	<li>向每个样品中加入 2 mL 细胞染色缓冲液，在室温下以 500 x g 离心 5 分钟，弃去上清液。重复此步骤 2 次。</li>
	<li>弃去上清液，用剩余液体与细胞沉淀短暂涡旋振荡，以重悬并充分分散细胞。</li>
</ol>
6. 细胞核蛋白染色
<ol>
	<li>细胞完全重悬后，向第 5.4 步的每个样品中加入 500 µL 混合液（固定液：固定/透化液 = 3:1）。轻轻混匀样品，并在室温下孵育 30 分钟。</li>
	<li>用去离子水将透化缓冲液（10 倍浓度）稀释。孵育结束后，在室温下以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。每管加入 1000 µL 1 倍浓度的透化缓冲液以洗涤细胞。在室温下以 1,000 × g 离心 5 分钟，然后弃去上清液。</li>
	<li>用 1 倍浓度的透化缓冲液重悬抗体。弃去上清液，每管细胞中加入 50 µL 抗体混合液。轻轻吹打混匀细胞，然后在室温下孵育 30–45 分钟。</li>
	<li>每管加入 1000 µL 1 倍浓度的透化缓冲液，在室温下以 1,000 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>每管加入 1000 µL 细胞染色缓冲液以再次重悬细胞，在室温下以 1,000 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
</ol>
7. 细胞固定
<ol>
	<li>在 PBS 中配制 1.6% 的甲醛溶液，每个样本需要 1 mL。</li>
	<li>向 6.5 步骤中的每个样本加入 1 mL 1.6% 甲醛溶液，涡旋充分混匀，并在室温下孵育 10 分钟。 
	注意：虽然甲醛常用于细胞固定，但也可使用其他替代试剂，如 4% 多聚甲醛（PFA）或甲醇。固定剂的选择应根据实验的具体要求以及待观察的细胞特征而定。</li>
	<li>在室温下以 800 x g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
</ol>
8. 细胞核嵌入染色
<ol>
	<li>制备细胞嵌入液：将 Cell-ID 嵌入剂-铱（Ir）用固定和透化缓冲液稀释至终浓度为 125 nM。每个样本准备 1 mL 溶液。</li>
	<li>向步骤 7.3 中的每个固定样本加入 1 mL 上述制备的细胞嵌入液。轻轻混匀并立即涡旋振荡，以尽量减少细胞聚集体的形成。</li>
	<li>室温孵育 1 小时，或 4°C 过夜。在室温下以 500 g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
</ol>
9. 细胞悬液的制备
<ol>
	<li>向第8.3步的试管中加入1000 µL细胞染色缓冲液，在800 × g 条件下离心5分钟，弃去上清液。重复此步骤2次。</li>
	<li>加入450 µL至900 µL去离子水重悬细胞，经台盼蓝染色后使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。计数完成后，采用质谱流式细胞术进行数据采集与分析。</li>
</ol>
10. 质谱流式细胞术与数据分析
<ol>
	<li>使用 CyTOF 系统获取质谱流式细胞术数据，并将其保存为流式细胞术标准（FCS）文件。根据制造商的说明，确保仪器正确校准并执行质量控制，以减少背景噪声和批次效应。</li>
	<li>使用配套软件对 FCS 文件中的 CD45+ 细胞群进行预处理。根据细胞大小（前向散射，FSC）和颗粒度（侧向散射，SSC）去除碎片。通过连续设门 FSC-A/FSC-H 或 SSC-A/SSC-H 图排除双联体。利用活力染色（如顺铂排除法）去除死细胞。设门 CD45+ 群体以聚焦于免疫细胞，并导出设门后的细胞群用于进一步分析。</li>
	<li>使用 5 作为协因子对数据进行转换，并利用聚类软件识别主要聚类。基于“密度归一化事件的最小生成树进展分析”（SPADE）算法进行聚类，该算法将具有相似标志物表达谱的细胞归为同一聚类26。使用分层随机近邻嵌入（HSNE）进行降维并识别不同聚类26。</li>
	<li>在 R 软件中使用 cytofkit 软件包对主要聚类进行再聚类，以实现无监督聚类。使用 PhenoGraph 及其默认参数识别亚聚类。</li>
	<li>应用均匀流形近似与投影（UMAP）进行降维。使用 Wilcoxon 检验进行统计分析，将 P 值 &#60; 0.05 视为具有统计学显著性。使用 ggplot2 可视化结果。</li>
</ol>

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作者声明不存在利益冲突。

本研究利用质谱流式细胞技术，对肝细胞癌（HCC）的全身性及局部免疫应答进行深入分析。在此背景下应用质谱流式技术，能够在单细胞水平同时检测多种标志物，提供详细的免疫表型特征，这对于理解HCC复杂的免疫微环境至关重要。质谱流式技术通过实现高维度的单细胞分析，彻底改变了免疫学研究。该技术采用与抗体偶联的稀有金属同位素标签，可在一次实验中同时测量超过40个参数。这一能力在HCC研究中尤为有利，因为HCC的肿瘤微环境（TME）具有高度的细胞异质性以及复杂的免疫相互作用18,29。
与传统流式细胞术相比，质谱流式细胞术的一个显著优势在于其增强的多重检测能力。传统流式细胞术在使用荧光标记物时受限于光谱重叠问题，而质谱流式细胞术采用金属同位素作为标记，避免了这一限制。因此，可在无需复杂补偿算法的情况下，同时检测更多种类的标记物30。这一能力在肝细胞癌（HCC）研究中至关重要，因为全面分析多种免疫细胞群体及其状态，对于理解肿瘤与免疫系统...

肝细胞癌（HCC）是最常见的原发性肝癌，由于其高发病率和高死亡率，已成为一个重要的全球健康问题1。根据世界卫生组织的数据，HCC在全球范围内是第五大常见癌症，也是癌症相关死亡的第二大原因2。该疾病在乙型和丙型肝炎慢性感染率较高的地区尤为普遍，例如东亚和撒哈拉以南非洲3。主要危险因素包括病毒性肝炎、肝硬化和代谢综合征4。HCC需要长期治疗，给患者带来巨大的身体和经济负担，因此迫切需要有效的预防措施、早期检测手段以及创新的治疗策略5。
免疫系统在肝细胞癌（HCC）的发生发展中起着关键作用。肝脏是一个具有高度免疫活性的器官，富含多种免疫细胞，包括肝脏定居的巨噬细胞、自然杀伤（NK）细胞和T细胞，这些细胞对于监测和清除异常细胞至关重要6。然而，HCC可通过表达免疫抑制分子、募集免疫抑制性细胞以及改变肿瘤微环境来逃避免疫监视7,8。这种免疫逃逸不仅促进肿瘤的生长和转移，还影响机体对免疫治疗的反应9,10。
肿瘤微环境中的全身性与局部免疫反应是影响癌症进展和治疗效果的关键因素。全身性免疫反应涉及能够识别并攻击远处肿瘤细胞的循环免疫细胞，例如可靶向全身各处肿瘤细胞的外周T细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）和单核细胞。局部免疫反应则聚焦于肿瘤微环境内的免疫细胞活动，包括肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和调节性T细胞（Tregs）。其中，TILs通常对肿瘤细胞发挥细胞毒性作用，而TAMs和Tregs通常促进形成具有免疫抑制特性的微环境，从而支持肿瘤生长11,12。肿瘤细胞和基质细胞可重塑肿瘤微环境，以促进免疫抑制并逃避免疫监视。全身性与局部免疫反应之间的相互作用决定了抗肿瘤免疫的整体有效性11。深入理解这种相互作用有助于开发更有效的免疫治疗策略。
传统的流式细胞术和免疫组织化学技术虽然在免疫学研究中被广泛应用，但在分析复杂的免疫微环境时存在显著局限性，因其无法进行全面且高维度的分析。流式细胞术在单细胞水平上检测表面标志物和功能标志物方面具有高度有效性；然而，其同时进行多标志物分析的能力受到限制，通常受限于光谱重叠以及可使用荧光标记数量的实际约束13,14。另一方面，免疫组织化学可提供特定标志物在组织背景中的重要信息，但同样受限于可分析标志物数量有限，以及难以实现可靠、定量且高维度评估的固有困难15。
为了有效表征复杂的免疫环境，高维技术（如质谱流式细胞术，即飞行时间质谱细胞术 [CyTOF]）至关重要。质谱流式细胞术是一种先进技术，利用质谱分析单个细胞中的多种蛋白质标志物。它能够在单细胞水平上进行多参数分析，避免了传统流式细胞术中存在的光谱重叠问题16。通过使用金属标记的抗体，该技术可同时检测数十种标志物，从而全面且无偏倚地揭示细胞表型与功能状态17。例如，Gadalla 等人开发了一个包含40多个参数的 CyTOF 检测 panel，用于外周血单个核细胞（PBMC）和肿瘤组织的分析，展示了其在高维免疫表型分析中的优势18。传统的流式细胞术由于可检测参数数量有限，无法识别这些具有独特表型的稀有细胞群体。相比之下，质谱流式细胞术实现了对这些细胞功能状态的全面评估，提供了更详细、更可靠的表征结果。Behbehani 等人利用质谱流式细胞术分析骨髓增生异常综合征（MDS）患者的骨髓样本，成功识别并表征了罕见的异常造血祖细胞18。质谱流式细胞术能够同时检测超过40种表面及胞内标志物，显著提高了对这些低频细胞亚群的检出能力19。这些能力突破了传统技术的局限，为深入理解免疫微环境提供了新的视角，推动了免疫学研究和治疗策略的发展。在单细胞水平上全面解析细胞表型与功能的能力，极大地促进了对免疫学过程的理解，并有助于靶向治疗策略的开发。
质谱流式细胞术通过同时检测多种蛋白质标志物，可全面揭示肝细胞癌（HCC）中系统性和局部的免疫细胞群体。该技术能够区分肿瘤微环境中不同类型的T细胞，例如效应T细胞、调节性T细胞（Tregs）和耗竭T细胞，阐明其在肿瘤进展中的特定作用。利用质谱流式细胞术，研究人员可识别与HCC预后相关的免疫标志物20。例如，程序性死亡蛋白1（PD-1）高表达的T细胞亚群可作为预测患者对免疫检查点抑制剂治疗反应的指标21。此外，该技术有助于发现新的治疗靶点，通过鉴定特定的免疫抑制分子，为个体化治疗策略的制定提供依据。该技术具备多标志物检测能力和单细胞分辨率，特别适用于发现新的治疗靶点并设计联合免疫治疗方案。这一先进方法通过深入解析免疫微环境，推动个体化治疗干预的发展，在改善HCC患者治疗效果方面具有重要意义。
本研究旨在利用质谱流式细胞技术分析肝细胞癌（HCC）患者的全身及局部免疫细胞谱。研究目标包括表征免疫细胞群体，将这些特征与临床结局及治疗反应相关联，并鉴定与HCC预后相关的特异性免疫标志物和细胞亚群。通过阐明各类免疫细胞在治疗反应中的作用，本研究力图为个体化治疗策略提供依据。研究结果有望优化现有的免疫治疗方案，并为开发新的治疗方法提供有价值的见解，最终旨在提高HCC患者的总体生存率和生活质量。

<table><tbody><tr><td>1&amp;times;PBS</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>10&amp;times;PBS</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>100 mm&amp;times;20 mm 经组织培养处理的培养皿</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>1000 µL 移液器吸头</td><td>Rainin</td><td>30389218</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>NEST</td><td>601052</td><td></td></tr><tr><td>200 µL 移液器吸头</td><td>Rainin</td><td>30389241</td><td></td></tr><tr><td>40 µm 尼龙细胞筛/70 µm 尼龙细胞筛</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>NEST</td><td>602052</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m 注射器滤器</td><td>Sangon Biotech</td><td>F613462-9001</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CCR2 抗体（克隆：K036C2）</td><td>BioLegend</td><td>357224</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CCR3 抗体（克隆：5E8）</td><td>BioLegend</td><td>310724</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CCR7 抗体（克隆：G043H7）</td><td>BioLegend</td><td>353240</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD103 抗体（克隆：Ber-ACT8）</td><td>BioLegend</td><td>350202</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD115 抗体（克隆：9-4D2-1E4）</td><td>BioLegend</td><td>347314</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD117 抗体（克隆：104D2）</td><td>BioLegend</td><td>313201</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD11b 抗体（克隆：1CRF44）&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>562721</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD11c 抗体（克隆：B-ly6）&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>563026</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD123 抗体（克隆：6H6）</td><td>BioLegend</td><td>306002</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD127 抗体（克隆：A019D5）</td><td>BioLegend</td><td>351337</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD13 抗体（克隆：WM19）</td><td>BioLegend</td><td>301701</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD138 抗体（克隆：MI15）</td><td>BioLegend</td><td>356535</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD14 抗体（克隆：HCD14）</td><td>BioLegend</td><td>325604</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD141 抗体（克隆：M80）</td><td>BioLegend</td><td>344102</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD15 抗体（克隆：QA19A61）</td><td>BioLegend</td><td>376302</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD16 抗体（克隆：B7311）&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>561313</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD161 抗体（克隆：HP-3G10）</td><td>BioLegend</td><td>339902</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD163 抗体（克隆：GHI/61）</td><td>BioLegend</td><td>333603</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD169 抗体（克隆：7-239）</td><td>BioLegend</td><td>346002</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD19 抗体（克隆：HIB19）</td><td>BioLegend</td><td>302226</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD1c 抗体（克隆：L161）</td><td>BioLegend</td><td>331501</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD20 抗体（克隆：2H7）</td><td>BioLegend</td><td>302301</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD206 抗体（克隆：15-2）</td><td>BioLegend</td><td>321151</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD24 抗体（克隆：ML5）</td><td>BioLegend</td><td>311129</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD25 抗体（克隆：BC96）</td><td>BioLegend</td><td>302624</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD3 抗体（克隆：UCHT1）&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>555916</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD31 抗体（克隆：W18200D）</td><td>BioLegend</td><td>375902</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD32 抗体（克隆：FUN-2）</td><td>BioLegend</td><td>303232</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD326 抗体（克隆：CO17-1A）</td><td>BioLegend</td><td>369812</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD33 抗体（克隆：WM53）</td><td>BioLegend</td><td>303402</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD4 抗体（克隆：L200）&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>563094</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD45 抗体（克隆：HI30）&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>563716</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD45RO 抗体（克隆：UCHL1）</td><td>BioLegend</td><td>304220</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD56 抗体（克隆：5.1H11）</td><td>BioLegend</td><td>362510</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD64 抗体（克隆：S18012C）</td><td>BioLegend</td><td>399502</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD66b 抗体（克隆：6/40c）</td><td>BioLegend</td><td>392917</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD68 抗体（克隆：Y1/82A）</td><td>BioLegend</td><td>333808</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD69 抗体（克隆：FN50）</td><td>BioLegend</td><td>310902</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD7 抗体（克隆：4H9/CD7）</td><td>BioLegend</td><td>395602</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD8 抗体（克隆：RPA-T8）&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>557750</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD80 抗体（克隆：W17149D）</td><td>BioLegend</td><td>375402</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD86 抗体（克隆：BU63）</td><td>BioLegend</td><td>374202</td><td></td></tr><tr><td>抗人 FOXP3 抗体（克隆：206D）</td><td>BioLegend</td><td>320101</td><td></td></tr><tr><td>抗人 HLA_ABC 抗体（克隆：W6/32）</td><td>BioLegend</td><td>311426</td><td></td></tr><tr><td>抗人 HLA-DR 抗体（克隆：L243）</td><td>BioLegend</td><td>307650</td><td></td></tr><tr><td>抗人 IgD 抗体（克隆：IA6-2）</td><td>BioLegend</td><td>348211</td><td></td></tr><tr><td>抗人 Ki67 抗体（克隆：Ki-67）</td><td>BioLegend</td><td>350501</td><td></td></tr><tr><td>抗人 PD_L2 抗体（克隆：MH22B2）</td><td>BD</td><td>567783</td><td></td></tr><tr><td>抗人 PD1 抗体（克隆：EH12.2H7）</td><td>BioLegend</td><td>329951</td><td></td></tr><tr><td>抗人 PDL1 抗体（克隆：MIH2）</td><td>BioLegend</td><td>393602</td><td></td></tr><tr><td>抗人 TCR-&amp;gamma;&amp;delta; 抗体（克隆：B1）&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>740415</td><td></td></tr><tr><td>细胞冻存液</td><td>Thermo Fisher</td><td>A2644601</td><td></td></tr><tr><td>Cell-ID 铂试剂</td><td>Standard BioTools</td><td>201064</td><td></td></tr><tr><td>Cell-ID 铱嵌入剂</td><td>Standard BioTools</td><td>201192A</td><td></td></tr><tr><td>IV 型胶原酶</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>恒温振荡器</td><td>FAITHFUL</td><td>FS-50B</td><td></td></tr><tr><td>CyTOF 系统</td><td>Fluidigm Corporation</td><td>Helios</td><td></td></tr><tr><td>Cytosplore</td><td>Cytosplore Consortium</td><td>2.3.1</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Gibco</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Merck</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>EQ 四元素校准微球</td><td>Standard BioTools</td><td>201078</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>Cytiva</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette</td><td>Thermo Scientific</td><td>4700870</td><td></td></tr><tr><td>固定缓冲液</td><td>Thermo Scientific</td><td>FB001</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>BD Life Sciences</td><td>10.1</td><td></td></tr><tr><td>甲醛溶液</td><td>Thermo Scientific</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>颗粒酶 B 抗体，抗人/小鼠（克隆：QA16A02）</td><td>BioLegend</td><td>396413</td><td></td></tr><tr><td>肝素抗凝管</td><td>BD</td><td>367874</td><td></td></tr><tr><td>人 BD Fc 封闭液 2.5 mg/mL</td><td>BD</td><td>564220</td><td></td></tr><tr><td>MACS 组织保存液</td><td>Miltenyi</td><td>130-100-008</td><td></td></tr><tr><td>Maxpar 固定与破膜缓冲液</td><td>Standard BioTools</td><td>201067</td><td></td></tr><tr><td>Maxpar 金属偶联抗体</td><td>Standard BioTools</td><td>Various</td><td></td></tr><tr><td>Maxpar PBS</td><td>Standard BioTools</td><td>201058</td><td></td></tr><tr><td>Maxpar 水</td><td>Standard BioTools</td><td>201069</td><td></td></tr><tr><td>Maxpar 细胞染色缓冲液</td><td>Standard BioTools</td><td>201068</td><td></td></tr><tr><td>金属偶联抗人 &amp;alpha;-SMA 抗体（克隆：1A4）</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-145</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Merck</td><td>P4937-500ML</td><td></td></tr><tr><td>破膜缓冲液</td><td>Thermo Scientific</td><td>00833356</td><td></td></tr><tr><td>红细胞裂解液</td><td>BD</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>冷冻离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5910ri</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基&amp;nbsp;</td><td>GE HealthCare</td><td>SH30027.0</td><td></td></tr><tr><td>手术刀</td><td>APPLYGEN</td><td>TB6298-1</td><td></td></tr><tr><td>无菌巴斯德移液管</td><td>ZDAN</td><td>ZD-H03</td><td></td></tr><tr><td>组织消化液</td><td>Yeasen Biotech</td><td>41423ES30</td><td></td></tr><tr><td>调谐液</td><td>Standard BioTools</td><td>201072</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>Thermo Scientific</td><td>88882012</td><td></td></tr></tbody></table>

肝细胞癌中系统性与局部免疫应答的质量细胞术分析

Mass Cytometry Analysis of Systemic and Local Immune Responses in Hepatocellular Carcinoma

肝细胞癌（HCC）是全球最常见且致死率最高的肝癌类型之一。尽管治疗手段不断进步，但由于遗传、环境和免疫因素之间复杂的相互作用推动了疾病进展，HCC患者的预后仍然较差。了解HCC的免疫图谱对于开发有效的治疗策略至关重要，尤其是在免疫治疗领域，该领域在改善患者预后方面具有巨大潜力。本研究采用质谱流式细胞术（飞行时间质谱流式细胞术 [CyTOF]）技术，研究HCC患者体内的全身性及局部免疫应答。通过分析外周血和肿瘤样本，旨在鉴定与HCC进展相关的独特免疫细胞亚群及其功能状态。研究结果全面揭示了HCC中的免疫微环境特征，突出了潜在的生物标志物和治疗靶点。该方法为深入理解HCC背后的免疫机制提供了宝贵见解，并为开发更有效的免疫疗法奠定了基础。

为了阐明与肝细胞癌（HCC）相关的免疫学特征，本研究对免疫细胞群体进行了全面分析。研究人员收集了4名肝细胞癌患者的配对外周血单个核细胞（PBMCs）及HCC组织样本，并利用两组针对PBMCs和HCC组织样本的抗体组合，通过质谱流式细胞技术在单细胞蛋白质组水平上对免疫细胞群体进行了分析。
质控后，共有 45,326 个细胞被纳入质谱流式细胞分析。采用 PhenoGraph 聚类算法结合 t-SNE 方法生成二维图谱，并将细胞划分为不同的表型。主要免疫细胞亚群根据谱系标志物进行鉴定，包括 CD3（T 细胞）、CD4（CD4+ T 细胞）、CD8（CD8+ T 细胞）、CD56（NK 细胞）、CD19（B 细胞）和 CD14（单核细胞）27,28。免疫细胞簇通过质谱流式细胞技术进行表征。
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本方案概述了一种全面的质谱流式细胞术（飞行时间质谱流式细胞术 [CyTOF]）分析方法，用于评估肝细胞癌（HCC）中的全身性及局部免疫应答。该方法旨在揭示HCC的免疫图谱，深入理解肿瘤微环境及其相关的免疫机制。

肝细胞癌（HCC）是全球最常见的、致死率最高的肝癌类型之一。尽管治疗手段已取得进展，但其预后仍然...

质谱流式细胞术使我们能够分析肝细胞癌中的系统性和局部免疫应答。通过在单细胞水平上对免疫细胞进行图谱分析，我们可识别与肿瘤进展相关的独特细胞亚群及其功能状态，从而揭示免疫逃逸机制，并为个体化治疗提供潜在的治疗靶点。本方案采用质谱流式细胞术在单细胞水平上同时分析超过14种标志物，避免了传统流式细胞术中存在的光谱重叠问题。该方法可精确识别真实的细胞群体，并提供高维数据，用于深入的免疫图谱绘制和生物标志物发现。[旁白] 首先，解冻冻存的外周血单个核细胞和肝癌细胞悬液。细胞复苏后，将细胞重悬于1毫升不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）中。加入顺铂至终浓度为0.5微摩尔（μM），充分混匀，并在室温下孵育2分钟。为终止反应，将离心管在室温下以500 × g离心5分钟。弃去上清液，然后向每管中加入1毫升细胞染色缓冲液。再次离心后，小心弃去上清液。为进行Fc受体阻断，首先为每个样本配制50微升（μL）阻断液：将48微升细胞染色缓冲液与2微升Fc阻断液混合。将细胞沉淀重悬于阻断液中，并进行孵育。接下来，为每个样本在标记好的离心管中加入1.1微升每种抗体，以配制膜蛋白抗体混合液。用细胞染色缓冲液补足体积至55微升。将50微升配制好的抗体混合液转移至每个样本管中，使总体积达到100微升。然后轻轻涡旋混匀样本，于室温孵育15分钟。向每个样本管中加入1毫升细胞染色缓冲液。在室温下以500 × g离心5分钟，弃去上清液。最后一次洗涤后，用剩余液体与细胞沉淀短暂涡旋，以充分重悬细胞。对于核蛋白染色，向重悬的细胞中加入500微升固定液混合物。轻轻混匀样本，在室温下孵育30分钟。孵育结束后，在室温下以500 × g离心5分钟，弃去上清液。接着，向每管中加入1000微升破膜缓冲液以洗涤细胞。然后在室温下以1000 × g离心5分钟。弃去上清液后，向每管中加入50微升抗体混合液。轻轻吹打混匀细胞，充分混匀后进行孵育。接下来，向每管中加入1000微升破膜缓冲液，再次离心后弃去上清液。为固定细胞，向每个样本管中加入1毫升用PBS配制的1.6%甲醛溶液，并涡旋以充分混匀内容物。室温孵育10分钟后，离心样本并弃去上清液。对于核嵌入染色，首先用固定和破膜缓冲液稀释Cell-ID Intercalator Iridium。向每个样本中加入1毫升嵌入染色液。轻轻混匀并涡旋。将样本置于4°C过夜，然后按前述方法离心。孵育完成后，向离心管中加入1000微升细胞染色缓冲液。以800 × g离心5分钟，弃去上清液。最后，将细胞重悬于450至900微升去离子水中。在进一步分析前，用台盼蓝染色进行细胞计数。首先，开启质谱流式细胞仪并启动程序。在CyTOF系统中分析样本，获取外周血单个核细胞和肝癌细胞样本的质谱流式数据。在仪器上启动数据处理软件，对FCS文件中的CD45+细胞群进行预处理。然后利用活力染色（如顺铂排除法）去除死细胞。圈选CD45+细胞群以聚焦于免疫细胞，并导出该门控细胞群用于进一步分析。使用5作为协因子对数据进行转换。接下来，启动聚类软件，基于SPADE算法识别主要细胞簇，将具有相似标志物表达谱的细胞归为同一簇。应用分层随机邻域嵌入（HSNE）进行降维并识别不同细胞簇。然后使用软件中的CyTOF工具包对主要细胞簇进行再聚类。使用PhenoGraph程序在默认参数下识别亚簇。在外周血单个核细胞样本中总共鉴定出14种不同的细胞类型。每种14种细胞类型的标志物表达模式在热图中详细展示，显示出不同细胞群独特的表达谱。这些细胞类型的分布因样本而异：样本D中CD4+ T细胞比例较高，样本A和B中B细胞显著富集，而CD141+传统树突状细胞主要存在于样本C中。在组织样本中鉴定出8种细胞类型，包括单核细胞、T细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞、B细胞、浆细胞样树突状细胞、嗜酸性粒细胞和髓系树突状细胞。组织细胞类型的标志物表达谱显示每种细胞群具有不同的表达模式。所有患者组织样本中细胞类型的比例保持一致，反映出肝细胞癌共有的免疫学特征。

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肝细胞癌全身和局部免疫反应的质谱流式细胞术分析

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2-dGuo处理胸腺器官培养物的制备

了解质谱流式细胞术分析肝细胞癌全身与局部免疫反应的方法。该技术可在单细胞水平同时检测14种以上标志物，识别14种不同免疫细胞类型，揭示肿瘤免疫逃逸机制，为个性化治疗提供潜在靶点。

肝细胞癌中系统性与局部免疫应答的质量细胞术分析

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