利用iChip技术分离土壤微生物

我们正致力于发现新型化学方法以对抗农业病原体。利用iChip技术，我们分离出了新的微生物，希望这些微生物能够带来新的化学物质。通过测试这些微生物和/或其天然产物对农业病原体的作用，有望发现新的生物农药候选微生物和/或化合物。

芯片法（iChip）通过提供一段驯化期并使微生物与其自然环境接触，使我们能够分离在常规条件下无法培养的微生物。我们改进后的iChip构建方法简单、成本低廉，并降低了微生物污染的风险，因而易于实现，适用于多种研究目标。我们的iChip实验结果引发了一系列问题，例如：新发现的微生物通过何种机制抑制病原菌？

这些生物活性化合物在真实环境试验中能否保持稳定功效？环境因素如何影响其有效性？回答这些问题将指导生物农药的可持续开发，变革植物病害管理方式，并减少对合成杀菌剂的依赖。

实验室将应用iChip技术，从通过覆盖作物种植获得的抑病土壤中分离新型细菌，以鉴定新型微生物和生物活性化合物。这些微生物和化合物将在受控的植物病害研究中进行测试，以开发创新、可持续的合成杀菌剂替代方案，用于防控农业病害。要使用5毫米琼脂打孔工具构建改良的iChip，需从96孔板上移除各孔的底部。

将0.05微米的聚碳酸酯膜切割成矩形，确保其尺寸与96孔板底部面积相匹配。使用硅酮密封剂将聚碳酸酯膜粘附于96孔板底部。确保粘合剂密封各孔，但不完全覆盖孔口的开口。

将平板静置干燥24小时。向标记为A至D的每个15毫升离心管以及标记为E至H的每个50毫升离心管中加入4.5毫升无菌水。取1克土壤加入一个50毫升离心管中，然后向管中加入10毫升水，并将混合物涡旋振荡10分钟。

将土壤悬液静置10分钟。然后，用移液器吸取0.5毫升上清液加入A管中，并充分混匀。接着，将0.5毫升A管中的细胞悬液转移至B管，并充分混匀。

对所有剩余的离心管重复上述操作，在8个试管中完成一系列十倍稀释。开始时，将iChips完全浸入95%乙醇中。15分钟后，从乙醇中取出平板，置于超净工作台内的无菌纸巾上。

开启超净工作台内的紫外灭菌灯照射15分钟，同时让乙醇自然挥发。用移液器将360微升无菌的琥珀酸盐最低盐（SMS）培养基加入到培养板的第一列中，作为对照。向E管的细胞悬液中加入45毫升SMS培养基。充分混匀，使细胞悬液与琼脂混合均匀。

将琼脂细胞混合物用移液器吸取360微升，加入96孔板其余所有孔中。待培养基凝固后，用PCR板盖密封板的顶部。使用F、G和H管中的溶液填充各板，共制备四块浓度呈十倍递增差异的板。

将平板放入含有约1英寸深土壤的容器中，膜面朝下。将平板置于加盖容器内，在25摄氏度避光条件下培养。六周后，观察iChips上的微生物生长情况。

用无菌水将改良的iChip冲洗三次，以去除所有土壤颗粒。用95%乙醇擦拭平板的顶部和侧面，避免接触带有半透膜的一侧。使用无菌刀片，沿含有菌落的孔周围切割平板盖，然后用无菌镊子取出该方块。

使用无菌划线工具刺穿菌落，并采用四区划线法在SMS琼脂平板上进行划线。将平板置于25摄氏度培养一周，或直至观察到菌落生长。培养结束后，观察菌落以确认培养物的分离。