肝细胞癌全身和局部免疫反应的质谱流式细胞术分析
2025年4月25日
该方案概述了一种全面的质谱细胞术（通过飞行时间 [CyTOF] 进行细胞术）分析方法，用于评估肝细胞癌 （HCC） 中的全身和局部免疫反应。该方法旨在深入了解 HCC 的免疫景观，从而更深入地了解肿瘤微环境和相关的免疫机制。
质谱细胞术使我们能够分析肝细胞癌的系统和局部免疫反应。通过在单细胞水平上分析免疫细胞，我们识别了与肿瘤进展相关的独特亚群和功能状态，从而深入了解免疫逃逸机制和个性化治疗的潜在治疗靶点。我们的方案使用质谱细胞术在单细胞水平上同时分析超过 14 个标记物，避免了传统流式细胞术中出现的光谱重叠。这涉及对真实细胞群的精确识别，并为详细的免疫分析和生物标志物发现提供高维数据。
[旁白]首先，解冻冷冻的外周血单核细胞和肝癌细胞悬液。细胞回收后，将细胞重悬于一毫升不含钙和镁的PBS中。加入顺铂至终浓度为0.5微摩尔，充分混合，在室温下孵育两分钟。要停止反应，请在室温下以500 G离心管5分钟。弃去上清液，然后向每个试管中加入一毫升细胞染色缓冲液。再次离心后，小心地丢弃上清液。要进行FC受体阻断，首先，为每个样品准备50微升的块混合物，将48微升细胞染色缓冲液与2微升FC封闭溶液混合。将细胞沉淀重悬于块混合物中并孵育。接下来，将每个样品 1.1 微升每种抗体加入标记管中，以制备膜蛋白抗体混合物。用细胞染色缓冲液将体积增加到 55 微升。将 50 微升制备的抗体混合物转移到每个样品管中，使总体积达到 100 微升。然后轻轻旋转样品混合，然后在室温下孵育 15 分钟。向每个样品管中加入一毫升细胞染色缓冲液。在室温下以500G离心5分钟，然后弃去上清液。最后一次洗涤后，用细胞沉淀短暂涡旋剩余的液体，以彻底重悬细胞。对于细胞核蛋白染色，将 500 微升混合固定溶液添加到重悬的细胞中。在室温下孵育 30 分钟之前轻轻混合样品。孵育后，在室温下以500G离心5分钟，弃去上清液。接下来，将 1000 微升透化缓冲液移液到每个管中以洗涤细胞。然后在室温下以1000 G离心管五分钟。弃去上清液后，将 50 微升抗体混合物加入每个管中。在孵育前轻轻移液细胞以彻底混合。接下来，将 1000 微升透化缓冲液移液到每个管中，再次离心，然后弃去上清液。要固定细胞，请将一毫升在PBS中制备的1.6%甲醛加入每个样品管中，并涡旋以充分混合内容物。在室温下孵育10分钟后，离心样品并弃去上清液。对于核插层染色，首先用固定和透化缓冲液稀释 Cell-ID 插层铱。将一毫升插层溶液移液到每个样品中。轻轻混合并涡旋。将样品置于4摄氏度过夜，然后像以前一样离心。孵育完成后，将 1000 微升细胞染色缓冲液移液到试管中。将试管以 800 G 离心五分钟，然后弃去上清液。最后，将细胞重悬于450至900微升去离子水中。在进一步分析之前，用台盼蓝染色细胞进行细胞计数。首先，打开质谱细胞仪并启动程序。分析CyTOF系统中的样品，获取外周血单核细胞和肝癌细胞样品的质谱细胞术数据。在仪器上启动数据处理软件，并在 FCS 文件中预处理 CD45+ 细胞群。然后，使用活力染色（例如顺铂排除）消除死细胞。将 CD45+ 群体门控以专注于免疫细胞，并导出门控群体以进行进一步分析。使用协因子为 5 对数据进行变换。接下来，启动聚类软件并根据SPADE算法识别主要聚类，将具有相似标记表达谱的细胞分组为聚类。应用分层随机邻域嵌入 （HSNE） 进行降维和识别不同聚类。 然后使用我们软件中的 CyTOF 试剂盒包对主要集群进行重新聚类。使用PhenoGraph程序识别具有默认参数的子聚类。在外周血单核细胞样本中总共鉴定出 14 种不同的细胞类型。热图中详细说明了 14 种细胞类型中每种细胞的标记表达模式，显示了不同细胞群的独特表达谱。这些细胞类型的分布在不同样品中有所不同，样品 D 具有较高比例的 CD4 T 细胞，样品 A 和 B 显示出显着富集的 B 细胞，以及 CD141+，常规树突状细胞，主要存在于样品 C 中。在组织样品中鉴定出八种细胞类型，包括单核细胞、T 细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞、 B 细胞、浆细胞样树突状细胞、嗜酸性粒细胞和髓系树突状细胞。组织细胞类型的标记表达谱指示每个细胞群的不同模式。组织样本显示所有患者的细胞类型比例一致，反映了与肝细胞癌的共同免疫学特征。
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概述
本协议概述了一种质谱细胞术（CyTOF）分析方法，用于评估肝细胞癌（HCC）的全身和局部免疫反应。通过在单细胞水平上分析免疫细胞，该方法推进了对与肿瘤进展相关的免疫景观和机制的理解。
关键研究组成部分
研究领域
- 肝细胞癌中的免疫反应
- 单细胞免疫分析
- 个性化治疗策略
背景
- 了解肿瘤中的免疫逃逸
- 免疫景观分析的重要性
- 质谱细胞术在癌症研究中的应用
使用的方法
- 使用质谱细胞术分析免疫细胞
- 肝细胞癌样本
- 同时识别多种标记
主要结果
- 在PBMC样本中发现14种不同的细胞类型
- 识别各种免疫细胞的独特表达谱
- 对HCC患者的免疫反应进行表征
结论
- 本研究证明了质谱细胞术在HCC中进行深入免疫分析的实用性。
- 研究结果增进了对肿瘤-免疫相互作用的理解，并可能为治疗方法提供参考。
常见问题
Executive Industry Relevance
Mass cytometry enables high-dimensional, single-cell immune profiling in hepatocellular carcinoma (HCC), addressing the challenge of characterizing complex tumor-immune interactions. This approach enhances predictive confidence in identifying immune cell subsets and functional states relevant to disease progression and therapeutic targeting. Integrating systemic and local immune landscape data supports risk-adjusted portfolio decisions in immuno-oncology R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables detailed interrogation of immune cell heterogeneity and functional states in HCC.
- Supports identification of immune evasion mechanisms and potential therapeutic targets.
- Facilitates biological de-risking by clarifying immune pathway involvement in tumor progression.
- Improves predictive confidence for target selection and validation in immunotherapy pipelines.
Screening & Assay Development
- Provides validated, quantitative immune cell marker panels for downstream screening workflows.
- Enables reproducible, high-throughput analysis of immune cell populations across patient samples.
- Supports assay standardization and scalability for immune profiling in translational studies.
- Delivers robust data for evaluating compound effects on specific immune subsets.
Translational & Preclinical Research
- Aligns immune profiling outputs with disease-relevant biomarkers for translational continuity.
- Enables comparison of systemic and tumor-local immune responses to inform preclinical models.
- Supports risk-adjusted advancement of immunotherapeutic candidates based on mechanistic insights.
- Facilitates identification of shared immunological features across patient cohorts for biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
This mass cytometry workflow bridges early discovery, target validation, and translational research by providing high-resolution immune landscape data in HCC.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on immune cell involvement and pathway activity in tumor progression.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible immune cell marker data for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides high-dimensional readouts and clustering outputs for robust comparison of immune profiles across samples.
- Translational Research: Aligns immune cell signatures with disease state and biomarker strategies for preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable platform for immune profiling across oncology indications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune-oncology research.
- Operational Value: Standardizes immune profiling workflows and enhances reproducibility across studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation in immunotherapy development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and candidates based on immune landscape data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mass cytometry operation and high-dimensional data analysis.
- Demands access to CyTOF instrumentation and advanced computational tools for clustering and visualization.
- Necessitates standardized protocols for sample preparation and marker panel validation.
- May require adaptation for different tumor types or immune contexts based on marker selection.
- Dependent on robust cross-team collaboration for data interpretation and integration.
